Summary
Dit protocol biedt een muismodel van ulceratieve coloproctitis-geassocieerde colorectale kanker geïnduceerd door azomethaan in combinatie met dextraansulfaatnatrium. Het model werd gebruikt om de werkzaamheid van traditionele Chinese geneeswijzen bij de preventie en behandeling van colorectale kanker te evalueren.
Abstract
Colorectale kanker (CRC) is een veel voorkomende maligniteit van het spijsverteringsstelsel en is wereldwijd de derde meest voorkomende maligniteit geworden en de tweede belangrijkste doodsoorzaak als gevolg van maligniteit. Ulceratieve coloproctitis (CU) is een precancereuze laesie en UC-geassocieerde CRC (UC-CRC) is het meest voorkomende subtype van CRC. Daarom is een redelijk UC-CRC-model de hoeksteen en garantie voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) wordt veel gebruikt bij de behandeling van UC-CRC vanwege de goede werkzaamheid. Als een klassiek tonicum voorschrift van TCM, is Liujunzi afkooksel (LJZD) veel gebruikt bij de behandeling van UC-CRC. In deze studie werd een UC-CRC-model opgesteld door azomethaan en dextraansulfaatnatrium te combineren, en werd de LJZD toegediend. De gegevens bevestigden dat LJZD de overgang naar kanker bij UC-CRC effectief kan remmen door gebruik te maken van het lichaamsgewicht van de muis, de colorectale lengte, pathologische en ontstekingsfactoren, de colorectale barrièrefunctie en kankermarkers. Dit protocol biedt een systeem voor het evalueren van de werkzaamheid van TCM bij de preventie en behandeling van UC-CRC.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is een veel voorkomende gastro-intestinale maligniteit, de derde meest voorkomende maligniteit en de op één na meest voorkomende doodsoorzaak ter wereld, goed voor 10% van de wereldwijde kankerincidentie en 9.4% van de totale kankergerelateerde sterfte 1,2. Genetische factoren, chronische ontstekingen, vetrijke voeding, diabetes en abnormale darmflora zijn risicofactoren voor CRC 3,4. Onder hen is inflammatoire darmziekte, met name ulceratieve coloproctitis (CU), een duidelijke risicofactor voor CRC 5,6. UC-geassocieerde CRC (UC-CRC) is een overgangsproces van ontsteking, atypische hyperplasie en kanker op basis van chronische ontsteking van het colorectum, die verschilt van het typische adenoom-adenocarcinoomontwikkelingsmodel van CRC 7,8. Vergeleken met de algemene bevolking is het risico op CRC ongeveer 10-40 keer hoger bij patiënten met inflammatoiredarmaandoeningen9.
Momenteel is chirurgie nog steeds de standaardbehandeling voor CRC, en afhankelijk van de locatie en het stadium van de tumor zijn bestralingstherapie, systemische medicamenteuze therapie of een combinatie van beidemogelijk10. Hoewel deze traditionele behandelingsmodaliteiten grote vooruitgang hebben geboekt, is de prognose vanwege de hoge heterogeniteit en het recidiefpercentage van CRC slecht en is het behandelingseffect niet ideaal11,12. Daarom zijn vroege opsporing, vroege diagnose en uitgebreide behandeling de sleutel tot het verbeteren van de overlevingskans van CRC-patiënten, en het is vooral belangrijk om aandacht te besteden aan de transformatie van CU naar CRC. In de loop der jaren heeft de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) veel aandacht getrokken bij de behandeling van UC-CRC of chronische gastritis vanwege de beperkte bijwerkingen en aanzienlijke werkzaamheid. Op basis van dialectische behandeling hebben beroemde beoefenaars van de Chinese geneeskunde van verschillende generaties een groot aantal klassieke recepten gemaakt, zoals Huangqi Jianzhong afkooksel13, Sijunzi afkooksel14 en Sishen pil15.
Liujunzi afkooksel (LJZD) is ontstaan uit de werken van Yi Xue Zheng Zhuan, samengesteld in de Ming-dynastie en is een klassiek recept in TCM16. Zoals te zien is in tabel 1, bestaat LJZD uit zes traditionele kruiden, waaronder Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Poria cocos (Schw.) Wolf (Fuling), Atractylodes macrocephala Koidz. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Gancao), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) en Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), dat het effect heeft van het aanvullen van qi en het versterken van de milt, het drogen van vocht en het oplossen van slijm. In de moderne klinische praktijk wordt het vaak gebruikt voor de behandeling van chronische gastritis, maagzweren en zweren in de twaalfvingerige darm. Modern farmacologisch onderzoek heeft aangetoond dat LJZD en gemodificeerde LJZD een hoge toepassingswaarde hebben bij de adjuvante behandeling van CU en kanker van het spijsverteringskanaal 17,18,19.
Op dit moment zijn er veel manieren om UC-CRC-muismodellen te construeren, maar het door azoxymethaan (AOM)/dextraansulfaatnatrium (DSS) geïnduceerde muismodel is het meest gebruikte UC-CRC-model; de klinische symptomen, morfologische en pathologische observaties hebben aangetoond dat het model sterk lijkt op menselijke UC-CRC20,21. Het basisprincipe is om eerst carcinogenese te induceren met chemisch carcinogeen AOM en vervolgens muizen continu bloot te stellen aan de inflammatoire stimulatieomgeving van DSS om de continue schade en reparatie van het darmslijmvliesepitheel te simuleren, waardoor een UC-CRC-muismodel wordt geconstrueerd22. Het doel van deze studie is om een muismodel van UC-CRC op te stellen door intraperitoneale injectie van AOM en cyclische stimulatie van DSS op korte termijn en om het effect van het geneesmiddel en het moleculaire mechanisme van LJZD op UC-CRC te evalueren om een wetenschappelijke basis te bieden voor de behandeling van UC-CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dierproef is goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Changchun University of Chinese Medicine (Recordnummer: 2021214). Specifieke pathogeenvrije C57BL/6J-muizen (8-10 weken, gewicht 18-22 g), mannetjes en vrouwtjes, werden gehuisvest in onafhankelijk geventileerde kooien bij 22 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 65%. De muizen begonnen het experiment na 7 dagen adaptief eten, waarbij ze vrije toegang hadden tot water en voeding.
1. Bereiding van geneesmiddelen
- Voorbereiding van LJZD
OPMERKING: Het gebruikte Chinese medicijn is gekocht bij het Affiliated Hospital van de Changchun University of Chinese Medicine en werd geïdentificeerd als echt Chinees medicijn (zie tabel 1).- Doe Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) in een speciale keramische pot (zie Tabel met materialen). Voeg 1000 ml gedestilleerd water toe en laat het 1 uur weken bij kamertemperatuur (zie figuur 1A).
- Poeder 12 g Vullen tot fijn poeder met een molen en 1 uur weken in 300 ml gedestilleerd water in een andere container bij kamertemperatuur.
- Meng het bovenstaande Chinese medicijn in de gespecialiseerde keramische pot. Kook het mengsel en laat het vervolgens op middelhoog vuur staan tot er nog maar 300 ml afkooksel overblijft. Gebruik medisch gaas om te filteren en bewaar het filtraat bij kamertemperatuur.
- Voeg 1000 ml gedestilleerd water toe en herhaal het bovenstaande afkooksel nog een keer. Filter opnieuw met medisch gaas. Combineer het filtraat en kook het tot er nog maar 150 ml over is.
- Centrifugeer de geconcentreerde vloeistof op 10.000 x g gedurende 5 minuten en concentreer het verkregen supernatans verder tot 30 ml op middelhoog vuur. Breng het laatste concentraat over in een schaal en droog het met een elektrische droogoven tot alleen de opgeloste stof als poeder overblijft.
- Weeg de bovenstaande vaste stof af en los deze op in steriel gedestilleerd water om een oplossing te verkrijgen die 22,85 mg geneesmiddel per 0,2 ml (114,16 mg/ml) bevat, wat de dagelijkse dosering van muizen is.
- Bereiding van 5-aminosalicylzuur
OPMERKING: 5-aminosalicylzuur (5-ASA; zie materiaaltabel) heeft een goed preventief effect op UC-CRC en werd in deze studie als positief medicijn gebruikt23.- Los 64 mg 5-ASA-poeder op in 200 ml steriel gedestilleerd water om 1,82 mg/ml 5-ASA-oplossing te verkrijgen. De dagelijkse dosering voor een enkele muis was 0,2 ml.
- Bereiding van AOM-injectieoplossing
- Voeg 2,5 ml steriel gedestilleerd water toe aan 25 mg AOM-poeder (zie Materiaaltabel) en meng met een vortexmixer (zie Materiaaltabel) tot 10 mg/ml AOM-bouillonoplossing, bewaar bij -20 °C tot gebruik.
- Bereid de AOM-injectieoplossing door de AOM-voorraadoplossing te verdunnen met steriel gedestilleerd water van 10:1 (1 mg/ml).
2. Invoering van het UC-CRC-model
OPMERKING: Het experiment was verdeeld in 4 groepen: controlegroep, modelgroep, LJZD en 5-ASA-groep, 10 muizen in elke groep. Met uitzondering van de controlegroep werden de andere groepen behandeld met AOM en DSS.
- Intraperitoneale injectie van AOM-injectieoplossing
OPMERKING: Na adaptieve voeding gedurende 7 dagen kregen muizen AOM-injectieoplossing (1 mg/ml) via intraperitoneale injectie (zie figuur 1B).- Houd de muis met zijn buik omhoog en de kop iets naar beneden. Pak de huid van de achterkant vast om de buikhuid strakker te maken en prik de huid ongeveer 1 cm rechts van het snijpunt van de wortellijn van beide dijen op de middenbuiklijn met een spuit van 1 ml (zie Materiaaltabel).
- Duw de naald van de spuit van 1 ml tot een afstand van 3-5 mm onder de huid, houd deze evenwijdig aan de middellijn van de buik en steek de naald 0,3-0,5 mm in de buikholte onder een hoek van 45°.
- Nadat de punt door de buikspier is gegaan, voelt de operator een plotseling weerstandsverlies. Trek vervolgens de spuit naar buiten en naar achteren om te zien of er vloeistoflekkage optreedt. Als dit niet het geval is, duw dan de AOM-injectieoplossing langzaam in de muizen met een snelheid van 0,1 ml/10 g.
- Cyclische stimulatie van 2% DSS-oplossing
OPMERKING: Elke AOM-geïnduceerde muis kreeg 500 ml DSS-oplossing in week 3, 6 en 9, en de muizen dronken vrijelijk gedurende deze periode.- Bereid 2% DSS-oplossing door 500 ml steriel gedestilleerd water toe te voegen aan 10 g DSS (zie materiaaltabel). Meng met een vortexmixer en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
- Elke AOM-geïnduceerde muis drinkt 500 ml 2% DSS-oplossing vrijelijk gedurende 7 dagen in week 3, 6 en 9 na AOM-inductie.
3. Medicamenteuze behandeling
OPMERKING: Volwassen mensen hebben 63 g LJZD per dag nodig. Volgens de omrekeningsformule van de experimentele dosis van muizen en menselijke geneesmiddelen, equivalente experimentele dosis voor muizen (mg/kg) = menselijke dosis (mg/kg)/lichaamsgewicht (60 kg) x 9,1, was de dagelijkse dosis van muizen ongeveer 9,6 g/kg.
- Behandel de LJZD- en 5-ASA-groep met 0,1 ml/10 g van de bereide LJZD- en 5-ASA-oplossing via een maagsonde in respectievelijk week 7 en week 15.
- Voer voor intragastrische toediening bij muizen de volgende procedure uit. Houd de muis in de linkerhand en houd in de rechterhand het maagperfusieapparaat vast. Steek de naald van de spuit in de mond en schuif deze langs de achterwand van de keelholte van de muizen naar beneden. Glijd langs de keelholte naar beneden terwijl de muizen slikken en blijf vooruit gaan. Wanneer er een gevoel van weerstand was en de spuit in de keelholte kon worden geduwd, trekt u de naald eruit en voltooit u de injectie.
- Behandel de controle- en modelgroep met dezelfde hoeveelheid zoutoplossing (zie Materiaaltabel).
- Behandel de muizen in elke groep eenmaal per dag op hetzelfde tijdstip tijdens de toedieningsperiode met het juiste medicijn.
4. Evaluatie van het UC-CRC-model en de werkzaamheid van LJZD
- Indexscore ziekteactiviteit
OPMERKING: Volgens tabel 2 werd de score van de ziekteactiviteitsindex (DAI) geëvalueerd door gewichtsverlies, fecale viscositeit en ontlastingsbloeding van de muizen te combineren.- Noteer dagelijks het gewicht van de muizen vanaf het begin van adaptieve voeding tot het einde van de medicamenteuze behandeling.
- Observeer zorgvuldig de fecale consistentie van elke experimentele muis en noteer de stoelgang als een van de drie aandoeningen: normale, dunne ontlasting en waterige diarree.
- Noteer de fecale bloeding van proefdieren als een van de drie aandoeningen: geen bloeding, weinig bloeding en zichtbaar bloed in de ontlasting.
- Detectie van IL-6-niveau in serum
- Behandel muizen met LJZD of 5-ASA gedurende 9 weken. Fixeer de muizen door met de linkerhand de nekhuid van de muis vast te pakken en zachtjes op de experimentele tafel te drukken om de laterale decubituspositie in te nemen. Knip de snorharen van de muizen af met een schaar. Knip de snorharen van de muizen voorzichtig af met een schaar (zie Materiaaltabel) om bloedbesmetting te voorkomen.
OPMERKING: Muizen die niet vrij konden wiebelen, werden geacht correct te zijn gefixeerd. Als dit niet gebeurt, moeten de muizen worden gerepareerd. - Verdoof de muis door inademing van 2% isofluraan. Steriliseer de huid rond de oogbol met ethanol (zie Tabel met materialen). Druk zachtjes op de ooghuid aan de zijkant om de oogbol verstopt en uitpuilend te maken.
- Klem de oogbol vast met een elleboogpincet en verwijder de oogbollen nauwkeurig en snel. Laat het bloed in de centrifugaalbuis druppelen (zie Tabel met materialen). Tik daarbij op het hart van de muis om de bloedafname te versnellen.
- Bewaar het afgenomen bloed gedurende 30 minuten op kamertemperatuur en centrifugeer het gedurende 10 minuten op 3.500 x g . Verzamel het supernatans en detecteer het IL-6-niveau volgens de instructies van de IL-6-inhoudsdetectiekit (zie Materiaaltabel).
- Behandel muizen met LJZD of 5-ASA gedurende 9 weken. Fixeer de muizen door met de linkerhand de nekhuid van de muis vast te pakken en zachtjes op de experimentele tafel te drukken om de laterale decubituspositie in te nemen. Knip de snorharen van de muizen af met een schaar. Knip de snorharen van de muizen voorzichtig af met een schaar (zie Materiaaltabel) om bloedbesmetting te voorkomen.
- Colorectaal weefsel scheiden
- Euthanaseer de muizen na bloedafname door 5% overdosis isofluraan en cervicale dislocatie in te ademen (zie materiaaltabel) in overeenstemming met de dierethiek.
- Houd de muizen in een cryogene anatomische omgeving. Immobiliseer de muizen in rugligging. Knip het haar van de onderbuik af met een schaar en steriliseer het met ethanol.
- Knijp in het snijpunt tussen de twee dijwortels en de buikmiddellijn met een ooglidtang (zie Tabel met materialen). Knip met een schaar een dwarse incisie van ongeveer 1-1,5 cm.
- Knip een longitudinale incisie langs de mediaanlijn van de buik vanaf het middelpunt van de transversale incisie naar de processus xiphoid.
- Verwijder de pericolorectale weefsels in de richting van de anus om het colorectum te scheiden van het omliggende weefsel. Pas op dat u het colorectum niet beschadigt.
- Duw de huid van de buik naar de zijkanten om het colorectum volledig bloot te leggen. Verwijder het colorectum uit de buikholte met een ooglidtang en snijd de segmenten van de anus tot aan de blindedarm af (uitgezonderd); De totale lengte is ongeveer 10 cm. Bewaar de verkregen colorectale weefsels in zoutoplossing bij 4 °C.
- Evaluatie van de lengte en het gewicht van het rectum
- Extraheer de zoutoplossing bij 4 °C met een naald van 5 ml (zie Materiaaltabel) om de binnenkant van het colorectum te spoelen. Plaats vervolgens het colorectum op absorberend papier om het vocht van het weefsel te absorberen.
- Weeg de colorectale weefsels en plaats ze vervolgens op A4-papier om hun lengte te meten.
- Meet het aantal tumoren in het colorectum
- Snijd het colorectum in de lengte door om het volledig te ontvouwen en observeer het aantal en de grootte van de tumoren in het colorectum.
- Pathologische analyse van het colorectum
- Fixeer het colorectum gedurende 24 uur in 4% paraformaldehyde. Veranker het gefixeerde rectale weefsel in gesmolten paraffine en doorsnede continu met een dikte van 5 μm door een weefselbevriezingsmicrotoom.
- Volgens de procedure van Hou et al.24 de secties in xyleen ontwaxen en vervolgens dehydrateren met seriële concentraties ethanol. Na 5 minuten kleuring met hematoxyline-oplossing, spoelt u de secties af met zuiver water. Kleurs daarna gedurende 1 minuut met 0,5% eosine-oplossing (zie Materiaaltabel).
- Voer opnieuw gradiëntuitdroging en xyleentransparante behandeling uit. Sluit de secties af en observeer ze onder de optische microscoop (zie Tabel met materialen) en foto, zoals beschreven door Xie et al.25.
- Immunohistochemische analyse van colorectum
- Dewax en dehydrateer de secties volgens de bovenstaande methode. Repareer het antigeen in de secties met een hogedruk thermische reparatietechniek, zoals beschreven door Gok et al.26.
- Week de secties gedurende 15 minuten in endogene peroxidaseblokkers bij kamertemperatuur. Sluit de secties af met geitenserum (zie Materiaaltabel).
- Voeg het primaire antilichaam ZO-1 (1:1000), Occludine (1:1000) en KI67 (1:500; zie Materiaaltabel) toe aan de secties en incubeer een nacht bij 4 °C. Spoel de secties af met PBS-buffer (zie Materiaaltabel), voeg er secundair antilichaam voor algemeen gebruik (1:5000; zie Materiaaltabel) aan toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
- Voeg de DAB-oplossing (zie Materiaaltabel) toe aan de secties voor kleurontwikkeling. Bestkleur de secties met hematoxyline-oplossing.
- Dehydrateer, transparantiseer en sluit de secties opnieuw af. Observeer de expressie van eiwit door de optische microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het afkooksel van LJZD werd bereid volgens de samenstellingsverhouding van geneesmiddelen in tabel 1 en de afkookmethode van TCM in figuur 1A. Volgens het tijdstip aangegeven in figuur 1B werden muizen op de 7edag intraperitoneaal geïnjecteerd met 1 mg/ml AOM en kregen muizen vrije toegang tot drinkwater met 2% DSS in de 3e, 6e en 9eweek. Het UC-CRC-muismodel werd met succes vastgesteld in de15e week. Ondertussen werden muizen van week 7 tot week 15 behandeld met LJZD door middel van een maagsonde. De gegevens toonden aan dat in vergelijking met de controlegroep de UC-CRC-modelgroep een significant gewichtsverlies had, dat werd verlicht door LJZD-behandeling (Figuur 2A, P < 0,01). Aan het einde van de studie verbeterde LJZD-behandeling de DAI-score in vergelijking met de UC-CRC-modelgroep (Figuur 2B). Vergeleken met de controlegroep had de UC-CRC-modelgroep een kortere colorectale lengte, die werd vergroot door LJZD-behandeling (Figuur 2C,D, P < 0,01). De verhouding tussen het colorectale gewicht en het lichaamsgewicht weerspiegelt de ontwikkeling van CRC bij muizen, en een hogere verhouding duidt op acute tumorontwikkeling27. Vergeleken met de controlegroep was de colorectale orgaanindex van de modelgroep significant verhoogd en verlaagde de behandeling met LJZD de colorectale orgaanindex sterk (Figuur 2E, P < 0,05). Bovendien remde de behandeling met LJZD ook de vorming van colorectale tumoren (Figuur 2F, P < 0,01) en het niveau van pro-inflammatoire factor IL-628 in serum (Figuur 2G, P < 0,05).
Pathologische resultaten bevestigden dat in vergelijking met de controlegroep de muizen in de UC-CRC-modelgroep grotere colorectale tumoren hadden en adenocarcinoom hadden gevormd, terwijl behandeling met LJZD de grootte en graad van de tumoren verminderde (Figuur 3). Immunohistochemische gegevens toonden aan dat behandeling met LJZD de colorectale barrièrefunctie verbeterde bij UC-CRC-modelmuizen, zoals aangegeven door verhoogde eiwitexpressie van ZO-1 en occludine29 (Figuur 4). Tegelijkertijd onderdrukte de behandeling met LJZD de eiwitexpressieniveaus van de kankermarker KI6730 (Figuur 4).
Figuur 1: Voorbereiding van LJZD en opstelling van een muismodel van coloproctitiskanker.( A) Het mengsel van Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) en met gember verwerkte Ban Xia (9 g) werd gedurende 1 uur ondergedompeld in 1000 ml gedestilleerd water bij kamertemperatuur. Het 12 g Fuling-poeder werd gedurende 1 uur geweekt in 300 ml gedestilleerd water bij kamertemperatuur. Het mengsel van de bovengenoemde zes kruiden werd gedurende 40 minuten bij 100 °C afgetrokken. (B) Op dag 7 werden C57BL/6J-muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 1 mg/ml AOM. Muizen kregen water met 2% DSS ad libitum in de3e, 6e en 9eweek. Van 7 tot 15 weken kregen muizen LJZD toegediend via een maagsonde. Afkortingen: AOM, azomethaan; DAI, ziekteactiviteitsindex; DSS, dextraansulfaatnatrium; LJZD, Liujunzi afkooksel; w, week. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Evaluatie van het UC-CRC-model en de werkzaamheid van LJZD. (A) LJZD verbeterde het lichaamsgewicht in UC-CRC-modelmuizen. (B) LJZD verlichtte DAI-scores in UC-CRC-modelmuizen. (C, D) LJZD verhoogde de lengte van het colorectum in UC-CRC-modelmuizen. (E) LJZD verlaagde de orgaanindex van het colorectum in UC-CRC-modelmuizen. (F) LJZD remde colorectale tumorigenese bij muizen met coloproctitiskankermodel. (G) LJZD onderdrukte serum IL-6-spiegel in UC-CRC-modelmuizen. #P< 0,05 en ##P< 0,01, vergeleken met de controlegroep; *P < 0,05 en **P< 0,01, vergeleken met de modelgroep. De gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviaties (n=10) en werden geanalyseerd door middel van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de test van Tukey. P < 0,05 duidde op een statistisch significant verschil. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Evaluatie van de pathologische kenmerken van colorectale weefsels bij muizen door hematoxyline-eosinekleuring. Er was geen pathologische schade in de controlegroep. Het tumorweefsel van de UC-CRC-modelgroep was groot en had adenocarcinoom en hooggradige neoplasie gevormd, terwijl de LJZD-behandelingsgroep verminderd tumorweefsel had, vergezeld van een kleine hoeveelheid lokaal adenoom en laaggradige neoplasie. De zwarte pijl vertegenwoordigt de precancereuze dysplastische tumorklier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effect van LJZD op de colorectale barrièrefunctie en kankermarker bij UC-CRC-modelmuizen. (A) Immunohistochemische beelden van ZO-1, occludine en KI67. (B) Statistische resultaten van eiwitexpressie van ZO-1, occludine en KI67. Behandeling met LJZD verhoogde de expressie van functionele eiwitten ZO-1 en occludine in de colorectale barrière, terwijl het niveau van kankermarker KI67 in UC-CRC-modelmuizen verlaagde. ## P < 0,01, vergeleken met de controlegroep; ** P < 0,01, vergeleken met de modelgroep. De gegevens werden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviaties (n=10) en werden geanalyseerd door middel van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de test van Tukey. P < 0,05 duidde op een statistisch significant verschil. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Onderdelen | Pinyin | Gewicht (g) |
| Codonopsis Radix | Dangshen | 12 |
| Poria cocos | Vervullen | 12 |
| Atractylodis Macrocephalae Rhizoma | Baizhu | 12 |
| Drop | Kanton Gancao | 6 |
| Gedroogde sinaasappelschil | Kanton Chenpi | 12 |
| Wortelstok Pinelliae Preparata | Jiangbanxia | 9 |
Tabel 1: Samenstelling en aandeel van geneesmiddelen in LJZD.
| Items | Graad of symptomen | Scores |
| Gewichtsverlies | < 1% | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15% | 4 | |
| Fecaal occult bloedonderzoek | Negatief | 0 |
| Positief | 2 | |
| zichtbaar bloed in de ontlasting met het blote oog | 4 | |
| Fecale consistentie | normaal | 0 |
| dunne ontlasting | 2 | |
| waterige diarree | 4 |
Tabel 2: Ziekteactiviteitsindexscore voor UC-CRC-model bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRC is een van de meest voorkomende vormen van kanker ter wereld, met ongeveer 1.148.000 nieuwe gevallen en meer dan 576.000 sterfgevallen per jaar. CRC kan worden onderverdeeld in drie typen op basis van verschillende oorzaken, waaronder erfelijk, sporadisch en UC-CRC31. De incidentie van CRC bij patiënten met inflammatoire darmziekten zoals CU is significant hoger dan die in de algemene bevolking. CU stimuleert de ontwikkeling van CRC via de ontstekingskankerroute, die verschilt van de typische adenoom-adenocarcinoomroute6. Op dit moment is de oorzaak van UC-CRC onbekend, voornamelijk veroorzaakt door langdurige terugkerende chronische ontstekingen, met een sterftecijfer tot 60%32,33. Er is geen effectieve behandeling voor UC-CRC, dat de afgelopen jaren de hotspot van onderzoek is geweest. Het begrijpen van het moleculaire mechanisme van UC-CRC is cruciaal voor vroege detectie en nauwkeurige behandeling van UC-CRC.
Momenteel zijn er veel methoden om diermodellen van UC-CRC te construeren, en de vormingsmechanismen zijn verschillend. IL-10 of Muc2/4 gen knock-out, resulterend in epitheliale barrièredefecten, kan spontane colitis bij muizen induceren, dus het wordt vaak gebruikt om CRC-modellen bij dieren te construeren op basis van genetische defecten geassocieerd met UC 34,35,36. Desalniettemin kan het diermodel van UC-CRC, geïnduceerd door gen-knock-out, de volledige pathogenese van de ziekte niet simuleren, en de operatiemethode is complex, het experiment is duur en heeft duidelijke beperkingen. Chemische inductie is de klassieke en gebruikelijke methode om UC-CRC-diermodellen te construeren37,38. DSS, AOM en dimethylhydrazine zijn allemaal veelgebruikte chemische inductoren voor de constructie van UC-CRC. Het gebruik van deze chemische reagentia alleen om diermodellen op te stellen duurt echter lang en heeft een laag slagingspercentage39. Studies hebben aangetoond dat de incidentie van UC-CRC geïnduceerd door de combinatie van AOM en DSS kan oplopen tot bijna 100%40. In vergelijking met andere methoden heeft de combinatie van AOM/DSS de voordelen van eenvoudige bediening, sterke controleerbaarheid, korte cyclus en hoge replicatiesnelheid, en kan het menselijke UC-CRC beter simuleren in termen van pathologie en moleculair mechanisme 40,41,42. Hoewel het gebruik van AOM/DSS-cyclusstimulatie om een UC-CRC-model te construeren veel voordelen heeft, heeft het ook de nadelen van een lange modelleringstijd, dure modelleringsreagentia en kan het de pathogenese van menselijke UC-CRC nog steeds niet volledig simuleren.
Om een potentieel therapeutisch doelwit voor UC-CRC te zoeken, gebruikten we AOM, een chemisch carcinogeen, in combinatie met DSS-geïnduceerde muizen om een UC-CRC-model op te stellen. In deze studie vertoonden muizen die werden blootgesteld aan AOM en cyclische stimulatie van DSS verschillende gradaties van UC-CRC-gerelateerde symptomen. In vergelijking met de controlegroep was de DAI-score van de modelgroep significant verhoogd, wat zich uitte in gewichtsverlies, bloedontlasting, dunne ontlasting of waterige diarree. Terwijl LJZD de DAI-score aanzienlijk verlaagde. Verkorte colorectumlengte is een belangrijke marker van ontstekingsreactie bij UC-CRC43,44. In deze studie was de colorectumlengte van de modelmuizen significant korter dan die van de controlegroep, en LJZD kon het verkorte colorectum verbeteren. Het colorectale slijmvlies ontwikkelt chronische ontstekingen, die geleidelijk evolueren naar atypische hyperplasie van colorectaal weefsel en uiteindelijk kanker veroorzaken45. In deze studie nam het aantal tumoren in het colorectale weefsel van muizen in de modelgroep significant toe in vergelijking met de controlegroep, en dienovereenkomstig nam ook het gewicht van het colorectale weefsel toe. Na behandeling met LJZD nam het aantal tumoren aanzienlijk af en nam het colorectale gewicht af. Er wordt gesuggereerd dat LJZD een significant remmend effect heeft op de vorming van CRC geïnduceerd door CU. Eerdere studies hebben aangetoond dat LJZD ontstekingen kan verlichten en de expressieniveaus van TNF-α, IL-6 en IL-1β in vivokan verlagen 16,28,46. In deze studie was het serum IL-6-niveau van muizen in de modelgroep verhoogd, maar de productie van serum IL-6 werd significant geremd na behandeling met LJZD.
Microscopische observatie toonde inflammatoire infiltratie van rectaal weefsel, vernietiging van de mucosale barrière, vermindering van slijmafscheiding, onregelmatige of verdwijning van bekercellen, vervorming of atrofie van darmcrypten, en duidelijke stoornis van de klierstructuur bij met AOM/DSS behandelde muizen. Na behandeling met LJZD was de morfologie van bekercellen in colorectaal weefsel normaal, was de structuur van uitsparing en klier regelmatig en was de schade aan de mucosale barrière verbeterd. Epitheliale tight junction (TJ) is een onmisbare mechanische barrière om de celintegriteit en permeabiliteit te behouden, voornamelijk met inbegrip van ZO-1 en Occludine29. Er is gemeld dat de expressie van TJ-eiwitten zoals ZO-1 in colorectaal weefsel van UC-CRC-patiënten significant is verminderd47,48. Deze studie toonde aan dat de colorectale mucosale weefselstructuur van UC-CRC-muizen werd vernietigd en dat de expressie van ZO-1 en occludine in het weefsel afnam, terwijl LJZD deze afname kon omkeren, wat suggereert dat LJZD de integriteit van de colorectale mucosale barrière kan beschermen door de expressie van ZO-1 en occludine te verhogen. Nucleair-geassocieerd antigeen (KI67) is een essentieel onderdeel van de regulatie van de celcyclus en wordt veel gebruikt als indicator van proliferatieve activiteit van tumorcellen30,49. In deze studie was de KI67-eiwitexpressie verhoogd in de modelgroep in vergelijking met de controlegroep, wat wijst op significante proliferatie van tumorcellen in colorectaal weefsel. Na behandeling met LJZD was de expressie van het KI67-eiwit verminderd, wat aantoonde dat LJZD een goed effect had op UC-CRC.
Samenvattend kunnen AOM intraperitoneale injectie en DSS-circulatiestimulatie in korte tijd effectief een UC-CRC-model tot stand brengen en vergelijkbaar zijn met menselijke UC-CRC in termen van histopathologie en moleculaire vormingsmechanismen. Als klassiek recept kan LJZD de DAI-score, het gewicht van het colorectale weefsel en de niveaus van ontstekingsfactoren verlagen, de verkorting van de colorectale lengte effectief remmen en een rol spelen in het stadium van CU bij UC-CRC-muizen. Tegelijkertijd kan het de expressie van TJ-eiwitten verhogen, de pathologische schade aan colorectaal weefsel aanzienlijk verbeteren, de expressie van het KI67-eiwit verminderen, de incidentie van weefseltumoren aanzienlijk verminderen en het transformatieproces van CU naar CRC remmen. Deze studie biedt een nieuw idee voor de behandeling van UC-CRC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Jilin Provincial Department of Science and Technology (YDZJ202201ZYTS181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Tsai, K. Y., et al. Novel heavily fucosylated glycans as a promising therapeutic target in colorectal cancer. J Transl Med. 21 (1), 505 (2023).
- Chen, X., et al. Smoking, genetic predisposition, and colorectal cancer risk. Clin Transl Gastroenterol. 12 (3), e00317 (2021).
- Keum, N., Giovannucci, E. Global burden of colorectal cancer: emerging trends, risk factors and prevention strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (12), 713-732 (2019).
- Sninsky, J. A., Shore, B. M., Lupu, G. V., Crockett, S. D. Risk factors for colorectal polyps and cancer. Gastrointest Endosc Clin N Am. 32 (2), 195-213 (2022).
- Rivera, A. P., et al. Ulcerative colitis-induced colorectal carcinoma: A deleterious concatenation. Cureus. 14 (2), e22636 (2022).
- Faye, A. S., Holmer, A. K., Axelrad, J. E.
- Becker, W. R., et al. Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat Genet. 54 (7), 985-995 (2022).
- Choi, J. K., Kim, D. W., Shin, S. Y., Park, E. C., Kang, J. G. Effect of ulcerative colitis on incidence of colorectal cancer: Results from the nationwide population-based cohort study (2003-2013). J Cancer. 7 (6), 681-686 (2016).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Shah, S. C., Itzkowitz, S. H. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mechanisms and management. Gastroenterology. 162 (3), 715.e3-730.e3 (2022).
- Fabregas, J. C., Ramnaraign, B., George, T. J. Clinical updates for colon cancer care in 2022. Clin Colorectal Cancer. 21 (3), 198-203 (2022).
- Hu, J., et al. Pharmacological and molecular analysis of the effects of Huangqi Jianzhong decoction on proliferation and apoptosis in GES-1 cells infected with H. pylori.Front Pharmacol. 13, 1009705 (2022).
- Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
- Zhang, X. Y., et al. Sishen pill maintained colonic mucosal barrier integrity to treat ulcerative colitis via Rho/ROCK signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536679 (2021).
- Wu, X., Dai, Y., Nie, K. Research progress of Liujunzi decoction in the treatment of tumor-associated anorexia. Drug Des Devel Ther. 16, 1731-1741 (2022).
- Han, Y., et al. Liujunzi decoction exerts potent antitumor activity in oesophageal squamous cell carcinoma by inhibiting miR-34a/STAT3/IL-6R feedback loop and modifies antitumor immunity. Phytomedicine. 111, 154672 (2023).
- Chen, D., Zhao, J., Cong, W. Chinese herbal medicines facilitate the control of chemotherapy-induced side effects in colorectal cancer: Progress and perspective. Front Pharmacol. 9, 1442 (2018).
- Wang, M., Wang, S., Su, Q., Ma, T. Effect of combining early chemotherapy with Zhipu Liujunzi decoction under the concept of strengthening and consolidating body resistance for gastric cancer patients and nursing strategy. Contrast Media Mol Imaging. 2021, 2135924 (2021).
- Lin, Y., Koumba, M. H., Qu, S., Wang, D., Lin, L. Blocking NFATc3 ameliorates azoxymethane/dextran sulfate sodium induced colitis-associated colorectal cancer in mice via the inhibition of inflammatory responses and epithelial-mesenchymal transition. Cell Signal. 74, 109707 (2020).
- Yu, C. T., et al. Identification of significant modules and targets of Xian-Lian-Jie-Du decoction based on the analysis of transcriptomics, proteomics and single-cell transcriptomics in colorectal tumor. J Inflamm Res. 15, 1483-1499 (2022).
- Lin, L., Wang, D., Qu, S., Zhao, H., Lin, Y. miR-370-3p alleviates ulcerative colitis-related colorectal cancer in mice through inhibiting the inflammatory response and epithelial-mesenchymal transition. Drug Des Devel Ther. 14, 1127-1141 (2020).
- Qiu, X., Ma, J., Wang, K., Zhang, H. Chemopreventive effects of 5-aminosalicylic acid on inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer and dysplasia: a systematic review with meta-analysis. Oncotarget. 8 (1), 1031-1045 (2017).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 249, 112426 (2020).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Gok, A., et al. Role of reduced Bdnf expression in novel Apc mutant allele-induced intestinal and colonic tumorigenesis in mice. In Vivo. 37 (4), 1562-1575 (2023).
- Lin, Y., et al. Pou3f1 mediates the effect of Nfatc3 on ulcerative colitis-associated colorectal cancer by regulating inflammation. Cell Mol Biol Lett. 27 (1), 75 (2022).
- Xu, W., Zhao, R., Yuan, B. The therapeutic effect of traditional LiuJunZi decoction on ovalbumin-induced asthma in Balb/C mice. Can Respir J. 2021, 6406295 (2021).
- Kaihara, T., et al. Redifferentiation and ZO-1 reexpression in liver-metastasized colorectal cancer: possible association with epidermal growth factor receptor-induced tyrosine phosphorylation of ZO-1. Cancer Sci. 94 (2), 166-172 (2003).
- Lei, H. T., et al. Ki67 testing in the clinical management of patients with non-metastatic colorectal cancer: Detecting the optimal cut-off value based on the restricted cubic spline model. Oncol Lett. 24 (6), 420 (2022).
- Olén, O., et al. Colorectal cancer in ulcerative colitis: a Scandinavian population-based cohort study. Lancet. 395 (10218), 123-131 (2020).
- Arnold, M., et al. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut. 66 (4), 683-691 (2017).
- Biller, L. H., Schrag, D. Diagnosis and treatment of metastatic colorectal cancer: A review. Jama. 325 (7), 669-685 (2021).
- Talero, E., et al. Expression patterns of sirtuin 1-AMPK-autophagy pathway in chronic colitis and inflammation-associated colon neoplasia in IL-10-deficient mice. Int Immunopharmacol. 35, 248-256 (2016).
- Qian, Z., et al. Mulberry fruit prevents LPS-induced NF-κB/pERK/MAPK signals in macrophages and suppresses acute colitis and colorectal tumorigenesis in mice. Sci Rep. 5, 17348 (2015).
- Pothuraju, R., et al. Depletion of transmembrane mucin 4 (Muc4) alters intestinal homeostasis in a genetically engineered mouse model of colorectal cancer. Aging. 14 (5), 2025-2046 (2022).
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Zeng, B., et al. Dextran sodium sulfate potentiates NLRP3 inflammasome activation by modulating the KCa3.1 potassium channel in a mouse model of colitis. Cell Mol Immunol. 19 (8), 925-943 (2022).
- Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S.
- Tanaka, T., et al. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Song, J. L., et al. Dietary mixed cereal grains ameliorate the azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colonic carcinogenesis in C57BL/6J mice. J Med Food. 23 (4), 440-452 (2020).
- Zou, Y. F., et al. Effects of Huaier extract on ameliorating colitis-associated colorectal tumorigenesis in mice. Onco Targets Ther. 13, 8691-8704 (2020).
- Luo, X., et al. Obacunone reduces inflammatory signalling and tumour occurrence in mice with chronic inflammation-induced colorectal cancer. Pharm Biol. 58 (1), 886-897 (2020).
- Dai, Y., et al. Liujunzi Decoction ameliorated cisplatin-induced anorexia by inhibiting theJAK-STAT signaling pathway and coordinating anorexigenic and orexigenic neuropeptides in rats. J Ethnopharmacol. 285, 114840 (2022).
- Ghosh, D., Dutta, A., Kashyap, A., Upmanyu, N., Datta, S. PLP2 drives collective cell migration via ZO-1-mediated cytoskeletal remodeling at the leading edge in human colorectal cancer cells. J Cell Sci. 134 (18), jcs253468 (2021).
- Yan, S., et al. Berberine regulates short-chain fatty acid metabolism and alleviates the colitis-associated colorectal tumorigenesis through remodeling intestinal flora. Phytomedicine. 102, 154217 (2022).
- Ma, Y. L., et al. Immunohistochemical analysis revealed CD34 and Ki67 protein expression as significant prognostic factors in colorectal cancer. Med Oncol. 27 (2), 304-309 (2010).
