Summary
O presente protocolo descreve as etapas de purificação e estudos subsequentes de quatro diferentes β-glucanos fúngicos como potenciais moléculas imunomoduladoras que aumentam as propriedades antitumorais da micróglia contra células de glioblastoma.
Abstract
Um dos maiores desafios no desenvolvimento de terapias eficazes contra o glioblastoma é superar a forte supressão imunológica dentro do microambiente tumoral. A imunoterapia tem emergido como uma estratégia eficaz para transformar a resposta do sistema imune contra as células tumorais. Macrófagos e micróglias associados à glioma (MAGs) são os principais impulsionadores desses cenários anti-inflamatórios. Portanto, aumentar a resposta anticancerosa em MAGs pode representar uma terapia coadjuvante potencial para tratar pacientes com glioblastoma. Nessa linha, as moléculas fúngicas de β-glucano têm sido conhecidas há muito tempo como potentes moduladores imunológicos. Sua capacidade de estimular a atividade imune inata e melhorar a resposta ao tratamento tem sido descrita. Essas características moduladoras são parcialmente atribuídas à sua capacidade de se ligar a receptores de reconhecimento de padrões, que, curiosamente, são muito expressos em GAMs. Assim, este trabalho está focado no isolamento, purificação e subsequente uso de β-glucanas fúngicas para aumentar a resposta tumoricida da microglia contra células de glioblastoma. As linhagens celulares de glioblastoma de camundongo (GL261) e microglia (BV-2) são usadas para testar as propriedades imunomoduladoras de quatro diferentes β-glucanas fúngicas extraídas de cogumelos fortemente utilizados na indústria biofarmacêutica atual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Para testar esses compostos, ensaios de co-estimulação foram realizados para medir o efeito de um meio pré-ativado condicionado por microglia sobre a proliferação e ativação da apoptose em células de glioblastoma.
Introduction
Apesar do advento de novas conquistas no campo da neuro-oncologia, a expectativa de vida dos pacientes com glioblastoma permanece escassa. As terapias padrão-ouro contra tumores cerebrais são baseadas na fusão de cirurgia, radioterapia e quimioterapia. No entanto, na última década, a imunoterapia emergiu como uma poderosa estratégia para o tratamento de diferentes tipos decâncer1. Assim, a possibilidade de aproveitar a resposta imune do organismo contra as células tumorais tornou-se recentemente o quarto pilar da oncologia.
Há muito se sabe que um dos maiores desafios na área é superar a forte imunossupressão encontrada no microambientetumoral2. Particularmente, no caso do glioblastoma, uma das formas mais comuns e agressivas de câncer cerebral, desvendar caminhos-chave que orquestram tais cenários pró-tumorais e encontrar novos compostos que poderiam neutralizar a resposta depressiva do sistema imunológico pode abrir caminho para futuras terapias contra essa doença incurável.
O cérebro possui suas próprias células do sistema imunológico, e o tipo de célula mais relevante são a microglia. Comprovadamente, essas células têm um comportamento bastante complexo em diferentes doençascentrais3. No caso de tumores cerebrais primários (por exemplo, glioblastoma), essas células são deslocadas para um fenótipo anti-inflamatório que suporta as células tumorais para colonizar o parênquima cerebral3. Inúmeras publicações têm reforçado o papel importante dessas células durante a progressão tumoral. Uma das principais razões para isso é que a micróglia associada ao glioma e os macrófagos infiltrados (MAGs) respondem por um terço da massa tumoral total, sugerindo a influência inequívoca de seus estados de ativação durante a progressão do tumor cerebral 4,5.
Nesse sentido, os β-glucanos fúngicos têm sido descritos como moléculas potentes que desencadeiam respostas imunes efetivas, incluindo fagocitose e produção de fatores pró-inflamatórios, levando à eliminação de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Os β-glucanos fúngicos têm sido geralmente estudados usando extratos de diferentes partes do cogumelo. Entretanto, a atribuição de efeitos específicos requer sua purificação para evitar ambiguidades e poder compreender o mecanismo de ação de tais moléculas como agentes imunomoduladores8.
Neste trabalho, β-glucanas solúveis são purificadas do corpo frutífero de quatro diferentes cogumelos, regularmente empregados como cogumelos comestíveis (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinais (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). Em particular, estes quatro cogumelos têm uma grande utilização na indústria alimentar e farmacêutica e foram produzidos no âmbito de uma economia circular ecológica numa empresa comercial (ver Tabela de Materiais).
A fim de estabelecer as bases para o uso futuro de β-glucanas fúngicas em terapias de câncer cerebral, estratégias de purificação bem definidas e estudos pré-clínicos que se aprofundam em sua interação putativa com células do sistema imunológico são essenciais para avaliar seu papel potencial como mediadores antitumorais. Este trabalho descreve as inúmeras etapas de isolamento e purificação necessárias para recuperar os β-glucanos solúveis contidos nos corpos frutíferos do cogumelo selecionado. Uma vez purificadas com sucesso, as células da microglia são ativadas para melhorar seu fenótipo inflamatório. Células de glioblastoma de camundongo (GL261) são revestidas com um meio diferente condicionado por microglia, previamente tratado com esses extratos, e então seu efeito sobre o comportamento das células tumorais é avaliado. Curiosamente, estudos piloto de nosso laboratório (dados não mostrados) descobriram como a microglia pró-inflamatória pode retardar a migração de células tumorais e as propriedades de invasão não apenas em células de glioblastoma, mas também em outras linhagens de células cancerosas. Este trabalho multidisciplinar pode fornecer uma ferramenta útil para pesquisadores de oncologia testarem compostos promissores capazes de aumentar a resposta imune em muitos tipos diferentes de tumores.
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Protocol
As quatro diferentes variantes de cogumelos descritas neste protocolo foram obtidas de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Isolamento de β-glucanas fúngicas
- Extração e isolamento de polissacarídeos solúveis de cogumelos
OBS: Polissacarídeos solúveis de cogumelos (SMPs) foram obtidos de acordo com o procedimento esquematicamente mostrado na Figura 1.- Enxaguar suavemente os corpos frutíferos frescos de P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum (cerca de 2.000 g/cogumelo) em água destilada cinco vezes.
- Secar os corpos frutíferos a 50 ± 2 °C numa estufa convencional de secagem ao ar até atingir um peso constante (~24 h).
- Moer os cogumelos secos em um moinho de lâminas, obtendo cerca de 200 g de pó de cada cogumelo.
- Suspender 100 g de pó de cogumelo (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum) em 1.000 mL de H2Od. Em seguida, autoclave a 121 °C por 15 min e, finalmente, deixar em temperatura ambiente por 30 min.
- Centrifugar a suspensão resultante a 6.000 x g durante 10 min a 4 °C.
- Secar o precipitado contendo polissacarídeos insolúveis de cogumelos (PIM) a 50 ± 2 °C numa estufa de secagem ao ar durante 24 horas.
- Descarte o precipitado e mantenha o sobrenadante. Concentrar o sobrenadante 10 vezes em um evaporador rotativo.
- Precipitar o concentrado contendo SMPs com etanol (concentração final de 80%) a 4 °C durante a noite.
- Centrifugar a suspensão de etanol a 6.000 x g por 15 min a 4 °C, reter o pellet (precipitado) e descartar o sobrenadante com uma pipeta.
- Lavar o precipitado três vezes com etanol a 80% antes de dissolvê-lo em H2Od (10% p/v). Ajustar o pH para 6,5/7 e a temperatura para 37 °C e tratar com 2 u e 4 U de α-amilase e glucoamilase, respectivamente, para solubilizar α-glucanas seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
- Após o tratamento com α-amilase/glucoamilase, ajustar o pH e a temperatura para 8,0 e 50 °C, respectivamente, e tratar com alcalase (2,5 U/g de proteína) (ver Tabela de Materiais) para solubilizar as proteínas.
NOTA: Este tratamento enzimático sequencial remove a maioria dos α-glucanos e proteínas que co-precipitam com β-glucanos na precipitação de etanol. - Após hidrólise, centrifugar o hidrolisado a 6.000 x g por 15 min a 4 °C e o sobrenadante limpo concentrado cinco vezes em evaporador rotativo. Precipitar novamente com etanol 80%.
- Solubilizar o precipitado resultante em H2Od e dialisar em água destilada por 24 h usando membranas de tubos de celulose (membranas de corte de 12.000 Da; ver Tabela de Materiais) para remover moléculas de baixo peso molecular. Recuperar a porção solúvel em água e liofilizá-la para produzir β-glucanas solúveis (SβGs).
- Medição de açúcar e proteína
- Medir o teor de açúcares totais de cada fração pelo método fenol-ácido sulfúrico, utilizando glicose como padrão8.
NOTA: A quantificação do teor de β-glucana também pode ser feita usando o kit de ensaio de β-glucana (cogumelo e levedura; ver Tabela de Materiais), com base na hidrólise enzimática e na atividade das oxidorredutases: exo-1,3-β-glucanase, glicose oxidase, β-glucosidase e peroxidase, com a subsequente formação da quinoneimina. Siga as instruções do fabricante, com pequenas modificações. - Use 18 MH 2 SO4 em vez de 12 MH2SO4.
- Avaliar o teor de glucanas totais e α-glucanas separadamente.
- Meça os valores de β-glucano resultantes como a diferença entre os valores totais de glucano e α-glucano (triplicata) seguindo o protocolo de Kjeldahl. Em certos casos, o teor de proteína pode ser determinado pelo método de Lowry, utilizando-se a albumina para traçar a curva de calibração11,12.
- Medir o teor de açúcares totais de cada fração pelo método fenol-ácido sulfúrico, utilizando glicose como padrão8.
- Análise por espectroscopia de absorção no ultravioleta
- Obter os espectros ultravioleta (UV) de SβG usando um espectrofotômetro UV-visível (ver Tabela de Materiais) escaneando as amostras na região de 200-400 nm (Figura 2).
- Preparar 1,0 mg/mL de cada SβG em H2Od, transferir a solução para uma cubeta de quartzo e escanear à temperatura ambiente.
- Análise da distribuição de peso molecular
- Estimar a homoegeneidade de SβGs e a massa molecular de polímeros por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) usando um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (ver Tabela de Materiais) equipado com um detector de índice de refração e uma coluna de filtração linear em gel ultra-hidrogel (300 mm x 7,8 mm; Gráfico 3).
- Realizar o ensaio a 40 °C usando água deionizada como eluente a uma vazão de 0,5 mL/min-1 e dextrans (110, 80 e 50 kDa) como padrões (ver Tabela de Materiais). Coletar uma fração de 5 mL.
- Análise de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
- Registre os espectros no infravermelho (Figura 4) em um espectrômetro FTIR na faixa de 4000-500 cm-1. As amostras devem ser previamente misturadas com KBr para formar filmes (procedimento FTIR padrão; consulte as instruções do fabricante e Tabela de Materiais).
- Análise da composição molecular
- Estimar as composições moleculares de SβGs por cromatografia em camada delgada de alta eficiência (HPTLC) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS), seguindo procedimentos padrão12.
2. Estudo in vitro da estimulação da microglia induzida por β-glucanos
- Cultura celular de células de glioblastoma e microglia de camundongos em lâminas de câmara de 8 poços
NOTA: Este protocolo é específico para linhagens celulares GL261 (glioblastoma) e BV2 (microglia). No entanto, com pequenas modificações, essas etapas poderiam potencialmente ser usadas para estudar outras linhagens de células cancerígenas e imunes.- Preparar meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) modificado com L-glutamina, 4,5 g/L D-glicose e sem piruvato. Adicionar 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Pré-aqueça o material em banho-maria a 37 °C por 15 min.
- Descongelar alíquotas BV2 e GL261 congeladas em banho-maria (37 °C) por 2 min e, pouco antes de descongelar completamente, transportá-las para uma capela de fluxo laminar e plaquear as células em dois frascos T25 estéreis diferentes (um para cada linhagem celular).
- Incubar os frascos T25 a 37 °C, 5% CO2 até que a cultura seja confluente.
NOTA: Dependendo das condições de congelamento e do tempo de criopreservação, o tempo até a confluência pode variar. Essas linhagens celulares geralmente necessitam entre 3 a 5 dias para atingir a confluência em um frasco T75. - Depois que a cultura de células BV2 se tornar confluente, transfira-a para lâminas de câmara de 8 poços 0,6 x 106 células/poço. Mantenha as corrediças da câmara de 8 poços na incubadora por 24 horas.
- Uma vez que as células da microglia são plaqueadas nas lâminas da câmara de 8 poços, repita o mesmo protocolo com as células GL261.
- Ativação da microglia com β-glucanas
- Revestir as células BV2 com quatro diferentes β-glucanas (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus) na concentração de 0,2 mg/mL por 72 h. Uma condição experimental deve permanecer sem tratamento (meio normal), atuando como grupo controle.
- Recolher o sobrenadante com uma pipeta após 72 h e passar o volume restante através de um filtro de seringa de 0,20 μm. Em seguida, congelar o sobrenadante a -80 °C por pelo menos 24 h.
- Tratamento do GL261 com meio pré-ativado condicionado por microglia
- Uma vez que o GL261 esteja 80% confluente dentro das lâminas da câmara de 8 poços, adicionar meio microglial tratado com β-glucano (passo 2.2.2) a uma concentração de volume final de 25% por 72 h (volume total: 250 μl/poço).
- Retire o meio após 72 h de incubação e descarte-o.
- Lavar as células com tampão fosfato salino (PBS; pH 7,4, 0,1 M) três vezes por 5 minutos.
- Fixar as células adicionando 200 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 °C durante 15 minutos.
NOTA: Dependendo dos diferentes anticorpos que podem ser usados para imunofluorescência, os métodos de fixação podem diferir dos PFA típicos de 4%. Os fixadores à base de álcool podem ser mais eficientes na preservação de certos epítopos.
- Estudo de imunofluorescência
- Lavar as amostras com PBS com triton X (PBST; 0,01%) por 10 min três vezes.
- Retirar o PBST e adicionar tampão de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 10% em PBST (Tabela 1) por 30 min à temperatura ambiente.
- Remover o tampão de bloqueio e adicionar 200 μL por poço de PBS contendo a mistura de anticorpos primários (1:500 anticorpo monoclonal Ki-67 de rato e 1:500 anticorpo caspase-3 clivado de coelho; ver Tabela de Materiais). Incubar durante a noite a 4 °C.
- Após 24 h de incubação a 4 °C, deixar as amostras à temperatura ambiente durante 30 min.
- Lave os poços três vezes por 10 min com PBS em um agitador (baixa velocidade).
- Remova o PBS e substitua por 200 μL por poço de PBS contendo a mistura de anticorpos secundários (1:200 anti-rato anti-rato IgG (H + L) anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488 e 1:200 burro anti-coelho IgG (H + L) anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 647; ver Tabela de Materiais) por 45 min à temperatura ambiente no escuro.
- Lave as amostras com PBS por 10 min em um agitador multiuso.
- Retirar o PBS e adicionar 200 μL por poço de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluído em PBS (1:5.000) por 1 min.
- Remova o DAPI (ver Tabela de materiais) e lave as células por 5 minutos em PBS.
- Retire a estrutura do poço e adicione 50 μL de PBS:glicerol (1:1) em cada poço e cubra com uma lamínula.
- Sele as lâminas com esmalte.
- Adquira imagens a 20x usando um sistema de microscópio confocal (ver Tabela de materiais).
3. Quantificação e análise da proliferação celular tumoral e apoptose
NOTA: Para medir o efeito potencial dos diferentes β-glucanos sobre a proliferação celular tumoral e apoptose, um script in house foi utilizado no software ImageJ para quantificar o número de pixels positivos de Ki67 (proliferação) e cCasp3 (apoptose)13.
- Abra o ImageJ. Clique no botão Plugins . Clique em Coloc2, um plugin previamente instalado na pasta do plugin, e finalmente selecione a imagem para analisar11.
NOTA: Este plugin foi disponibilizado após contato anterior com o Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). Em vez do script, tanto o software ImageJ quanto o Fiji têm ferramentas diferentes para análise de colocalização (veja Tabela de materiais), com propriedades semelhantes. - Defina limiares de acordo com as condições de controle (não tratadas, somente DMEM). Clique no botão OK .
NOTA: Para evitar discrepâncias de fundo e intensidade, todas as imagens devem ser tiradas nas mesmas condições. Preferencialmente, as sessões de imagem devem ser realizadas no mesmo dia, e os parâmetros microscópicos inalterados entre as imagens. - Certifique-se de que as imagens resultantes dos pixels colocalizados e uma janela de resumo que forneça a porcentagem ou o número bruto de pixels acima do limite sejam exibidas. Normalizar os resultados com relação às condições de controle (não tratadas).
NOTA: Todos os dados são dados como média ± MEV. A análise estatística foi realizada por meio de gráficos e softwares de análise (ver Tabela de Materiais). Utilizou-se ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Tukey. Os erros são representados como erro padrão da média (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).
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Representative Results
Purificação bem sucedida de β-glucanas
A massa de MP, SMPs e SβGs obtida dos corpos frutíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus após o processo de extração e purificação está resumida na Tabela 1. A composição básica (carboidratos totais, β-glucanos e proteínas) de MP, SMPs e SβGs obtidos dos fungos está representada na Tabela 2. Esses resultados mostram como o protocolo permitiu a recuperação de uma grande quantidade de proteína em SMPs. Entretanto, o tratamento enzimático com α-amilase/glicoamilase e protease reduziu a quantidade de proteína e aumentou a concentração de β-glucana.
Os espectros UV dos diferentes SβGs não mostraram picos de absorção de UV em 260 e 280 nm (Figura 2A), indicando que os SβGs não possuíam ácidos nucléicos (260 nm) e proteínas (280 nm). Além disso, a homogeneidade dos SβGs foi testada por espectroeletroquímica de absorção UV-visível (SEC). Os cromatogramas (Figura 3) apresentaram boa homogeneidade, com pico principal e único em 8,20, 10,5, 10,9 e 11,3 min para H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus e P. djamor, respectivamente. Estes dados sugerem que a fração é consistente com homopolímeros. Além disso, a média ponderal de Mw foi calculada em torno de 120,8, 92,8, 80,7 e 75,9 kDa para H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus e P. djamor, respectivamente, de acordo com a equação da curva de calibração (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
Os espectros de FTIR mediram vibrações moleculares que correspondiam a ligações polissacarídicas covalentes (Figura 4). Os espectros exibiram um amplo e intenso grupo hidroxila em torno de 3.435 cm-1. Mostrou também um fraco pico de estiramento C-H, em torno de 2.922 cm-1, correspondendo a polissacarídeos14. Além disso, a absorbância em torno de 1.641 cm-1 pode ser atribuída à amida I15, relacionada às vibrações de alongamento dos grupos C=O e CN. O sinal em torno de 1.154 cm-1 pode ser devido ao estiramento assimétrico da ligação glicosídica C-O-C 16. Finalmente, a faixa em torno de 1.072 cm-1 indicou estiramento C-O de β-glucanas16. A fraca absorção próxima a 893 cm-1 pode ser devida à vibração refrativa assimétrica da β-piranose , mostrando a configuração β das unidades de açúcar17. Em geral, SβGs foram encontrados para consistir principalmente de carboidratos conjugados com uma quantidade mínima de proteína.
O perfil de monossacarídeos de SβGs foi estudado por HPTLC e GC-MS. Foi confirmada a presença de grande quantidade de D-glicose com menores quantidades de D-galactose e D-manose e traço de D-xilose, D-ramnose, D-fucose e L-arabinose. A Tabela 3 resume os resultados obtidos para SβGs de H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus e P. djamor.
Meio condicionado por microglia, pré-ativado com β-glucano, induziu apoptose em células cancerosas
Uma vez que β-glucanas dos cogumelos selecionados foram isoladas com sucesso e totalmente caracterizadas, elas foram adicionadas à cultura celular da micróglia (BV2). 72 h após a adição do meio condicionado por microglia às células GL261 (Figura 5), a expressão de dois marcadores-chave para proliferação (Ki67) e apoptose (caspase clivada 3 [cCasp3]) foi medida por imunofluorescência. Usando um script interno no software ImageJ, o número de pixels positivos para cada canal fluorescente foi quantificado e, assim, a maneira pela qual o efeito potencial da ativação microglial induzida por β-glucanos pode afetar o comportamento das células tumorais foi analisado. Utilizando amostras controle como limiar para a intensidade de cada fluoróforo, o script forneceu o número de pixels e, assim, indicou a expressão para cada marcador após as diferentes condições experimentais (Figura 6).
Curiosamente, o GL261 não sofreu diferença significativa em relação à proliferação tumoral uma vez exposto aos diferentes meios condicionados pela micróglia (Figura 7). Entretanto, P. djamor (B) e H. erinaceus (C) apresentaram forte indução (aumento de aproximadamente seis e nove vezes, respectivamente) de cCasp3.
Figura 1: Protocolo de isolamento. Esquema do protocolo para isolar e purificar a preparação de SβG de P. streatus, P. djamor, H. erinaceus e G. lucidum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Espectros UV de β-glucanas. Espectros UV na região de 200-400 nm de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor e (D) H. erinaceus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cromatogramas de exclusão de tamanho. Cromatogramas de exclusão de tamanho de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor e (D) H. erinaceus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Espectros FTIR. Espectros no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) de (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor e (D) H. erinaceus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Esquema dos ensaios de co-estimulação. Ensaio de co-estimulação onde células da microglia de camundongo (BV2) foram revestidas por 72 h com β-glucanas. Após ser criopreservado e filtrado, o sobrenadante foi coletado e transferido para cultura celular GL261 (25%) por 72 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagens de proliferação e apoptose. Imagens de imunofluorescência mostrando uma colocalização tripla de GL261 com DAPI (azul), Ki67 (verde) e cCasp3 (vermelho). O script 'Prob Coloc' (imagens inferiores) permitiu quantificar o número de pixels positivos de cada marcador e a colocalização entre eles. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Quantificação das taxas de proliferação e apoptose. Valores normalizados em relação às condições de controle (DMEM) da expressão de Ki67 (esquerda) e cCasp3 (direita) em células GL261 após a exposição ao meio condicionado por microglia. (A) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Os erros são representados como s.e.m. (*p < 0,05, **p < 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| MP (g) | PMS (g) | SβGs (g) | |
| P. ostreatus | 201,3 ± 2,2 | 14,4 ± 0,9 (7,1%) | 5,3 ± 0,2 (2,6%) |
| P. djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7%) | 4,9 ± 0,3 (2,4%) |
| G. lúcido | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3%) | 5,5 ± 0,2 (2,7%) |
| H. erinaceus | 204.2 ± 1.2 | 15,4 ± 0,8 (7,5%) | 5,7 ± 0,2 (2,8%) |
Tabela 1: Tabela de teor de glucanas. Balanço de massa para obtenção de MP, SMPs e SβGs de corpos frutíferos de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus.
| PARLAMENTAR | SMPs | SβGs | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-Glucana (%) | 22,7 ± 1,4 | 31,3 ± 2,4 | 89,4 ± 2,3 |
| Proteína (%) | 21,5±0,9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68.3 ± 2.1 | 61.4 ± 3.1 | 93,4 ± 1,1 | |
| P. djamor | β-Glucana (%) | 24.3 ± 2.8 | 30,8 ± 3,5 | 91,3 ± 3,4 |
| Proteína (%) | 19,9 ± 1,0 | 22,3 ± 1,1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lúcido | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-Glucana (%) | 22,5 ± 1,9 | 24.9 ± 3.1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Proteína (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-Glucana (%) | 23,9 ± 1,6 | 35,9 ± 2,1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Proteína (%) | 17.6 ± 1.3 | 22,7 ± 1,8* | 1,3 ± 0,2* |
Tabela 2: Carboidratos totais. Peso seco (g) dos carboidratos totais (CHt), β-glucano e proteína de MP, SMPs e SβGs. Teor de proteína (PM) quantificado pelo método de Kjeldah12. (*, proteínas quantificadas pelo método de Lowry9).
| D-Gluc (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Xilo (%) | D-Rham (%) | L-Árabe (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,2 | 0.3 ± 0.1 | s.d |
| G. lúcido | 94,3 ± 0,8 | 2.6 ± 0.2 | 1.9 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 | 0,9 ± 0,2 | s.d. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4.4 ± 0.1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | s.d. | s.d. | s.d. |
| P. djamor | 95,2 ± 0,7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0.3 ± 0.1 | s.d. | s.d. | s.d. |
Tabela 3: Caracterização dos monossacarídeos. Perfil de monossacarídeos de SβGs de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus (s.d., alguns monossacarídeos foram indetectáveis).
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Discussion
Este trabalho descreve o uso de técnicas bem estabelecidas para isolar, purificar e caracterizar com sucesso o conteúdo de SβGs de quatro fungos diferentes. Os resultados mostraram como após a extração em água quente das SMPs, obtidas de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguida de tratamento hidrolítico com α-amilase, glucosidase e protease, os teores de α-glucana e proteína foram reduzidos, enriquecendo significativamente a quantidade de SβGs puros.
Apesar disso, observamos que a maioria dos β-glucanos fúngicos foram insolúveis em água durante o processo de purificação. O principal interesse do estudo foram os SβGs, devido às suas propriedades médico-farmacêuticas10,18. Além disso, graças ao processamento hidrolítico, precipitação de etanol e diálise, carboidratos solúveis de baixo peso molecular, peptídeos, oligopeptídeos e aminoácidos foram removidos com sucesso das SMPs, mostrando uma eficiência semelhante a outros trabalhos anteriores usando um tipo diferente de cogumelo, mas com processos semelhantes19,20.
Para testar a pureza de SβGs, os espectros UV dos diferentes SβGs foram investigados por espectrofotometria UV, varrendo as amostras na região de 200-400 nm. Não foram observados picos de absorção de UV em 260 e 280 nm, indicando que os SβGs não tinham ácidos nucléicos (260 nm) nem proteínas (280 nm), mostrando novamente que os β-glucanos constituíam principalmente os SβGs. Embora os espectros UV na região de 200-400 nm mostrassem a ausência de qualquer captador definido/agudo em 280 nm, um pequeno pico ainda pôde ser observado. Isso poderia ser explicado pela presença de uma pequena quantidade de proteínas ligadas ao polissacarídeo, concordando com os resultados apresentados na Tabela 2. No entanto, é interessante considerar que essa quantidade insignificante de polissacarídeos também poderia ser explicada pelo acesso tardio às proteínas remanescentes, que podem ser protegidas por glucanas ou por efeitos estéricos que impedem a degradação completa das proteínas ligadas ao glucano. É importante ressaltar que a homogeneidade dos SβGs foi testada por SEC, uma poderosa técnica analítica usada para purificar moléculas dissolvidas por tamanho, o que confirmou os resultados do protocolo.
Adicionalmente, espectros de FTIR foram usados para medir vibrações moleculares correspondentes a ligações polissacarídicas covalentes. Como descrito anteriormente, espectros semelhantes foram obtidos para os quatro fungos. A característica dos espectros exibiu a presença de polissacarídeos14, amida I 15 e β-glucanos16. A fraca absorção próxima a 893 cm-1 sugere a configuração β das unidades de açúcar17. Em geral, os SβGs foram formados principalmente por carboidratos conjugados com proteína mínima. Em relação ao interesse em utilizar SβGs como moléculas imunomoduladoras, vale ressaltar que complexos polissacarídeos-proteínas são frequentemente notados por seus benefíciosimunomoduladores21.
Finalmente, o perfil de monossacarídeos de SβGs foi estudado por HPTLC e GC-MS. A presença de uma grande quantidade de D-glicose com menores quantidades de D-galactose e D-manose e traços de D-xilose, D-ramnose e D-fucose implica estritamente que o componente predominante em SβGs é β-glucano. No entanto, é importante esclarecer que nosso sistema de purificação resulta da otimização de diferentes procedimentos clássicos. Atualmente estamos trabalhando no aprimoramento de várias etapas, principalmente focadas em técnicas de cromatografia (exclusão de tamanho e cromatografia de troca iônica).
Em relação ao objetivo principal deste trabalho, que foi testar o impacto das β-glucanas sobre as células imunes, uma vez que os quatro diferentes tipos de β-glucanas foram purificados com sucesso, seus efeitos potenciais na ativação da micróglia foram testados. A imunofluorescência foi utilizada contra dois marcadores padrão-ouro de proliferação e apoptose22,23.
Apesar de não haver diferenças estatísticas nas taxas de proliferação tumoral, P. ostreatus (A) e H. erinaceus (C) foram capazes de reduzir a expressão do Ki67 em até 50%. A falta de significância provavelmente se deve à alta variância do estudo em relação ao G. lucidum. Além disso, a indução de apoptose em células cancerosas é uma abordagem terapêutica bastante interessante, e P. djamor (B) e H. erinaceus (C) mostraram uma indução significativa dos níveis de cCasp3, sugerindo a ativação do programa de morte celular. Todos esses resultados estão de acordo com estudos prévios que mostraram o efeito antitumoral desses fungos em outros tipos detumores24,25. Os experimentos foram realizados em duplicata, mantendo as mesmas condições e conduzidos pelos mesmos pesquisadores. A análise baseada em software dos resultados dos estudos de imunofluorescência apoia uma abordagem imparcial e aumenta o alcance potencial deste estudo.
Em geral, esses estudos têm como principal desafio o uso do β-glucano, que é a pureza dos compostos. É obrigatório seguir os mais altos padrões para confirmar que os efeitos observados, após seu uso em estudos imunológicos, são exclusivamente provocados pelos carboidratos, e não devido a proteínas ou outras estruturas que podem permanecer ligadas a eles se a purificação não for realizada adequadamente. Um passo extra que pode ser considerado em estudos futuros é o uso de técnicas de cromatografia (por exemplo, troca iônica ou exclusão de tamanho).
A conclusão geral após os estudos coloca H. erinaceus como o principal candidato como uma opção imunoterapêutica potencial para o tratamento do glioblastoma, devido à sua capacidade de diminuir a proliferação tumoral (~50%) e induzir forte ativação do programa de morte celular em células de glioblastoma.
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Disclosures
Não há interesses concorrentes a declarar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à Dra. Vasiliki Economopoulos por seu script interno para medir o sinal de fuluorescência no ImageJ. Gostaríamos também de agradecer ao CITIUS (Universidade de Sevilha) e a todo o seu pessoal pelo apoio durante a manifestação. Este trabalho foi apoiado pelo espanhol FEDER I + D + i-USE, US-1264152 da Universidade de Sevilha, e pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
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