Summary
Questo protocollo fornisce un modello murino di carcinoma colorettale associato a coloproctite ulcerosa indotto da azometano combinato con destrano solfato di sodio. Il modello è stato utilizzato per valutare l'efficacia dei composti della medicina tradizionale cinese nella prevenzione e nel trattamento del cancro del colon-retto.
Abstract
Il cancro del colon-retto (CRC) è un tumore maligno comune dell'apparato digerente ed è diventato il terzo tumore maligno più comune in tutto il mondo e la seconda causa di morte correlata al tumore maligno. La coloproctite ulcerosa (CU) è una lesione precancerosa e la CRC associata alla CC (UC-CRC) è il sottotipo più comune di CRC. Pertanto, un modello UC-CRC ragionevole è la pietra angolare e la garanzia dello sviluppo di nuovi farmaci. La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata ampiamente utilizzata nel trattamento della UC-CRC grazie alla sua buona efficacia. Come classica prescrizione tonica della MTC, il decotto di Liujunzi (LJZD) è stato ampiamente utilizzato nel trattamento della UC-CRC. In questo studio, è stato stabilito un modello UC-CRC combinando azometano e destrano solfato di sodio ed è stato somministrato il LJZD. I dati hanno confermato che LJZD può inibire efficacemente la transizione del cancro in UC-CRC utilizzando il peso corporeo del topo, la lunghezza del colon-retto, i fattori patologici e infiammatori, la funzione della barriera colorettale e i marcatori tumorali. Questo protocollo fornisce un sistema per valutare l'efficacia della MTC nella prevenzione e nel trattamento della UC-CRC.
Introduction
Il cancro del colon-retto (CRC) è un tumore maligno gastrointestinale comune, il terzo tumore maligno più comune e la seconda causa di morte più comune al mondo, rappresentando il 10% dell'incidenza globale del cancro e il 9,4% del totale dei decessi correlati al cancro 1,2. Fattori genetici, infiammazione cronica, dieta ricca di grassi, diabete e flora intestinale anormale sono fattori di rischio per il CRC 3,4. Tra questi, la malattia infiammatoria intestinale, in particolare la coloproctite ulcerosa (CU), è un chiaro fattore di rischio per il CRC 5,6. La RCC associata alla UC (UC-CRC) è un processo di transizione dell'infiammazione, dell'iperplasia atipica e del cancro basato sull'infiammazione cronica del colon-retto, che è diverso dal tipico modello di sviluppo adenoma-adenocarcinoma del CRC 7,8. Rispetto alla popolazione generale, il rischio di CRC è circa 10-40 volte superiore nei pazienti con malattia infiammatoriaintestinale 9.
Attualmente, la chirurgia è ancora il trattamento standard per il CRC e, a seconda della posizione e dello stadio del tumore, è possibile la radioterapia, la terapia farmacologica sistemica o una combinazione di entrambe10. Sebbene queste modalità di trattamento tradizionali abbiano fatto grandi progressi, a causa dell'elevata eterogeneità e del tasso di recidiva del CRC, la prognosi è sfavorevole e l'effetto del trattamento non è ideale11,12. Pertanto, la diagnosi precoce, la diagnosi precoce e il trattamento completo sono fondamentali per migliorare il tasso di sopravvivenza dei pazienti con CRC ed è particolarmente importante prestare attenzione alla trasformazione della CU in CRC. Nel corso degli anni, la medicina tradizionale cinese (MTC) ha attirato molta attenzione nel trattamento della UC-CRC o gastrite cronica a causa dei suoi limitati effetti collaterali e della sua significativa efficacia. Sulla base del trattamento dialettico, famosi praticanti di medicina cinese di varie generazioni hanno creato un gran numero di prescrizioni classiche, come il decotto Huangqi Jianzhong13, il decotto Sijunzi14 e la pillola Sishen15.
Il decotto di Liujunzi (LJZD) ha avuto origine dalle opere di Yi Xue Zheng Zhuan compilate durante la dinastia Ming ed è una prescrizione classica della MTC16. Come mostrato nella Tabella 1, LJZD è costituito da sei erbe tradizionali, tra cui Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf. (Dangshen), Cocco di Poria (Schw.) Lupo (Fuling), Macrocephala Koidz di Atractylodes. (Baizhu), Glycyrrhiza uralensis Fisch. (Ganção), Citrus reticulata Blanco (Chenpi) e Pinellia ternata (Thunb.) Breit (Banxia), che ha l'effetto di reintegrare il qi e rafforzare la milza, asciugare l'umidità e risolvere il catarro. Nella pratica clinica moderna, viene spesso utilizzato per trattare la gastrite cronica, le ulcere gastriche e le ulcere duodenali. La moderna ricerca farmacologica ha dimostrato che la LJZD e la LJZD modificata hanno un alto valore applicativo nel trattamento adiuvante della CU e del cancro del tratto digestivo 17,18,19.
Attualmente, ci sono molti modi per costruire modelli murini UC-CRC, ma il modello murino indotto da azossimetano (AOM)/destrano solfato di sodio (DSS) è il modello UC-CRC più utilizzato; i sintomi clinici, le osservazioni morfologiche e patologiche hanno dimostrato che il modello è molto simile all'UC-CRCumano 20,21. Il principio di base è quello di indurre prima la cancerogenesi con l'agente cancerogeno chimico AOM e poi esporre continuamente i topi all'ambiente di stimolazione infiammatoria del DSS per simulare il danno continuo e la riparazione dell'epitelio della mucosa intestinale, costruendo così un modello murino UC-CRC22. Lo scopo di questo studio è quello di stabilire un modello murino di UC-CRC mediante iniezione intraperitoneale di AOM e stimolazione ciclica di DSS a breve termine e di valutare l'effetto del farmaco e il meccanismo molecolare di LJZD su UC-CRC al fine di fornire una base scientifica per il trattamento di UC-CRC.
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Protocol
La procedura sugli animali è stata approvata dal Comitato Etico dell'Università di Medicina Cinese di Changchun (Numero di registrazione: 2021214). Topi C57BL/6J privi di patogeni specifici (8-10 settimane, peso 18-22 g), maschi e femmine, sono stati alloggiati in gabbie ventilate in modo indipendente a 22 °C e 65% di umidità relativa. I topi hanno iniziato l'esperimento dopo 7 giorni di alimentazione adattativa, durante i quali hanno avuto libero accesso all'acqua e alla dieta.
1. Preparazione del farmaco
- Preparazione di LJZD
NOTA: La medicina cinese utilizzata è stata acquistata presso l'Ospedale Affiliato dell'Università di Medicina Cinese di Changchun ed è stata identificata come vera medicina cinese (vedi Tabella 1).- Metti Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g), Jiangbanxia (9 g) in un vaso di ceramica specializzato (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 1000 mL di acqua distillata e lasciare in ammollo a temperatura ambiente per 1 ora (vedi Figura 1A).
- Polvere 12 g Versare in polvere fine con un macinino e immergere in 300 ml di acqua distillata in un altro contenitore per 1 ora a temperatura ambiente.
- Mescola la medicina cinese di cui sopra nel vaso di ceramica specializzato. Far bollire il composto e poi tenere a fiamma media fino a quando non rimangono solo 300 ml di decotto. Utilizzare una garza medica per filtrare e conservare il filtrato a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1000 ml di acqua distillata e ripetere nuovamente l'operazione di decotto di cui sopra. Filtrare nuovamente con una garza medica. Unire il filtrato e farlo bollire fino a quando rimangono solo 150 ml.
- Centrifugare il liquido concentrato a 10.000 x g per 5 minuti e concentrare ulteriormente il surnatante ottenuto a 30 mL a fuoco medio. Trasferisci il concentrato finale in un piatto e asciugalo utilizzando un forno elettrico di essiccazione fino a quando rimane solo il soluto sotto forma di polvere.
- Pesare il solido di cui sopra e scioglierlo in acqua distillata sterile per ottenere una soluzione contenente 22,85 mg di farmaco per 0,2 mL (114,16 mg/mL), che è la dose giornaliera dei topi.
- Preparazione dell'acido 5-amminosalicilico
NOTA: L'acido salicilico 5-amminoacido (5-ASA; vedere la tabella dei materiali) ha un buon effetto preventivo sull'UC-CRC ed è stato utilizzato come farmaco positivo in questo studio23.- Sciogliere 64 mg di polvere di 5-ASA in 200 mL di acqua distillata sterile per ottenere una soluzione di 5-ASA 1,82 mg/mL. La dose giornaliera per un singolo topo è stata di 0,2 ml.
- Preparazione della soluzione iniettabile di AOM
- Aggiungere 2,5 mL di acqua distillata sterile in polvere AOM da 25 mg (vedere la tabella dei materiali) e mescolare con un miscelatore a vortice (vedere la tabella dei materiali) per ottenere una soluzione madre AOM da 10 mg/mL, conservare a -20 °C fino all'uso.
- Preparare la soluzione iniettabile di AOM diluendo la soluzione madre AOM con acqua distillata sterile a 10:1 (1 mg/mL).
2. Istituzione del modello UC-CRC
NOTA: L'esperimento è stato diviso in 4 gruppi: controllo, modello, LJZD e gruppo 5-ASA, 10 topi in ciascun gruppo. Ad eccezione del gruppo di controllo, gli altri gruppi sono stati trattati con AOM e DSS.
- Iniezione intraperitoneale di soluzione iniettabile AOM
NOTA: Dopo l'alimentazione adattativa per 7 giorni, ai topi è stata somministrata una soluzione iniettabile di AOM (1 mg/mL) mediante iniezione intraperitoneale (vedere Figura 1B).- Tieni il mouse con la pancia in alto e la testa leggermente in basso. Afferrare la pelle posteriore per stringere la pelle addominale e perforare la pelle a circa 1 cm a destra dell'intersezione della linea radicolare di entrambe le cosce sulla linea dell'addome medio con una siringa da 1 mL (vedere Tabella dei materiali).
- Spingere l'ago della siringa da 1 mL a una distanza di 3-5 mm sotto la pelle, mantenendolo parallelo alla linea mediana addominale, e inserire l'ago di 0,3-0,5 mm nella cavità addominale a 45°.
- Dopo che la punta ha attraversato il muscolo addominale, l'operatore avverte un'improvvisa perdita di resistenza. Successivamente, tirare la siringa verso l'esterno e all'indietro per osservare se si verificano infiltrazioni di liquido. In caso contrario, spingere lentamente la soluzione iniettabile di AOM nei topi a 0,1 mL/10 g.
- Stimolazione ciclica della soluzione di DSS al 2%
NOTA: A ciascun topo indotto da AOM sono stati somministrati 500 mL di soluzione DSS alle settimane 3, 6 e 9 e i topi hanno bevuto liberamente durante questo periodo.- Preparare una soluzione di DSS al 2% aggiungendo 500 mL di acqua distillata sterile a 10 g di DSS (vedere la tabella dei materiali). Miscelare con miscelatore a vortice e conservare a 4 °C fino al momento dell'utilizzo.
- Ogni topo indotto da AOM beve liberamente 500 mL di soluzione di DSS al 2% per 7 giorni nelle settimane 3, 6 e 9 dopo l'induzione dell'AOM.
3. Trattamento farmacologico
NOTA: Gli esseri umani adulti hanno bisogno di 63 g di LJZD al giorno. Secondo la formula di conversione della dose sperimentale di farmaci per topi e per l'uomo, dose sperimentale equivalente per topi (mg/kg) = dose umana (mg/kg)/peso corporeo (60 kg) x 9,1, la dose giornaliera di topi era di circa 9,6 g/kg.
- Trattare il gruppo LJZD e 5-ASA con 0,1 mL/10 g della soluzione preparata di LJZD e 5-ASA mediante sonda gastrica rispettivamente alla settimana 7 e alla settimana 15.
- Per la somministrazione intragastrica nei topi, eseguire la seguente procedura. Tenere il mouse con la mano sinistra e con la mano destra tenere l'apparecchio per la perfusione dello stomaco. Inserire l'ago della siringa in bocca e farlo scorrere lungo la parete posteriore della faringe dei topi. Scivola lungo la faringe mentre i topi deglutiscono e continua ad andare avanti. Quando c'era un senso di resistenza e la siringa poteva essere spinta nella faringe, estrarre l'ago e completare l'iniezione.
- Trattare il gruppo di controllo e il gruppo modello con la stessa quantità di soluzione fisiologica (vedi Tabella dei materiali).
- Trattare i topi di ciascun gruppo con un farmaco appropriato una volta al giorno alla stessa ora durante il periodo di somministrazione.
4. Valutazione del modello UC-CRC e dell'efficacia di LJZD
- Punteggio dell'indice di attività della malattia
NOTA: Secondo la Tabella 2, il punteggio dell'indice di attività della malattia (DAI) è stato valutato combinando la perdita di peso, la viscosità fecale e il sanguinamento delle feci dei topi.- Registrare il peso dei topi ogni giorno dall'inizio dell'alimentazione adattativa fino alla fine del trattamento farmacologico.
- Osserva attentamente la consistenza fecale di ogni topo sperimentale e registra i movimenti intestinali come una delle tre condizioni: feci normali e molli e diarrea acquosa.
- Registrare il sanguinamento fecale degli animali da esperimento come una delle tre condizioni: nessun sanguinamento, poco sanguinamento e sangue visibile nelle feci.
- Rilevamento del livello di IL-6 nel siero
- Trattare i topi con LJZD o 5-ASA per 9 settimane. Fissare i topi afferrando la pelle del collo del topo con la mano sinistra e premendo delicatamente sul tavolo sperimentale per assumere la posizione di decubito laterale. Taglia i baffi dei topi con le forbici. Tagliare con cura i baffi dei topi con le forbici (vedere la tabella dei materiali) per evitare la contaminazione del sangue.
NOTA: I topi che non potevano muoversi liberamente sono stati considerati correttamente riparati. Se ciò non accade, i topi dovrebbero essere riparati. - Anestetizzare il topo mediante inalazione di isoflurano al 2%. Sterilizzare la pelle intorno al bulbo oculare con etanolo (vedere la tabella dei materiali). Premere delicatamente la pelle dell'occhio sul lato per rendere il bulbo oculare congestionato e sporgente.
- Bloccare il bulbo oculare con una pinzetta a gomito e rimuovere i bulbi oculari in modo accurato e rapido. Lasciare gocciolare il sangue nella provetta centrifuga (vedi Tabella dei materiali). Nel processo, tocca il cuore del mouse per accelerare la raccolta del sangue.
- Tenere il sangue raccolto a temperatura ambiente per 30 minuti e centrifugarlo a 3.500 x g per 10 minuti. Raccogliere il surnatante e rilevare il livello di IL-6 secondo le istruzioni del kit di rilevamento del contenuto di IL-6 (vedere la tabella dei materiali).
- Trattare i topi con LJZD o 5-ASA per 9 settimane. Fissare i topi afferrando la pelle del collo del topo con la mano sinistra e premendo delicatamente sul tavolo sperimentale per assumere la posizione di decubito laterale. Taglia i baffi dei topi con le forbici. Tagliare con cura i baffi dei topi con le forbici (vedere la tabella dei materiali) per evitare la contaminazione del sangue.
- Separazione del tessuto colorettale
- Sopprimere i topi dopo il prelievo di sangue inalando il 5% di isoflurano sovradosato e lussazione cervicale (vedi Tabella dei materiali) in conformità con l'etica animale.
- Tenere i topi in un ambiente anatomico criogenico. Immobilizzare i topi in posizione supina. Tagliare i peli del basso ventre con le forbici e sterilizzarli con etanolo.
- Pizzicare il punto di intersezione tra le due radici della coscia e la linea mediana addominale con una pinza palpebrale (vedi Tabella dei materiali). Praticare un'incisione trasversale di circa 1-1,5 cm con le forbici.
- Praticare un'incisione longitudinale lungo la linea mediana dell'addome dal punto medio dell'incisione trasversale verso il processo xifoideo.
- Rimuovere i tessuti peri-colorettali in direzione dell'ano per separare il colon-retto dal tessuto circostante. Fare attenzione a non danneggiare il colon-retto.
- Spingi la pelle dell'addome ai lati per esporre completamente il colon-retto. Rimuovere il colorectum dalla cavità addominale con una pinza palpebrale e tagliare i segmenti dall'ano al cieco (escluso); La lunghezza totale è di circa 10 cm. Conservare i tessuti colorettali ottenuti in soluzione fisiologica a 4 °C.
- Valutazione della lunghezza e del peso del retto
- Estrarre la soluzione fisiologica a 4 °C con un ago da 5 mL (vedi Tabella dei materiali) per lavare l'interno del colon-retto. Quindi, posizionare il colorectum su carta assorbente per assorbire l'umidità del tessuto.
- Pesare i tessuti colorettali e poi posizionarli su un foglio A4 per misurarne la lunghezza.
- Misurare il numero di tumori nel colon-retto
- Taglia il colorectum nel senso della lunghezza per aprirlo completamente e osserva il numero e le dimensioni dei tumori nel colon-retto.
- Analisi patologica del colon-retto
- Fissare il colorectum in paraformaldeide al 4% per 24 h. Incorporare il tessuto rettale fisso in paraffina fusa e sezionarlo in modo continuo con uno spessore di 5 μm mediante un microtomo di congelamento dei tessuti.
- Secondo la procedura di Hou et al.24, decerare le sezioni in xilene e poi disidratarle con concentrazioni seriali di etanolo. Dopo aver colorato con una soluzione di ematossilina per 5 minuti, risciacquare le sezioni con acqua pura. Dopodiché, colorare con una soluzione di eosina allo 0,5% per 1 minuto (vedere la tabella dei materiali).
- Eseguire nuovamente la disidratazione a gradiente e il trattamento trasparente allo xilene. Sigillare le sezioni e osservarle al microscopio ottico (vedi Tabella dei materiali) e fotografare, come descritto da Xie et al.25.
- Analisi immunoistochimica del colon-retto
- Decerare e disidratare le sezioni secondo il metodo di cui sopra. Riparare l'antigene nelle sezioni con la tecnica di riparazione termica ad alta pressione, come descritto da Gok et al.26.
- Immergere le sezioni in bloccanti della perossidasi endogena a temperatura ambiente per 15 minuti. Sigillare le sezioni con siero di capra (vedi Tabella dei materiali).
- Aggiungere l'anticorpo primario ZO-1 (1:1000), Occludin (1:1000) e KI67 (1:500; vedere la tabella dei materiali) alle sezioni e incubare per una notte a 4 °C. Risciacquare le sezioni con tampone PBS (vedere la tabella dei materiali), aggiungere l'anticorpo secondario per uso generale (1:5000; vedere la tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 30 min.
- Aggiungere la soluzione DAB (vedere la tabella dei materiali) alle sezioni per lo sviluppo del colore. Controcolorare le sezioni con una soluzione di ematossilina.
- Disidratare, rendere trasparenti e sigillare nuovamente le sezioni. Osservare l'espressione delle proteine al microscopio ottico.
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Representative Results
Il decotto di LJZD è stato preparato in base al rapporto di composizione dei farmaci nella Tabella 1 e al metodo di decotto della MTC nella Figura 1A. Secondo il punto temporale indicato nella Figura 1B, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 1 mg / mL di AOM il 7° giorno e i topi hanno avuto libero accesso all'acqua potabile contenente il 2% di DSS nella 3°, 6° e 9° settimana. Il modello murino UC-CRC è stato stabilito con successo nella15a settimana. Nel frattempo, i topi sono stati trattati con LJZD mediante sonda gastrica dalla settimana 7 alla settimana 15. I dati hanno mostrato che, rispetto al gruppo di controllo, il gruppo modello UC-CRC ha avuto una significativa perdita di peso, che è stata alleviata dal trattamento con LJZD (Figura 2A, P < 0,01). Alla fine dello studio, il trattamento con LJZD ha migliorato il punteggio DAI rispetto al gruppo modello UC-CRC (Figura 2B). Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo modello UC-CRC aveva una lunghezza colorettale più breve, che è stata aumentata dal trattamento con LJZD (Figura 2C, D, P < 0,01). Il rapporto tra il peso del colon-retto e il peso corporeo riflette lo sviluppo del CRC nei topi e un rapporto più elevato indica lo sviluppo acuto del tumore27. Rispetto al gruppo di controllo, l'indice dell'organo colorettale del gruppo modello è aumentato significativamente e il trattamento con LJZD ha ridotto notevolmente l'indice dell'organo colorettale (Figura 2E, P < 0,05). Inoltre, il trattamento con LJZD ha anche inibito la formazione di tumori del colon-retto (Figura 2F, P < 0,01) e il livello del fattore pro-infiammatorio sierico IL-628 (Figura 2G, P < 0,05).
I risultati patologici hanno confermato che, rispetto al gruppo di controllo, i topi del gruppo modello UC-CRC avevano tumori del colon-retto più grandi e avevano formato adenocarcinoma, mentre il trattamento con LJZD ha ridotto le dimensioni e il grado dei tumori (Figura 3). I dati immunoistochimici hanno dimostrato che il trattamento con LJZD ha migliorato la funzione della barriera colorettale nei topi modello UC-CRC, come indicato dall'elevata espressione proteica di ZO-1 e Occludina29 (Figura 4). Parallelamente, il trattamento con LJZD ha soppresso i livelli di espressione proteica del marcatore tumorale KI6730 (Figura 4).
Figura 1: Preparazione di LJZD e creazione di un modello murino di cancro della coloproctite. R) La miscela di Dangshen (12 g), Baizhu (12 g), Gancao (6 g), Chenpi (12 g) e Ban Xia (9 g) lavorata allo zenzero è stata immersa in 1000 ml di acqua distillata a temperatura ambiente per 1 ora. La polvere di Fuling da 12 g è stata immersa in 300 ml di acqua distillata a temperatura ambiente per 1 ora. La miscela delle sei erbe di cui sopra è stata decotta a 100 °C per 40 min. (B) Il giorno 7, i topi C57BL/6J sono stati iniettati per via intraperitoneale con 1 mg/mL di AOM. Ai topi è stata somministrata acqua contenente il 2% di DSS ad libitum nella 3a, 6a e 9asettimana. Da 7 a 15 settimane, ai topi è stato somministrato LJZD per via endovenosa. Abbreviazioni: AOM, azometano; DAI, indice di attività della malattia; DSS, destrano solfato di sodio; LJZD, Decotto di Liujunzi; w, settimana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione del modello UC-CRC e dell'efficacia di LJZD. (A) LJZD ha migliorato il peso corporeo nei topi modello UC-CRC. (B) LJZD ha alleviato i punteggi DAI nei topi modello UC-CRC. (C, D) LJZD ha aumentato la lunghezza del colorectum nei topi modello UC-CRC. (E) LJZD ha ridotto l'indice d'organo del colorectum nei topi modello UC-CRC. (F) LJZD ha inibito la tumorigenesi colorettale nei topi modello di cancro alla coloproctite. (G) LJZD ha soppresso il livello sierico di IL-6 nei topi modello UC-CRC. #P< 0,05 e ##P< 0,01, rispetto al gruppo di controllo; *P < 0,05 e **P< 0,01, rispetto al gruppo di modelli. I dati sono stati espressi come media ± deviazioni standard (n = 10) e sono stati analizzati mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test di Tukey. P < 0,05 indicava una differenza statisticamente significativa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione delle caratteristiche patologiche dei tessuti colorettali nei topi mediante colorazione ematossilina-eosina. Non c'è stato alcun danno patologico nel gruppo di controllo. Il tessuto tumorale del gruppo modello UC-CRC era grande e aveva formato adenocarcinoma e neoplasia di alto grado, mentre il gruppo di trattamento LJZD aveva ridotto il tessuto tumorale accompagnato da una piccola quantità di adenoma locale e neoplasia di basso grado. La freccia nera rappresenta la ghiandola tumorale displasica precancerosa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetto di LJZD sulla funzione della barriera colorettale e sul marcatore tumorale nei topi modello UC-CRC. (A) Immagini immunoistochimiche di ZO-1, Occludin e KI67. (B) Risultati statistici dell'espressione proteica di ZO-1, Occludina e KI67. Il trattamento con LJZD ha aumentato l'espressione delle proteine funzionali della barriera colorettale ZO-1 e Occludin, mentre ha diminuito il livello del marcatore tumorale KI67 nei topi modello UC-CRC. ## P < 0,01, rispetto al gruppo di controllo; ** P < 0,01, rispetto al gruppo di modelli. I dati sono stati espressi come media ± deviazioni standard (n = 10) e sono stati analizzati mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test di Tukey. P < 0,05 indicava una differenza statisticamente significativa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componenti | Pinyin | Peso (g) |
| Codonopsis Radix | Dangshen | 12 |
| Cocco di Poria | Fuling | 12 |
| Rizoma di Atractylodis macrocephalae | Baizhu | 12 |
| Liquirizia | Ganção | 6 |
| Buccia d'arancia essiccata | Chenpi | 12 |
| Rhizome Pinelliae Preparata | cantone di Jiangbanxia | 9 |
Tabella 1: Composizione e proporzione di farmaci nella LJZD.
| Elementi | Grado o sintomi | Punteggi |
| Perdita di peso | < 1% | 0 |
| 1%-5% | 1 | |
| 5%-10% | 2 | |
| 10%-15% | 3 | |
| ≥15% | 4 | |
| Analisi del sangue occulto fecale | Negativo | 0 |
| Positivo | 2 | |
| sangue visibile nelle feci ad occhio nudo | 4 | |
| Consistenza fecale | normale | 0 |
| feci sciolte | 2 | |
| diarrea acquosa | 4 |
Tabella 2: Punteggio dell'indice di attività della malattia per il modello UC-CRC nei topi.
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Discussion
Il CRC è uno dei tumori più comuni in tutto il mondo, con circa 1.148.000 nuovi casi e più di 576.000 decessi ogni anno. Il CRC può essere suddiviso in tre tipi in base a diverse cause, tra cui ereditario, sporadico e UC-CRC31. L'incidenza del CRC nei pazienti con malattie infiammatorie intestinali come la CU è significativamente superiore a quella della popolazione generale. La CU stimola lo sviluppo del CRC attraverso la via infiammatoria-cancro, che differisce dalla tipica via adenoma-adenocarcinoma6. Al momento, la causa della UC-CRC è sconosciuta, causata principalmente da un'infiammazione cronica ricorrente a lungo termine, con un tasso di mortalità fino al 60%32,33. Non esiste un trattamento efficace per l'UC-CRC, che è stato il punto caldo della ricerca negli ultimi anni. La comprensione del meccanismo molecolare dell'UC-CRC è fondamentale per la diagnosi precoce e il trattamento preciso dell'UC-CRC.
Attualmente, ci sono molti metodi per costruire modelli animali di UC-CRC e i meccanismi di formazione sono diversi. Il knockout del gene IL-10 o Muc2/4, con conseguenti difetti della barriera epiteliale, può indurre colite spontanea nei topi, quindi viene spesso utilizzato per costruire modelli animali di CRC basati su difetti genetici associati a UC 34,35,36. Tuttavia, il modello animale di UC-CRC indotto dal knockout genico non può simulare la patogenesi completa della malattia e il suo metodo operativo è complesso, l'esperimento è costoso e presenta evidenti limitazioni. L'induzione chimica è il metodo classico e comune per costruire modelli animali UC-CRC37,38. DSS, AOM e dimetilidrazina sono tutti induttori chimici comunemente usati per la costruzione di UC-CRC. Tuttavia, l'utilizzo di questi reagenti chimici da soli per stabilire modelli animali richiede molto tempo e ha un basso tasso di successo39. Gli studi hanno dimostrato che l'incidenza di UC-CRC indotta dalla combinazione di AOM e DSS può raggiungere quasi il 100%40. Rispetto ad altri metodi, la combinazione di AOM/DSS presenta i vantaggi di un funzionamento semplice, una forte controllabilità, un ciclo breve e un alto tasso di replicazione e può simulare meglio l'UC-CRC umano in termini di patologia e meccanismo molecolare 40,41,42. Sebbene l'uso della stimolazione del ciclo AOM/DSS per costruire il modello UC-CRC abbia molti vantaggi, presenta anche gli svantaggi di lunghi tempi di modellazione, costosi reagenti di modellazione e ancora non può simulare completamente la patogenesi dell'UC-CRC umano.
Al fine di cercare un potenziale bersaglio terapeutico per UC-CRC, abbiamo utilizzato AOM, un cancerogeno chimico, in combinazione con topi indotti da DSS per stabilire un modello UC-CRC. In questo studio, i topi esposti all'AOM e alla stimolazione ciclica del DSS hanno mostrato vari gradi di sintomi correlati all'UC-CRC. Rispetto al gruppo di controllo, il punteggio DAI del gruppo modello è stato significativamente aumentato, che si è manifestato come perdita di peso, feci di sangue, feci molli o diarrea acquosa. Mentre LJZD ha ridotto significativamente il punteggio DAI. La riduzione della lunghezza del colon-retto è un importante marcatore della risposta infiammatoria in UC-CRC43,44. In questo studio, la lunghezza del colorectum dei topi modello era significativamente più corta di quella del gruppo di controllo e LJZD potrebbe migliorare il coloretto accorciato. La mucosa colorettale sviluppa un'infiammazione cronica, che si evolve gradualmente in iperplasia atipica del tessuto colorettale e alla fine causa il cancro45. In questo studio, il numero di tumori nel tessuto colorettale dei topi nel gruppo modello è aumentato significativamente rispetto al gruppo di controllo e, di conseguenza, anche il peso del tessuto colorettale è aumentato. Dopo il trattamento con LJZD, il numero di tumori è diminuito significativamente e il peso del colon-retto è diminuito. Si suggerisce che la LJZD abbia un significativo effetto inibitorio sulla formazione di CRC indotta dalla CU. Studi precedenti hanno scoperto che LJZD può alleviare l'infiammazione e ridurre i livelli di espressione di TNF-α, IL-6 e IL-1β in vivo 16,28,46. In questo studio, il livello sierico di IL-6 dei topi nel gruppo modello è aumentato, ma la produzione di IL-6 sierica è stata significativamente inibita dopo il trattamento con LJZD.
L'osservazione microscopica ha mostrato infiltrazione infiammatoria del tessuto rettale, distruzione della barriera mucosa, riduzione della secrezione di muco, irregolarità o scomparsa delle cellule caliciformi, distorsione o atrofia delle cripte intestinali e evidente disturbo della struttura della ghiandola nei topi trattati con AOM/DSS. Dopo il trattamento con LJZD, la morfologia delle cellule caliciformi nel tessuto colorettale era normale, la struttura dell'incavo e della ghiandola era regolare e il danno alla barriera mucosale era migliorato. La giunzione stretta epiteliale (TJ) è una barriera meccanica indispensabile per mantenere l'integrità e la permeabilità cellulare, includendo principalmente ZO-1 e Occludina29. È stato riportato che l'espressione di proteine TJ come ZO-1 nel tessuto colorettale dei pazienti con UC-CRC è significativamente ridotta47,48. Questo studio ha dimostrato che la struttura del tessuto della mucosa colorettale dei topi UC-CRC è stata distrutta e l'espressione di ZO-1 e Occludina nel tessuto è diminuita, mentre LJZD potrebbe invertire questa diminuzione, suggerendo che LJZD può proteggere l'integrità della barriera della mucosa colorettale aumentando l'espressione di ZO-1 e Occludina. L'antigene associato al nucleare (KI67) è un componente essenziale della regolazione del ciclo cellulare ed è ampiamente utilizzato come indicatore dell'attività proliferativa delle cellule tumorali30,49. In questo studio, l'espressione della proteina KI67 è risultata aumentata nel gruppo modello rispetto al gruppo di controllo, indicando una significativa proliferazione delle cellule tumorali nel tessuto colorettale. Dopo il trattamento con LJZD, l'espressione della proteina KI67 è diminuita, il che ha dimostrato che LJZD ha avuto un buon effetto su UC-CRC.
In sintesi, l'iniezione intraperitoneale di AOM e la stimolazione della circolazione DSS possono stabilire efficacemente un modello di UC-CRC in un breve periodo e sono simili all'UC-CRC umano in termini di istopatologia e meccanismi molecolari di formazione. Come prescrizione classica, LJZD può ridurre il punteggio DAI, il peso del tessuto colorettale e i livelli di fattore infiammatorio, inibire efficacemente l'accorciamento della lunghezza del colon-retto e svolgere un ruolo nello stadio di UC nei topi UC-CRC. Allo stesso tempo, può aumentare l'espressione delle proteine TJ, migliorare significativamente il danno patologico del tessuto colorettale, ridurre l'espressione della proteina KI67, ridurre significativamente l'incidenza dei tumori tissutali e inibire il processo di trasformazione della UC in CRC. Questo studio fornisce una nuova idea per il trattamento della UC-CRC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia di Jilin (YDZJ202201ZYTS181).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Azoxymethane | Sigma | A5486 | |
| 5-amino salicylic acid | Kuihua Pharmaceuticals Group Jiamusi Luling Pharmaceutical Co., Ltd | 3819413 | |
| C57BL/6J mice | Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd | NO 210726210100853716 | |
| Cover slip | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432C | |
| DAB color development kit | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 2005289 | |
| Dewatering machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JJ-12J | |
| Dextran sulfate sodium | Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd | MB5535 | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Hematoxylin-eosin dye | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | B1000 | |
| IL-6 | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd | MM-0163M2 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., Ltd | R510-22-10 | |
| KI67 primary antibody | Google Biotechnology Inc | GB121141 | |
| Neutral gum | Wuhan Hundred Degree Biotechnology Co., Ltd | 10004160 | |
| Object slide | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd | 10212432A | |
| Occludin primary antibody | Affnity | DF7504 | |
| Orthostatic optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse CI | |
| Pathological microtome | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| ZO-1 primary antibody | Abcam | ab221547 |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Tsai, K. Y., et al. Novel heavily fucosylated glycans as a promising therapeutic target in colorectal cancer. J Transl Med. 21 (1), 505 (2023).
- Chen, X., et al. Smoking, genetic predisposition, and colorectal cancer risk. Clin Transl Gastroenterol. 12 (3), e00317 (2021).
- Keum, N., Giovannucci, E. Global burden of colorectal cancer: emerging trends, risk factors and prevention strategies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (12), 713-732 (2019).
- Sninsky, J. A., Shore, B. M., Lupu, G. V., Crockett, S. D. Risk factors for colorectal polyps and cancer. Gastrointest Endosc Clin N Am. 32 (2), 195-213 (2022).
- Rivera, A. P., et al. Ulcerative colitis-induced colorectal carcinoma: A deleterious concatenation. Cureus. 14 (2), e22636 (2022).
- Faye, A. S., Holmer, A. K., Axelrad, J. E.
- Becker, W. R., et al. Single-cell analyses define a continuum of cell state and composition changes in the malignant transformation of polyps to colorectal cancer. Nat Genet. 54 (7), 985-995 (2022).
- Choi, J. K., Kim, D. W., Shin, S. Y., Park, E. C., Kang, J. G. Effect of ulcerative colitis on incidence of colorectal cancer: Results from the nationwide population-based cohort study (2003-2013). J Cancer. 7 (6), 681-686 (2016).
- Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
- Shah, S. C., Itzkowitz, S. H. Colorectal cancer in inflammatory bowel disease: Mechanisms and management. Gastroenterology. 162 (3), 715.e3-730.e3 (2022).
- Fabregas, J. C., Ramnaraign, B., George, T. J. Clinical updates for colon cancer care in 2022. Clin Colorectal Cancer. 21 (3), 198-203 (2022).
- Hu, J., et al. Pharmacological and molecular analysis of the effects of Huangqi Jianzhong decoction on proliferation and apoptosis in GES-1 cells infected with H. pylori.Front Pharmacol. 13, 1009705 (2022).
- Shang, L., et al. Mechanism of Sijunzi decoction in the treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 302 (Pt A), 115876 (2023).
- Zhang, X. Y., et al. Sishen pill maintained colonic mucosal barrier integrity to treat ulcerative colitis via Rho/ROCK signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5536679 (2021).
- Wu, X., Dai, Y., Nie, K. Research progress of Liujunzi decoction in the treatment of tumor-associated anorexia. Drug Des Devel Ther. 16, 1731-1741 (2022).
- Han, Y., et al. Liujunzi decoction exerts potent antitumor activity in oesophageal squamous cell carcinoma by inhibiting miR-34a/STAT3/IL-6R feedback loop and modifies antitumor immunity. Phytomedicine. 111, 154672 (2023).
- Chen, D., Zhao, J., Cong, W. Chinese herbal medicines facilitate the control of chemotherapy-induced side effects in colorectal cancer: Progress and perspective. Front Pharmacol. 9, 1442 (2018).
- Wang, M., Wang, S., Su, Q., Ma, T. Effect of combining early chemotherapy with Zhipu Liujunzi decoction under the concept of strengthening and consolidating body resistance for gastric cancer patients and nursing strategy. Contrast Media Mol Imaging. 2021, 2135924 (2021).
- Lin, Y., Koumba, M. H., Qu, S., Wang, D., Lin, L. Blocking NFATc3 ameliorates azoxymethane/dextran sulfate sodium induced colitis-associated colorectal cancer in mice via the inhibition of inflammatory responses and epithelial-mesenchymal transition. Cell Signal. 74, 109707 (2020).
- Yu, C. T., et al. Identification of significant modules and targets of Xian-Lian-Jie-Du decoction based on the analysis of transcriptomics, proteomics and single-cell transcriptomics in colorectal tumor. J Inflamm Res. 15, 1483-1499 (2022).
- Lin, L., Wang, D., Qu, S., Zhao, H., Lin, Y. miR-370-3p alleviates ulcerative colitis-related colorectal cancer in mice through inhibiting the inflammatory response and epithelial-mesenchymal transition. Drug Des Devel Ther. 14, 1127-1141 (2020).
- Qiu, X., Ma, J., Wang, K., Zhang, H. Chemopreventive effects of 5-aminosalicylic acid on inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer and dysplasia: a systematic review with meta-analysis. Oncotarget. 8 (1), 1031-1045 (2017).
- Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 249, 112426 (2020).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Gok, A., et al. Role of reduced Bdnf expression in novel Apc mutant allele-induced intestinal and colonic tumorigenesis in mice. In Vivo. 37 (4), 1562-1575 (2023).
- Lin, Y., et al. Pou3f1 mediates the effect of Nfatc3 on ulcerative colitis-associated colorectal cancer by regulating inflammation. Cell Mol Biol Lett. 27 (1), 75 (2022).
- Xu, W., Zhao, R., Yuan, B. The therapeutic effect of traditional LiuJunZi decoction on ovalbumin-induced asthma in Balb/C mice. Can Respir J. 2021, 6406295 (2021).
- Kaihara, T., et al. Redifferentiation and ZO-1 reexpression in liver-metastasized colorectal cancer: possible association with epidermal growth factor receptor-induced tyrosine phosphorylation of ZO-1. Cancer Sci. 94 (2), 166-172 (2003).
- Lei, H. T., et al. Ki67 testing in the clinical management of patients with non-metastatic colorectal cancer: Detecting the optimal cut-off value based on the restricted cubic spline model. Oncol Lett. 24 (6), 420 (2022).
- Olén, O., et al. Colorectal cancer in ulcerative colitis: a Scandinavian population-based cohort study. Lancet. 395 (10218), 123-131 (2020).
- Arnold, M., et al. Global patterns and trends in colorectal cancer incidence and mortality. Gut. 66 (4), 683-691 (2017).
- Biller, L. H., Schrag, D. Diagnosis and treatment of metastatic colorectal cancer: A review. Jama. 325 (7), 669-685 (2021).
- Talero, E., et al. Expression patterns of sirtuin 1-AMPK-autophagy pathway in chronic colitis and inflammation-associated colon neoplasia in IL-10-deficient mice. Int Immunopharmacol. 35, 248-256 (2016).
- Qian, Z., et al. Mulberry fruit prevents LPS-induced NF-κB/pERK/MAPK signals in macrophages and suppresses acute colitis and colorectal tumorigenesis in mice. Sci Rep. 5, 17348 (2015).
- Pothuraju, R., et al. Depletion of transmembrane mucin 4 (Muc4) alters intestinal homeostasis in a genetically engineered mouse model of colorectal cancer. Aging. 14 (5), 2025-2046 (2022).
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617 (2012).
- Zeng, B., et al. Dextran sodium sulfate potentiates NLRP3 inflammasome activation by modulating the KCa3.1 potassium channel in a mouse model of colitis. Cell Mol Immunol. 19 (8), 925-943 (2022).
- Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S.
- Tanaka, T., et al. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9 (2011).
- Song, J. L., et al. Dietary mixed cereal grains ameliorate the azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colonic carcinogenesis in C57BL/6J mice. J Med Food. 23 (4), 440-452 (2020).
- Zou, Y. F., et al. Effects of Huaier extract on ameliorating colitis-associated colorectal tumorigenesis in mice. Onco Targets Ther. 13, 8691-8704 (2020).
- Luo, X., et al. Obacunone reduces inflammatory signalling and tumour occurrence in mice with chronic inflammation-induced colorectal cancer. Pharm Biol. 58 (1), 886-897 (2020).
- Dai, Y., et al. Liujunzi Decoction ameliorated cisplatin-induced anorexia by inhibiting theJAK-STAT signaling pathway and coordinating anorexigenic and orexigenic neuropeptides in rats. J Ethnopharmacol. 285, 114840 (2022).
- Ghosh, D., Dutta, A., Kashyap, A., Upmanyu, N., Datta, S. PLP2 drives collective cell migration via ZO-1-mediated cytoskeletal remodeling at the leading edge in human colorectal cancer cells. J Cell Sci. 134 (18), jcs253468 (2021).
- Yan, S., et al. Berberine regulates short-chain fatty acid metabolism and alleviates the colitis-associated colorectal tumorigenesis through remodeling intestinal flora. Phytomedicine. 102, 154217 (2022).
- Ma, Y. L., et al. Immunohistochemical analysis revealed CD34 and Ki67 protein expression as significant prognostic factors in colorectal cancer. Med Oncol. 27 (2), 304-309 (2010).
