Mapeo de interacciones proteína-proteína disfuncionales en la enfermedad

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la captura e identificación de interacciones proteína-proteína específicas de la enfermedad de células y tejidos nativos utilizando sondas químicas y espectrometría de masas. Los conjuntos de datos de interacción resultantes se analizan a través de una plataforma web dedicada para revelar disfunciones dinámicas de la red y alteraciones de la vía relacionadas con la enfermedad.

Resumen

Las redes de interacción proteína-proteína (IBP) se remodelan dinámicamente en la enfermedad, sin embargo, la mayoría de los enfoques de biología de sistemas se centran en los cambios en la abundancia de proteínas, pasando por alto la disfunción crítica del nivel de interacción. Aquí, presentamos un método quimioproteómico robusto, el interactoma proteico-proteína disfuncional (dfPPI), que permite un mapeo contextual de la enfermedad sistemático y de alto rendimiento de las disfunciones de la red PPI en células y tejido humano primario. Este método integra sondas de biología química que capturan selectivamente ensamblajes de interactoma basados en epichaperoma con cromatografía líquida sin etiquetas-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) y análisis computacional basado en redes, para descubrir el recableado de redes de proteínas que no son evidentes solo a partir de datos transcriptómicos o proteómicos. La plataforma dfPPI se puede aplicar en estados de enfermedad, especies y tejidos para identificar nodos procesables de disfunción y permitir información de alta resolución a nivel de sistemas sobre la progresión de la enfermedad. En este protocolo, demostramos procedimientos paso a paso para la preparación de muestras, el tratamiento de sondas químicas, el enriquecimiento por afinidad, el análisis LC-MS/MS sin etiquetas y los flujos de trabajo bioinformáticos utilizados para generar e interpretar conjuntos de datos de dfPPI. Este artículo tiene como objetivo promover la reproducibilidad y accesibilidad de este enfoque, apoyando su adopción por parte de las comunidades más amplias de biología de sistemas e investigación traslacional.

Introducción

La función de las células, y por extensión de los organismos, depende de la coordinación precisa de las redes de interacción proteína-proteína (IBP) ^1,2. Estas redes son responsables de organizar y ejecutar casi todos los procesos biológicos. Si bien las redes de IBP son inherentemente dinámicas y responden al estrés, en la enfermedad pueden reconfigurarse de manera anormal, lo que lleva a funciones desadaptativas. Es importante destacar que este recableado no implica necesariamente cambios en la expresión de genes o proteínas; más bien, surge de interacciones físicas alteradas entre proteínas que de otro modo se expresan normalmente ^3,4,5. Los enfoques tradicionales en biología de sistemas, como la transcriptómica o la proteómica, no logran capturar estos cambios críticos a nivel de interacción.

Las tecnologías de mapeo PPI han avanzado significativamente, ofreciendo información sobre la organización y regulación de las redes celulares 6,7,8,9,10,11. Los enfoques comúnmente utilizados, incluida la espectrometría de masas de purificación por afinidad (AP-MS), la reticulación (XL)-MS, el etiquetado de proximidad y el cofraccionamiento, ofrecen ventajas específicas, como alta especificidad, resolución espacial o la capacidad de detectar complejos transitorios 6,8,9,10,11 . Sin embargo, estos métodos a menudo requieren proteínas de cebo, manipulación genética o bioinformática compleja, y pueden tener dificultades para capturar el recableado a gran escala de las redes de proteínas impulsado por enfermedades en sistemas biológicos nativos 6,7,8,9,10,11 . La mayoría también carece de escalabilidad, lo que los hace poco prácticos para analizar cohortes de muestras grandes o mapear sistemáticamente los cambios en el interactoma a través de condiciones, tipos de células o puntos de tiempo 6,7,8,9,10,11 (Tabla 1).

Para abordar esta brecha, desarrollamos la plataforma disfuncional Protein-Protein Interactome (dfPPI), un método quimioproteómico que identifica directamente las disfunciones de la red PPI responsables de los fenotipos de la enfermedad¹². Aprovecha una idea biológica clave: en los estados de enfermedad, un subconjunto de chaperonas moleculares forman andamios supramoleculares llamados epichaperomas 13,14,15. Estas estructuras no actúan en el plegamiento de proteínas, sino que funcionan como centros de interacción de andamiaje que reorganizan la conectividad de proteínas³. Fundamentalmente, las proteínas secuestradas en epichaperomas no son aleatorias; son los que participan activamente en el mantenimiento del fenotipo de la enfermedad 16,17,18,19,20. Al capturar estas proteínas unidas al epichaperoma y sus interactores, dfPPI identifica las alteraciones exactas de la red que impulsan estados específicos de la enfermedad. El recableado de la red impulsado por epichaperome prevalece en todas las enfermedades, la mayoría en cohortes de enfermedad de Alzheimer y ~ 70% en muestras de cáncer^16,20, lo que respalda la aplicabilidad de dfPPI a grandes estudios centrados en enfermedades.

La plataforma dfPPI abarca todo el flujo de trabajo, desde la preparación de muestras, la captura de afinidad de epichaperomas y la identificación de interactomas por MS, hasta los análisis bioinformáticos posteriores, como el enriquecimiento de vías y el modelado de redes de proteínas funcionales (Figura 1). El método utiliza sondas químicas específicas del epichaperoma inmovilizadas en matrices de afinidad (perlas de PU u otras sondas)13,16,17 para aislar el interactoma funcional de células o tejidos. Estas sondas ya han sido rigurosamente validadas en múltiples publicaciones por su especificidad para los epichaperomas y la idoneidad para dfPPI 16,17,18,20,21,22^. Los complejos capturados se someten a MS, utilizando flujos de trabajo de digestión en perlas y en gel, seguidos de LC-MS/MS sin etiquetas. Los datos resultantes se pueden analizar a través de una línea bioinformática dedicada que define la disfunción a nivel de interacción y la vincula a procesos biológicos y fenotipos. Debido a que los epichaperomas andamian los interactomas específicos del contexto 17,18,20, dfPPI revela cómo se remodelan las redes de proteínas en una enfermedad, tipo de célula o etapa en particular, lo que lo convierte en una poderosa herramienta de biología de sistemas para el fenotipado de precisión.

El método es altamente escalable y se ha aplicado a cientos de muestras clínicas y experimentales, incluyendo tejido humano post-mortem y células cultivadas, en diversas enfermedades como el cáncer y la neurodegeneración 16,17,18,19,20,22,23. Al descubrir los cambios en el IBP que definen un estado patológico, el IPPP permite tanto el conocimiento mecanicista como el descubrimiento de dianas terapéuticas procesables 16,17,18,19,20,22,23.

En este protocolo, describimos en detalle los componentes experimentales de la plataforma dfPPI, desde la captura de afinidad de los interactomas unidos al epichaperoma hasta la preparación de muestras para LC-MS/MS y la identificación del interactoma a través de MS. La tubería de análisis computacional, es decir, lo que se hace con la lista de proteínas identificadas por MS para definir interacciones diferenciales y consecuencias funcionales, no se cubre aquí debido a limitaciones de espacio. Sin embargo, es de libre acceso y está ampliamente documentado a través de la aplicación dfPPI Shiny en https://epichaperomics.mskcc.org (actualizada a https://dfppi.mskcc.org) y a través del sitio web de Chiosis Lab en https://www.chiosislab.com/resources. Además de estos portales, la línea completa de bioinformática y los guiones que la acompañan se incluyen en varias publicaciones que aplican dfPPI al cáncer 16,17,19 y la enfermedad de Alzheimer ^18,20.

Protocolo

El protocolo sigue las pautas del comité de ética de investigación en humanos y el comité de cuidado y uso de animales de nuestra institución. El equipo y los reactivos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación de muestras para la captura de afinidad

1. Extracción de proteínas de tejidos
   NOTA: Este protocolo se ha optimizado para muestras de tejido cerebral post-mortem.
   1. Prepare un tampón de extracción de proteínas que contenga 20 mM de Tris (pH 7,5), 20 mM de KCl, 5 mM de MgCl₂ y 0,01% de NP-40 (tampón de lisis nativo). Agregue inhibidores de proteasa y fosfatasa inmediatamente antes de su uso. Mantenga el tampón en hielo.
   2. Coloque el tejido congelado (volumen objetivo de aproximadamente 50 mm³) en un tubo homogeneizador de microtejidos, que consiste en un tubo de microcentrífuga especializado de 1,5 ml equipado con un mortero. Agregue 500-700 μL de tampón de lisis nativo, ajustando el volumen en función de la compacidad del tejido y la facilidad de homogeneización. Homogeneice la muestra en hielo moviendo suavemente el mortero hacia arriba y hacia abajo y contra las paredes abrasivas del tubo homogeneizador hasta que se forme una suspensión homogénea.
      NOTA: Realice todos los pasos en hielo para mantener los ensamblajes de proteínas en su configuración nativa y evitar la degradación de proteínas.
   3. Incubar lisados a 4 °C durante 30 min colocando el vial en una unidad de rotación. Mezcle suavemente las muestras durante la incubación mediante rotación.
   4. Centrifugar las muestras a 13.000 × g durante 10 min a 4 °C utilizando una centrífuga de sobremesa para eliminar los residuos.
   5. Recoja los sobrenadantes y transfiéralos a tubos transparentes de microcentrífuga de 1,5 ml. Evite perturbar el pellet durante la transferencia.
   6. Determine la concentración total de proteínas en el sobrenadante utilizando el kit de ensayo de ácido bicinconínico (BCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Los lisados de proteínas se pueden almacenar a -80 °C hasta su uso. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. Consulte una publicación anterior²⁴ para conocer el impacto de los ciclos repetidos de congelación-descongelación y la temperatura de almacenamiento en la integridad de los ensamblajes de proteínas.
2. Normalización de muestras
   NOTA: HSP90α y HSP90β son componentes centrales del epichaperoma y son los socios de unión directa de la sonda química utilizada para la captura del interactoma 13,21,23. La normalización de las muestras basadas en HSP90α (o HSP90β) garantiza que la cantidad de epichaperoma objetivo de la sonda coincida entre las muestras, lo cual es esencial para una comparación precisa de los interactomas capturados. Las muestras se pueden normalizar en función de los niveles de HSP90 determinados por Western blot, pero también se pueden usar otros métodos. Si los niveles de HSP90 son comparables entre las muestras, omita esta sección y continúe con el paso 1.3. El uso de transferencia HSP90α / β aquí es solo para la normalización de entrada y no debe interpretarse como una medida de abundancia de epichaperoma.
   1. Prepare un tampón de muestra Laemmli 2× compuesto por dodecil sulfato de sodio (SDS) al 4%, glicerol al 20%, 2-mercaptoetanol al 10%, azul de bromofenol al 0,02% y Tris-HCl al 0,125 M, pH ~6,8.
      PRECAUCIÓN: El 2-mercaptoetanol es tóxico y volátil y debe manipularse en una campana extractora.
   2. Combine 5 μg del extracto total de proteína cerebral (del paso 1.1) 1:1 (v/v) con 2× tampón de muestra Laemmli en un tubo de microcentrífuga transparente de 1,5 ml.
   3. Calentar las muestras a 95 °C durante 3-5 min en una unidad de calentamiento para desnaturalizar las proteínas antes de cargarlas en electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE).
   4. Cargue las muestras en geles de proteína prefabricados de Tris-Glicina al 8%. Alternativamente, use geles moldeados a mano.
   5. Cargue 5 μL de estándar de proteína preteñido en cada gel, por ejemplo, en el primer pocillo, para determinar el peso molecular de la proteína.
   6. Ejecute los geles en 1× TGS (Tris-Glycine-SDS) funcionando tampón a RT. El tiempo de ejecución típico es de 1,5-2 h a 100 V.
   7. Prepare un tampón de transferencia que contenga 25 mM de Tris, 192 mM de glicina y 20% de metanol.
      PRECAUCIÓN: El metanol es inflamable y debe manipularse según las pautas de seguridad.
   8. Transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa en tampón de transferencia a 4 °C durante 60 min a voltaje constante (100 V).
   9. Prepare una solución de lavado de membrana (1× TBS-0.1% Tween-20) y una solución de bloqueo (leche al 5% en 1× TBS-0.1% Tween-20). Este protocolo utiliza leche en polvo descremada en polvo de una fuente comercial.
   10. Coloque la membrana en una solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente (RT) con una agitación suave sobre un balancín de plataforma. Use 10 ml de solución bloqueante por mini gel.
   11. Retire la solución de bloqueo e incube la membrana con el anticuerpo anti-HSP90α (dilución 1:6.000 en 10 ml de solución de bloqueo) durante la noche a 4 °C en un balancín de plataforma.
   12. Retire la solución de anticuerpos y lave la membrana tres veces durante 5 minutos cada una con 10 ml de solución de lavado.
   13. Agregue el anticuerpo secundario anti-conejo de cabra conjugado con HRP (dilución 1:5,000 en 10 ml 1× TBS-0.1% Tween-20) e incube durante 1 h a RT en un balancín de plataforma.
   14. Retire el anticuerpo secundario y lave la membrana cuatro veces con solución de lavado (mismo volumen y tiempo que el anterior).
   15. Detecte la señal quimioluminiscente específica de HSP90α utilizando un kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice un sistema de imágenes de quimioluminiscencia o una película autorradiográfica.
   16. Cuantifique los niveles de HSP90α en las muestras en función de la intensidad de la señal y calcule un factor de normalización para el pull-down aguas abajo.
       NOTA: La intensidad de la señal HSP90 refleja la cantidad de epichaperoma que se puede dirigir a la sonda en cada muestra. Al comparar la intensidad de la señal entre muestras y normalizar a una muestra de referencia en cada gel, los volúmenes de entrada para la captura de interactoma se pueden ajustar en consecuencia. La cuantificación se puede realizar mediante software de densitometría. Incluya siempre una alícuota de una muestra de referencia en cada gel para permitir la normalización en todas las manchas.
3. Preparación de perlas de PU
   NOTA: Las perlas de PU y las perlas de control se pueden sintetizar internamente como se informó anteriormente^21,25 o se pueden solicitar al laboratorio de Chiosis tras la ejecución de un acuerdo de transferencia de material (MTA). Deben almacenarse a -20 °C en isopropanol.
   1. Tome una alícuota de perlas de poliuretano (PU) o perlas de control directamente del stock de isopropanol. Incluya aproximadamente un 30% de exceso para tener en cuenta la pérdida de perlas durante el lavado y la manipulación.
   2. Retire el disolvente de almacenamiento: deje que las perlas se asienten, luego aspire el isopropanol. Agregue tampón de lisis nativo (1 ml para un tubo de 1,5 ml; 5 ml para un cónico de 15 ml) y vuelva a suspender completamente mediante un pipeteo suave o una inversión.
   3. Lavar y equilibrar tres veces: para cada lavado, vórtice para volver a suspender, centrifugar (tubo de 1,5 ml: 10.000 × g, 1 min; 15 ml cónicos: 3.000 × g, 5 min), luego aspirar el sobrenadante con una línea de vacío equipada con una punta de pipeta, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
   4. Agregue tampón de lisis nativo a las perlas lavadas en una proporción de volumen de 1: 1 (perlas: tampón) para generar una suspensión de perlas de trabajo uniforme.
   5. Alícuota de 40 μl de lodo de perlas de PU (o perlas de control) (p. ej., perlas de 1:1 v/v: tampón) por muestra en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilice una punta de pipeta con el extremo cortado para permitir una fácil dispensación de las perlas.
      NOTA: Las perlas de PU son sensibles a la luz. Use tubos oscuros o envueltos en papel de aluminio de 1.5 ml durante los pasos desplegables. Debido a su recubrimiento superficial hidrofóbico con el aglutinante epichaperoma de molécula pequeña, las perlas de PU tienden a agruparse y adherirse a las superficies de plástico. Pipetear suavemente y mezclar bien para asegurar una resuspensión uniforme. Es fundamental dispensar volúmenes iguales de lechada de perlas en cada muestra para evitar la variabilidad en la captura de proteínas, lo que puede dar lugar a resultados inconsistentes o no reproducibles.
   6. Lave las perlas tres veces con tampón de lisis nativo agregando 1 ml de tampón a cada tubo, centrifugando en vórtice, centrifugando a 10,000 × g durante 1 min y desechando el sobrenadante por aspiración. Asegúrese de que las perlas estén completamente suspendidas entre cada lavado.
      NOTA: Al aspirar, evite tocar las perlas. Presione suavemente la punta de la pipeta contra la pared del tubo mientras retira el líquido.
   7. Después del lavado final, retire la mayor parte del líquido de los tubos, teniendo cuidado de no alterar el gránulo de perlas.
      NOTA: Las perlas lavadas se pueden almacenar a 4 °C durante unos días. Por lo general, las cuentas se usan dentro de 1-2 días después de la preparación.
4. Pull-down de interactoma
   NOTA: El primer paso del pull-down es un paso previo a la limpieza utilizando perlas de control, que se conjugan con una pequeña molécula inerte que no se une a los epichaperomas¹⁶. Este paso elimina las proteínas, los agregados y los desechos insolubles que interactúan de manera no específica del lisado, mejorando así la especificidad de la posterior extracción de perlas de PU. La limpieza previa reduce la unión de fondo y mejora la detección de proteínas específicas asociadas al epichaperoma.
   El interactoma recuperado por este protocolo es analizado por MS, que es altamente sensible a los contaminantes experimentales. Para garantizar una identificación precisa de las proteínas y preservar la calidad de los datos, utilice siempre tampones y reactivos recién preparados, minimice la exposición al polvo y la queratina, y use guantes limpios y sin polvo cuando manipule muestras, consumibles o equipos. Use cristalería/consumibles dedicados a MS para todos los pasos de digestión desplegables y en gel, y mantenga físicamente separados los artículos utilizados para Western blot. Si reutiliza cristalería, descontamine enjuagando secuencialmente con metanol al 100%, agua ultrapura, ácido acético al 80%, agua ultrapura y luego seque al aire. No use detergentes; incluso los residuos traza pueden ensuciar las columnas de LC y las fuentes de iones.
   1. Agregue los extractos de proteínas normalizados (según el paso 1.2, calculado en función de la intensidad de transferencia HSP90) a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 ml que contengan 40 μl de la suspensión de perlas de control (es decir, 20 μl de perlas + 20 μl de tampón) y ajuste el volumen final a 250 μl agregando el volumen apropiado de tampón de lisis nativo.
      NOTA: Para determinar los volúmenes de entrada específicos de la muestra, utilice la fórmula A1 = (60 / C1) × X1, donde A1 es el volumen de proteína total normalizada que se va a agregar (μL), C1 es la concentración de proteína medida (μg/μL) y X1 es el factor de normalización derivado de la transferencia HSP90 (como se describe en el paso 1.2). El volumen de tampón adicional que se va a añadir se calcula como 250 μL menos A1. Si no es necesaria la normalización, use 250 μg de proteína total en 250 μL.
   2. Incubar las muestras a 4 °C durante 30 min con rotación en un rotador de extremo a extremo (10-15 rpm).
   3. Centrifugar los tubos a 10.000 × g durante 1 min a 4 °C para granular las perlas de control junto con la proteína agregada o insoluble.
   4. Recoja cuidadosamente el sobrenadante de las perlas de control con una pipeta de 1 ml y transfiéralo a tubos de 1,5 ml que contengan 40 μl de la suspensión de perlas de PU lavadas.
   5. Incubar las muestras a 4 °C durante 3 h con rotación en un rotador de extremo a extremo (10-15 rpm).
   6. Centrifugar cada tubo a 10.000 × g durante 1 min, aspirar el sobrenadante y lavar las perlas cuatro veces con 1 ml de tampón de lisis nativo. Para cada lavado: vórtice, centrifugación y aspiración, utilizando los parámetros descritos en el paso 1.3.
      NOTA: En esta etapa, las muestras se pueden procesar para LC-MS / MS utilizando uno de dos flujos de trabajo: (1) SDS-PAGE seguido de digestión en gel o (2) digestión en perla de las proteínas capturadas.
      Para el flujo de trabajo de digestión en gel, continúe con el protocolo tal como está escrito. Para la digestión en perlas, lave las perlas dos veces más con PBS frío y proceda inmediatamente a la Sección 3. No congele las perlas si continúa con la digestión en perlas; Las muestras deben procesarse frescas el mismo día. La congelación de complejos de proteínas unidas a perlas puede afectar la eficiencia de la digestión al promover la agregación o pérdida de solubilidad de proteínas, lo que lleva a una menor recuperación de péptidos y una mayor variabilidad. Según las recomendaciones básicas de MS, las muestras deben procesarse frescas el mismo día para garantizar una digestión constante en perlas.
5. Preparación de muestras para la digestión en gel
   1. Agregue 25 μL de tampón de muestra Laemmli al 2× a las muestras de perlas preparadas en el paso 1.4.6, que están contenidas en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: Las muestras en este punto se pueden almacenar a -80 °C durante un máximo de 24 h. Cargue siempre todo el volumen de muestra en el gel SDS-PAGE para la digestión en el gel para maximizar la cobertura del proteoma y garantizar una representación completa del interactoma. No se recomienda la carga parcial. Si el volumen de la muestra es limitado y la carga parcial es inevitable, el material restante debe almacenarse en alícuotas para minimizar los ciclos de congelación-descongelación y preservar la integridad del interactoma.
   2. Calentar cada muestra a 95 °C durante 3 min (con el tampón de muestra Laemmli de 2× añadido, como se indicó anteriormente) para desnaturalizar los complejos proteicos y eluirlos de las perlas antes de cargarlos en SDS-PAGE. La SDS y los agentes reductores en el tampón alteran los IBP y liberan proteínas de la matriz.
   3. Centrifugar cada tubo a 10.000 × g durante 1 min a RT.
   4. Cargue cada sobrenadante en geles SDS-PAGE de gradiente prefabricados al 4-20%.
   5. Ejecute los geles en 1× tampón de funcionamiento TGS a RT y detenga la ejecución a la mitad (~ 3,5-4 cm en el gel a 100 V, generalmente 30-60 minutos de tiempo de ejecución).
   6. Retire el gel de la unidad de electroforesis y proceda a teñir con Coomassie azul brillante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: El gel teñido, sumergido en 5-7 ml de agua ultrapura en un recipiente de plástico, se puede transportar a las instalaciones de MS para la identificación de proteínas. Si no se procesa inmediatamente, almacenar a 4 °C en agua ultrapura durante un máximo de 1-2 semanas. Se utilizaron dos flujos de trabajo proteómicos alternativos según la instalación central que realizó el trabajo y los objetivos experimentales: la sección 2 describe la digestión en gel seguida de un análisis de MS de adquisición independiente de datos (DIA) utilizando un espectrómetro de masas orbitrap cuadrupolar; La sección 3 detalla un protocolo de digestión en perla optimizado para espectrometría de movilidad de iones atrapados con fragmentación en serie de acumulación paralela (diaPASEF)²⁶. Los pasos pueden ser referenciados cuando corresponda.

2. Identificación de proteínas por LC-MS / MS con digestión de proteínas en gel

1. Reducción y alquilación en gel de proteínas cisteiniladas
   1. Extirpe la región teñida de cada carril de gel teñido con Coomassie y córtelo en aproximadamente cinco rodajas de gel del mismo tamaño. Elimine cada rebanada incubándola tres veces en 500 μl de metanol al 50% (v/v) durante 1 min a 37 °C con agitación a 700 rpm en un agitador de microtubos con temperatura controlada.
      NOTA: Cada rebanada de gel no debe ser mayor de ~ 1 cm × 0,5 cm × 1 cm para garantizar una difusión eficiente de los reactivos en los pasos posteriores, así como una digestión eficiente de la tripsina en gel durante la noche. Extirpe la región del gel correspondiente a proteínas muy teñidas, como HSP90 y HSC70, que representan aglutinantes directos de la sonda química y los componentes centrales del epichaperoma 15,16,23, por separado del resto del gel. De lo contrario, su alta abundancia puede interferir con la detección y cuantificación de interactores de menor abundancia durante el análisis de LC-MS/MS.
   2. Incube cada rebanada de gel en 500 μL de bicarbonato de amonio (ABC) 5 mM preparado en acetonitrilo (ACN) al 30% a 37 °C agitando a 700 rpm en un agitador de microtubos con temperatura controlada durante 15 min para eliminar la mancha residual. Repita la incubación hasta que la rodaja de gel esté completamente manchada.
      NOTA: Cualquier tinción de proteína visible restante puede interferir con la unión del péptido a la matriz C18 durante el paso de limpieza del péptido, lo que reduce la recuperación y la sensibilidad de la EM aguas abajo.
   3. Retire y deseche la solución ABC/ACN con una pipeta de punta fina, teniendo cuidado de no perder las piezas de gel (es decir, no aspire las piezas de gel junto con el líquido). A continuación, añade 500 μL de ACN al 100% a cada tubo, asegurándote de que las piezas de gel estén completamente sumergidas. Incube a temperatura ambiente en un agitador orbital a 700 rpm durante 10 minutos, o hasta que las piezas de gel se vuelvan translúcidas, se reduzcan de tamaño y adquieran la apariencia de papel blanco.
      PRECAUCIÓN: El ACN es inflamable y debe manipularse en una campana extractora.
   4. Retire y deseche el ACN de cada tubo con una pipeta de punta fina, teniendo cuidado de no aspirar trozos de gel. Centrifugar brevemente a 1.000 × g durante 10 s para recoger el líquido residual y aspirar cuidadosamente las gotas restantes con una pipeta de punta fina. Coloque los tubos abiertos en una centrífuga de vacío a temperatura ambiente durante 10-15 min, o hasta que las rodajas de gel estén secas y rígidas.
      NOTA: No seque demasiado. Verifique periódicamente para evitar grietas o contracción excesiva de las piezas de gel. Una vez secos, almacenar las piezas de gel a 4 °C en un tubo sellado de baja unión o en un tubo de microcentrífuga hasta la digestión; las proteínas ligadas al gel y purificadas son estables hasta varios días cuando se mantienen a 4 °C.
   5. Reducción: Agregue ~ 100 μL de ditiotreitol (DTT) de 10 mM (preparado fresco a partir de 500 mM de existencias en bicarbonato de amonio de 50 mM) a cada tubo de muestra, asegurando que las piezas de gel estén completamente sumergidas. Incubar a 56 °C durante 45 min con agitación a 700 rpm en un agitador de microtubos con temperatura controlada.
      PRECAUCIÓN: La DTT es un irritante para la piel y las vías respiratorias. Manipule dentro de una campana extractora de productos químicos y use guantes.
      NOTA: Asegúrese de que los tubos estén bien cerrados durante la incubación para evitar la evaporación y mantener la concentración de DTT.
   6. Alquilación: Retire la solución de DTT de cada tubo con una pipeta de punta fina, teniendo cuidado de no alterar las piezas de gel. Agregue inmediatamente ~ 100 μL de yodoacetamida (IAA) 55 mM en 50 mM ABC para cubrir completamente las rodajas de gel. Incubar a temperatura ambiente con agitación a 700 rpm durante 30 min en la oscuridad.
      PRECAUCIÓN: El IAA es tóxico y sensible a la luz. Realice todo el manejo en una campana extractora con guantes.
      NOTA: Asegúrese de eliminar completamente el DTT antes de agregar IAA para evitar que se enfríe la reacción de alquilación. Envuelva los tubos en papel de aluminio o use recipientes que bloqueen la luz durante la incubación para minimizar la degradación de IAA.
   7. Centrifugar los tubos brevemente a 1.000 × g durante 5 s a RT para recoger el líquido residual en el fondo. Retire con cuidado el sobrenadante con una punta de pipeta de diámetro fino (por ejemplo, punta P10) para evitar alterar las piezas de gel. Incline ligeramente el tubo y aspire desde el borde para minimizar el riesgo de aspirar fragmentos de gel.
   8. Equilibrar: Cubrir las piezas de gel con 500 μL de 50 mM ABC en 30% de ACN. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, agitando a 700 rpm en un agitador orbital calentado. Este paso ayuda a eliminar el exceso de reactivo de alquilación y equilibra el gel antes de la deshidratación.
   9. Retirar la solución: Centrifugar brevemente a 1.000 × g durante 5 s y desechar el sobrenadante con una pipeta de punta fina, como se ha descrito anteriormente.
   10. Deshidratar de nuevo: Repita los pasos 2.1.3 y 2.1.4 para volver a deshidratar las piezas de gel utilizando ACN al 100% seguido de centrifugación al vacío hasta que se sequen. Este paso asegura una recuperación óptima de los péptidos durante la digestión enzimática.
2. Proteólisis en gel y limpieza de péptidos
   1. Digestión de las muestras de gel seco añadiendo tripsina de grado MS a una concentración final de 5 ng/μL en 50 mM ABC para rehidratar completamente las piezas de gel (normalmente 50-100 μL de volumen total, o suficiente para cubrir las rodajas de gel). Incube durante la noche a 37 °C en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, asegurándose de que los tubos estén bien sellados para evitar la evaporación. Agite suavemente si es posible (por ejemplo, 300 rpm en un agitador de microtubos con temperatura controlada).
   2. Acidifique la muestra después de la digestión nocturna agregando ácido fórmico (FA) al 10% gota a gota para lograr una concentración final del 1% (v/v) (por ejemplo, agregue 1 μL de FA al 10% a 100 μL de digestión). Mezclar suavemente, luego sonicar los tubos durante 10 min en un sonicador de baño de agua RT para mejorar la extracción de péptidos.
   3. Retire con cuidado el sobrenadante que contiene péptidos con una pipeta de punta fina (p. ej., punta de orificio estrecho P10), teniendo cuidado de no alterar la matriz de gel ni aspirar fragmentos de gel. Transfiera el sobrenadante recolectado a un tubo de 500 μL de baja unión y colóquelo en hielo.
   4. Agregue una solución de FA al 5% / 50% de ACN (v / v) a cada tubo (generalmente ~ 50-100 μL, o lo suficiente para cubrir completamente las piezas de gel) y agite suavemente a temperatura media (por ejemplo, en un agitador a 70 rpm durante 10-15 min) para extraer los péptidos residuales. Recoja cuidadosamente el sobrenadante y combínelo con la solución peptídica original del paso 2.2.3.
   5. Concéntrese el extracto peptídico combinado mediante centrifugación al vacío a temperatura ambiente (por ejemplo, 1.000 × g durante ~30 min) hasta que solo quede una pequeña gota. No permita que la muestra se seque por completo, ya que esto puede causar pérdida de péptidos debido a la adherencia a las paredes del tubo. Utilice el extracto parcialmente seco inmediatamente para la desalinización o guárdelo a -20 °C en un tubo sellado y de baja unión.
   6. Desalar los péptidos utilizando puntas de pipeta envasadas a pequeña escala a pequeña escala (es decir, StageTips) preparadas con dos discos de extracción de C18 apilados insertados en una punta de pipeta de 200 μl, como se describió anteriormente²⁷, con las siguientes modificaciones:
   7. Active los discos C18 añadiendo 40 μL de metanol. Centrifugar la punta de pipeta que contiene los discos (insertada en una punta de pipeta vacía de 200 μL y colocada dentro de un tubo de 500 μL) utilizando una centrífuga de sobremesa a 1.500 × g durante 3 min.
      NOTA: En todos los pasos, no permita que los discos C18 se sequen. El secado interferirá con la unión y elución de péptidos. Es posible que sea necesario acortar la punta de pipeta exterior de 200 μL (manguito) que sostiene la punta de pipeta empaquetada C18 a pequeña escala empaquetada a mano cortando ~ 1 cm desde el extremo para garantizar que el conjunto de dos puntas en tubo encaje correctamente en la centrífuga.
   8. Equilibre los discos agregando 0.1% de FA y centrifugando como se indicó anteriormente.
   9. Aplique la solución peptídica, reconstituida en 20 μL de FA al 0,1%, directamente sobre la parte superior de los discos apilados.
   10. Centrifugar a 1.500 × g durante 5 min para facilitar la unión del péptido a los discos C18.
   11. Lave los péptidos unidos pasando 40 μL de FA al 0,1% a través de la columna.
   12. Eluir péptidos con 40 μL de ACN al 70% que contienen 0,1% de FA. Almacenar los péptidos eluidos en tubos de baja unión a -80 °C hasta el análisis LC-MS/MS. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
3. Nano-LC acoplado al análisis MS mediante DIA
   1. Concentre el eluido peptídico desalado mediante centrifugación al vacío (por ejemplo, 20-30 min a temperatura ambiente, 1.000 × g), dejando una pequeña gota. Reconstituya los péptidos en 10 μL de FA al 0,1% en agua de grado LC-MS pipeteando hacia arriba y hacia abajo suavemente y brevemente en vórtice. Gire brevemente para recoger líquido en el fondo del tubo antes de continuar.
   2. Analice alícuotas de 4 μL de la muestra de péptido reconstituido mediante nano-LC-MS/MS. Separe los péptidos en una columna de fase inversa autoempaquetada (75 μm de diámetro interior × 2 cm, resina C18, tamaño de partícula de 3 μm) mantenida a 50 °C. Prepare la columna con una bomba de presión²⁸ envasando una suspensión de resina C18 (en metanol, 1:3 v/v) en un capilar de sílice fundida con una boquilla de pulverización integrada de 10 μm (360 μm de diámetro exterior × 75 μm de diámetro interior × punta de 10 μm). Conecte la columna a través de ionización por nanospray a un espectrómetro de masas híbrido de alta resolución (tipo cuadrupolo Orbitrap) que admita flujos de trabajo DIA.
      NOTA: Se recomienda una longitud de columna de 20 cm, ya que proporciona una separación óptima para las mezclas de péptidos generadas a partir de rodajas de gel SDS-PAGE.
   3. Mantenga la columna analítica a 50 °C utilizando un horno de columna o un bloque calefactor para garantizar una retención y separación constantes de péptidos. Garantice un control de temperatura estable durante toda la ejecución, ya que las fluctuaciones pueden afectar la reproducibilidad.
   4. Eluya péptidos utilizando un gradiente lineal de 3-40% de ACN en 0,1% de FA durante 110 min, a un caudal de 250 nL / min. Este gradiente proporciona una separación eficaz de péptidos antes de la detección de MS. El tiempo total de análisis, incluido el equilibrio de columnas, es de 120 min.
   5. Adquiera datos en modo DIA utilizando un MS de alta resolución, como se describió anteriormente²⁹.
      1. Establezca escaneos topográficos MS1 completos para que se adquieran en modo de perfil a una resolución de 120.000 (a m/z 200), en un rango de escaneo de 300-1650 m/z. Siga cada escaneo MS1 con fragmentación MS2 de 30 ventanas precursoras secuenciales (364-1370 Th) utilizando un esquema de ventana de aislamiento deslizante.
      2. Realice la fragmentación utilizando energías de colisión normalizadas escalonadas de 25,5, 27,0 y 30,0. El estado de carga precursora máximo predeterminado es 4. Establezca la primera masa fija en escaneos MS / MS en 200 Da y adquiera espectros MS2 a una resolución de 30,000.
      3. Utilice un ajuste de tiempo de inyección automático para MS2 y un tiempo de inyección máximo de 60 ms para MS1. Para los escaneos MS1 y MS2, establezca el objetivo de iones (AGC) en 3e6.
4. Cuantificación relativa de los interactomas capturados por afinidad
   NOTA: Para cuantificar las proteínas identificadas en los análisis DIA-MS de los interactomas de epichaperoma capturados por afinidad, utilice una plataforma de software que admita los flujos de trabajo de DIA y proporcione una cuantificación fiable basada en la intensidad de los péptidos o los recuentos espectrales. Este protocolo utilizó MaxQuant (por ejemplo, la versión 2.5.1.0) y su flujo de trabajo MaxDIA^20,29 para la identificación de péptidos/proteínas y la cuantificación basada en la intensidad sin etiquetas. Las búsquedas utilizaron una estrategia de señuelo de secuencia inversa con FDR al 1% a niveles de PSM/péptidos y proteínas; Las entradas "inversas" y "contaminantes potenciales" se filtraron antes de la bioinformática. No se utilizaron picos; la preparación del instrumento se verificó con 250 ng de digestión de HeLa (y una mezcla intermitente de 10 fmol de 6 proteínas) que cumplían con los criterios internos de ID y estabilidad de RT.
   1. Analice los datos DIA-MS sin procesar con parámetros consistentes en todas las muestras. Incluya hasta dos escisiones perdidas y establezca modificaciones de la siguiente manera: fijo, carbamidometilación de cisteína; variable, oxidación de metionina y acetilación de la proteína N-terminal.
   2. Utilice una biblioteca espectral predicha in silico basada en la base de datos de proteínas humanas UniProt (por ejemplo, ~ 20,000 entradas), asegurando que se incluyan secuencias de señuelos y contaminantes para una estimación precisa de la tasa de descubrimiento falso (FDR). Especifique la digestión tríptica a menos que se haya utilizado una enzima alternativa. Una biblioteca espectral humana validada (basada en la versión UniProt del 18/06/2020, 20.956 entradas) está disponible en el repositorio³⁰ del Instituto Max Planck de Bioquímica.
      NOTA: Como alternativa a este flujo de trabajo con bibliotecas predichas, el paso 3.4 ilustra el procesamiento sin bibliotecas, que produjo una identificación y cuantificación comparables en estos conjuntos de datos.
   3. Cuantifique las abundancias de proteínas utilizando valores de intensidad (no intensidades de cuantificación sin etiquetas [LFQ]), ya que son más apropiados para los análisis de redes de PPI posteriores. Asegúrese de que LFQ no esté seleccionada para evitar artefactos de normalización, que pueden distorsionar los datos de enriquecimiento por afinidad. En su lugar, utilice valores de intensidad sin procesar derivados de coincidencias espectrales de péptidos, que reflejan la fuerza de interacción en lugar de la expresión global de proteínas. Aplicar criterios de filtrado apropiados (por ejemplo, mínimo un péptido único por grupo de proteínas) para mejorar la confiabilidad de la identificación y cuantificación de proteínas. Exporte la tabla de intensidad de proteínas resultante para posteriores análisis estadísticos y basados en redes.
      NOTA: A diferencia de los flujos de trabajo proteómicos estándar, donde los valores de LFQ ayudan a normalizar la carga de proteínas en lisados completos, aquí las proteínas se enriquecen mediante la captura de afinidad de los epichaperomas. Este paso de enriquecimiento introduce una variación biológica que la normalización de LFQ puede oscurecer. Por lo tanto, se prefieren los valores de intensidad bruta, ya que reflejan mejor las interacciones diferenciales proteína-epichaperoma en todas las condiciones y conservan la señal necesaria para el análisis a nivel de red posterior (por ejemplo, dfPPI). En estudios anteriores que utilizaron búsquedas basadas en mascotas ^16,18, también se utilizaron valores de recuento espectral de MS / MS en lugar de intensidades. En flujos de trabajo de captura de afinidad como este, los recuentos espectrales reflejan la frecuencia de interacción y son adecuados para identificar proteínas que interactúan diferencialmente en todas las condiciones. A diferencia de los valores de LFQ, los recuentos de MS / MS no asumen una normalización global en todo el proteoma, preservando la varianza biológicamente significativa del paso de enriquecimiento del epichaperoma.

3. Identificación de proteínas por LC-MS / MS con digestión de proteínas en perlas

1. Digestión en perla
   NOTA: Para garantizar una recuperación óptima de proteínas y minimizar la pérdida de muestras durante la digestión de proteínas en perlas para el análisis de MS, es esencial utilizar tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas. Estos tubos están diseñados para reducir la absorción de proteínas en las paredes del tubo, mejorando así la recuperación de muestras. Todos los reactivos utilizados en esta sección deben prepararse recién preparados con agua y productos químicos de grado LC-MS. Si envía muestras a un núcleo de proteómica, verifique las políticas locales, ya que algunas instalaciones pueden requerir que todos los tampones se esterilicen por filtro antes de su uso.
   1. Retire cualquier PBS residual que pueda quedar en el tubo del paso 1.4.6. Vuelva a suspender las perlas en 80 μL de urea 2 M, recién preparadas en 50 mM ABC, pH 8,5. Asegure una mezcla completa mediante pipeteo o vórtice breve.
      NOTA: Ajuste el volumen proporcionalmente en función de la cantidad y el tipo de cordón. Este protocolo está optimizado para 40 μL de lechada de perlas de PU.
   2. Agregue DTT para lograr una concentración final de 1 mM.
      NOTA: Prepare una solución fresca de DTT de 10 mM a partir de una solución madre de DTT de 1 M en agua de grado LC-MS inmediatamente antes de su uso, ya que la DTT es propensa a la oxidación en solución. Añada el volumen necesario directamente a la muestra y mezcle suavemente mediante pipeteo.
   3. Tape el tubo e incube a 37 °C durante 30 min agitando a 1.100 rpm en un agitador orbital calentado. Selle las tapas herméticamente para minimizar la evaporación.
   4. Agregue IAA para alcanzar una concentración final de 3,67 mM. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 45 min agitando a 1.100 rpm.
      NOTA: Prepare un caldo IAA fresco de 10 mM en agua de grado LC-MS inmediatamente antes de usarlo. Añada el volumen necesario a la muestra y mezcle suavemente pipeteando.
   5. Agregue DTT adicional para apagar el IAA sin reaccionar, logrando una concentración final de 3,67 mM. Mezclar suavemente pipeteando.
      NOTA: El enfriamiento del IAA sin reaccionar previene la alquilación excesiva, lo que puede comprometer la actividad de la proteasa y la eficiencia de la digestión. Prepare DTT fresco y calcule el volumen en función del volumen de muestra actual para lograr la concentración objetivo.
   6. Agregue 750 ng de 0,5 mg / ml de proteasa Lys-C de grado MS a la muestra. Incubar a 37 °C durante 1 h agitando a 1.150 rpm.
      NOTA: Prepare Lys-C disolviéndolo en agua de grado LC-MS. Almacene las alícuotas enzimáticas a -80 °C y evite múltiples congelaciones-descongelaciones.
   7. Agregue 750 ng de 0,5 mg / ml de tripsina de grado secuencial recién preparada. Incubar durante la noche a 37 °C agitando a 1.150 rpm. Incubar no más de 16-18 h para evitar la sobredigestión y la degradación de los péptidos.
   8. Al día siguiente, centrifugar la muestra a 1.000-5.000 × g durante 1-5 min a temperatura ambiente y transferir el sobrenadante pipeteando a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml. Desecha las cuentas.
   9. Ajuste el pH de la digestión por debajo de 3 agregando un 50% de ácido trifluoroacético (TFA) gota a gota. Verifique el pH con tiras indicadoras de pH.
      NOTA: El rango de pH típico debe ser ~ 2.5-3.0, y las muestras deben acidificarse antes de la desalinización.
      PRECAUCIÓN: El TFA es corrosivo y volátil. Agregue una campana extractora y use el equipo de protección personal (EPP) adecuado.
2. Desalación de péptidos
   NOTA: Para la desalinización y limpieza de péptidos, utilice puntas de pipeta empaquetadas con C18 a pequeña escala (es decir, StageTips)³¹. Prepare las puntas de etapa C18 empaquetando tres capas de material C18 (por ejemplo, discos de extracción en fase sólida C18) en una punta de pipeta de 200 μl. También se pueden utilizar columnas de centrifugación C18 prefabricadas y disponibles en el mercado. Siga el protocolo del fabricante para el acondicionamiento, la carga de muestras y la elución de péptidos. El rendimiento (por ejemplo, eficiencia de retención, rendimiento de recuperación) puede variar entre dispositivos caseros y comerciales. Las puntas de pipeta empaquetadas con C18 a pequeña escala deben empaquetarse herméticamente para evitar el flujo de derivación.
   1. Acondicione las puntas de pipeta empaquetadas con C18 a pequeña escala secuencialmente con: (1) metanol de 100 μl. Centrifugar a 400 × g y desechar el flujo continuo; (2) 100 μL de 70% de ACN/0,1% de TFA. Centrifugar a 400 × g y desechar el flujo; (3) 100 μL de TFA al 0,1%. Centrifugar a 400 × g y desechar el flujo continuo. Repita este paso dos veces.
      NOTA: El acondicionamiento asegura la humectación completa de la resina hidrofóbica C18. Para las columnas de centrifugación C18 prefabricadas y disponibles en el mercado, también se pueden utilizar colectores de vacío. Los usuarios deben consultar las instrucciones del fabricante para obtener recomendaciones específicas de manejo.
   2. Cargue el digesto de péptidos acidificados en las puntas de pipeta acondicionadas a pequeña escala empaquetadas con C18 pipeteando lentamente la muestra directamente en la punta. Centrifugar a 300 × g para permitir que la digestión pase a través de la resina y desechar el flujo. Si el volumen de la muestra excede la capacidad, cargue en varias rondas.
      NOTA: Pipetee el digest directamente sobre el lecho de resina empaquetado, evitando burbujas de aire. Si utiliza puntas de baja retención, toque la pared interior de las puntas de pipeta empaquetadas en C18 a pequeña escala para liberar el líquido de forma lenta y uniforme.
   3. Pipetee 100 μl de AG al 0,1 % directamente en la punta de pipeta empaquetada con C18 a pequeña escala, asegurando que la solución sature completamente el material C18. Centrifugar a 400 × g y desechar el flujo. Repita este paso dos veces para eliminar las sales y las sustancias que interfieren.
      NOTA: Asegúrese de que el líquido fluya completamente a través del material C18 antes de cada centrifugado. Evite atrapar burbujas de aire dispensando la solución de lavado lentamente por la pared de la punta de la pipeta.
   4. Eluya los péptidos unidos pipeteando 50 μl de ACN al 70 %/FA al 0,1 % en la punta de la pipeta empaquetada con C18 a pequeña escala. Centrifugar a 300 × g y recoger el eluido en un tubo limpio de microcentrífuga de baja unión. Repita este paso dos veces para asegurar una elución completa.
      NOTA: Es posible que se requieran múltiples rondas de centrifugación para recuperar completamente el eluido. Si el líquido residual queda atrapado en la base de la punta, golpee suavemente la punta de la pipeta empaquetada en C18 a pequeña escala o realice breves giros adicionales para recoger el volumen restante. Combine los eluidos y verifique el volumen final antes de continuar.
   5. Congele y seque los péptidos eluidos con un concentrador de vacío hasta que se sequen. Asegúrese de que la tapa esté suelta para permitir la ventilación, pero evite salpicaduras.
   6. Reconstituya los péptidos secos agregando 12 μL de FA al 0,1% en agua de grado LC-MS directamente en el fondo del tubo. Agite suavemente los tubos para disolver completamente los péptidos.
      NOTA: Asegúrese de que todo el pellet o la película seca estén completamente reconstituidos. La disolución basada en pipetas corre el riesgo de pérdida de péptidos debido a la adherencia a las superficies de las puntas.
   7. Sonicar los péptidos reconstituidos durante 5 min en un sonicador de baño lleno de agua fría para asegurar una disolución completa y evitar el sobrecalentamiento.
   8. Centrifugar los péptidos a 20.000 × g a 4 °C durante 10 min. Transfiera el sobrenadante peptídico a un vial de muestreador automático adecuado para cargarlo en el sistema LC-MS. Utilice viales de polipropileno probados en cromatografía de gases (GC) de bajo volumen y alta calidad con tapas de tabique de silicona/politetrafluoroetileno (PTFE) adheridas para minimizar la pérdida de muestras. Etiquete los viales claramente con la identificación de la muestra y el orden de inyección.
   9. Estime la concentración de péptidos usando un espectrofotómetro a 280 nm. Tenga en cuenta que esto es aproximado y puede verse afectado por el contenido de residuos aromáticos o contaminantes. Alternativamente, utilice ensayos de péptidos colorimétricos para una cuantificación más precisa.
3. Parámetros de LC y MS
   NOTA: Los siguientes parámetros de LC y MS están optimizados para el sistema nano-LC acoplado con el espectrómetro de masas utilizado en el protocolo actual. Para otros sistemas nano-LC y espectrómetros de masas, los parámetros deben ajustarse en consecuencia.
   1. Prepare las fases móviles semanalmente para garantizar la compatibilidad con LC-MS y minimizar la contaminación: (1) Fase móvil A: agregue 1 ml de FA de grado LC-MS a 1 l de agua de grado LC-MS, y (2) Fase B móvil: agregue 1 ml de FA de grado LC-MS a 1 l de ACN de grado LC-MS.
      NOTA: Utilice únicamente disolventes y ácidos de grado LC-MS. Prepare ambas fases en botellas de vidrio limpias y desgasifique si el sistema LC lo requiere. Deseche las fases no utilizadas semanalmente para evitar el crecimiento o la degradación microbiana.
   2. Instale una columna capilar de sílice fundida de 25 cm de largo y 75 μm de diámetro interior llena de partículas de fase inversa C18 de 1,7 μm.
      NOTA: Manipule las columnas con cuidado para evitar introducir burbujas de aire o dañar el material de embalaje. Siga las instrucciones del fabricante para la instalación y el equilibrio de la columna.
   3. Acondicione la columna aumentando gradualmente el caudal de 50 nL/min a 300 nL/min utilizando la Fase B móvil al 3%.
      NOTA: Este paso garantiza que la fase estacionaria se humedezca y equilibre adecuadamente antes de la inyección de la muestra. Monitoree la presión de la columna durante la rampa del caudal. Los picos de presión repentinos pueden indicar burbujas de aire o bloqueo de la columna. El equilibrio puede considerarse completo cuando la presión de referencia se estabiliza.
   4. Mantenga la temperatura de la columna a 50 °C para garantizar un rendimiento cromatográfico óptimo.
   5. Inyecte 100 ng de un digestor tríptico de células HeLa como estándar de control de calidad (QC) para evaluar el rendimiento del sistema.
      NOTA: Esta inyección de control de calidad sirve como punto de referencia para evaluar la consistencia del tiempo de retención de LC, la sensibilidad de MS y la cobertura del proteoma en todas las ejecuciones. Compare los recuentos de identificación de proteínas, la reproducibilidad del tiempo de retención y la intensidad de la señal con un conjunto de datos de control de calidad de referencia para confirmar la preparación del sistema antes de analizar muestras experimentales. Utilice estándares comerciales de digestión HeLa preparados en concentraciones conocidas para la reproducibilidad en todos los experimentos.
   6. Emplee una elución en gradiente del 2% al 35% de la fase móvil B durante 90 min a un caudal de 300 nL/min. El gradiente de 90 minutos proporciona una separación de péptidos de alta resolución adecuada para proteomas complejos. Siguiendo el gradiente, mantenga al 95% de la fase móvil B durante 7 minutos para lavar la columna.
      NOTA: Incluya un paso de reequilibrio (por ejemplo, volver al 2% B durante 10-15 min) antes de la siguiente inyección para garantizar la reproducibilidad de la columna en todas las ejecuciones. Evite los cambios bruscos de gradiente, que pueden afectar la estabilidad del tiempo de retención y la forma del pico.
   7. Realice análisis de MS utilizando un espectrómetro de masas equipado con una fuente de ionización por electrospray compatible con nanoflujo (por ejemplo, estilo CaptiveSpray).
      NOTA: La fuente de iones CaptiveSpray proporciona un electrospray estable a bajas velocidades de nanoflujo, lo que mejora la eficiencia y la sensibilidad de la ionización. Para laboratorios que utilizan espectrómetros de masas alternativos, ajuste los parámetros de adquisición e ionización en consecuencia. Garantice un ajuste y calibración adecuados antes del análisis para mantener la precisión y la resolución. Coloque el emisor de pulverización correctamente y controle la estabilidad de la pulverización durante el funcionamiento para evitar caídas de señal.
   8. Utilice un método diaPASEF de adquisición independiente de datos³². Para los usuarios que no están familiarizados con diaPASEF, consulte la documentación técnica del fabricante o los protocolos recientes que describen los flujos de trabajo de espectrometría de movilidad de iones atrapados (TIMS)-DIA³³ para optimizar diferentes tipos de muestras o longitudes de gradiente.
      NOTA: diaPASEF combina TIMS con DIA para aumentar la velocidad y la sensibilidad de la secuenciación al alinear los iones precursores y fragmentos en la dimensión de movilidad³⁴. Asegúrese de que el dispositivo TIMS esté correctamente calibrado y sincronizado con el cuadrupolo para evitar la desalineación de la movilidad iónica y las ventanas de masa.
   9. Utilice los siguientes ajustes del instrumento: (1) Rango de masa: 100 a 1700 m/z; (2) Rango de movilidad iónica: 0,60-1,60 V·s/cm²; (3) Energía de colisión: 20-59 eV, en rampa; (4) Tiempo de rampa: 100 ms; (5) Tiempo de acumulación: 100 ms; (6) Rango de masa para diaPASEF: 400-1201 Da; (7) Ancho de la ventana de masa: 26 Da con 1 Da superpuesto; (8) Número de pasos de masa por ciclo: 32; (9) Tiempo de ciclo: ~1,8 s
      NOTA: Estos ajustes están optimizados para equilibrar la profundidad de cobertura y la velocidad de escaneo. Es posible que se requieran ajustes menores (por ejemplo, ancho de ventana o número de pasos) dependiendo de la complejidad de la muestra, la longitud del gradiente y el rendimiento del sistema LC-MS. Lograr la identificación de más de 7.500 proteínas para la digestión HeLa indica un rendimiento óptimo del sistema. El número de identificaciones puede variar según el instrumento y debe evaluarse en consecuencia.
   10. Cargue 300-400 ng de muestra de péptido por inyección para evitar sobrecargar la columna analítica. La sobrecarga puede conducir a un ensanchamiento de picos, supresión de iones y reducción de la reproducibilidad. Confirme la concentración de péptidos antes de la inyección utilizando un espectrofotómetro o un ensayo colorimétrico de péptidos para evitar la variabilidad entre las ejecuciones.
   11. Ejecute inyecciones en blanco entre grupos de muestras para evitar el arrastre. Utilice la fase A 100% móvil (agua con 0,1% de FA) como pieza en bruto de inyección. Esto elimina los péptidos residuales de la columna y reduce la contaminación entre ejecuciones. Supervise los iones de referencia y de fondo para confirmar una limpieza adecuada.
4. Análisis de datos DIA
   1. Utilice un software adecuado que admita el análisis de datos utilizando el flujo de trabajo directDIA³⁵ y el procesamiento sin biblioteca de datos proteómicos de DIA. Realice la identificación y cuantificación de proteínas basándose en una base de datos UniProt FASTA³⁶, con parámetros de búsqueda estándar y ajustes de cuantificación predeterminados.
      NOTA: Todos los parámetros, incluida la especificidad de la enzima, la configuración de modificación, los umbrales FDR y los resultados posteriores al análisis, se detallan en el Archivo complementario 1. También se pueden utilizar plataformas de análisis DIA alternativas, como DIA-NN³⁷ , si admiten flujos de trabajo y resultados similares.
   2. Ejecute directDIA sin biblioteca con valores de corte de valor q correspondientes al 1% de FDR a nivel de precursor, péptido y grupo de proteínas; excluir las identificaciones de señuelos antes del análisis posterior.
      NOTA: No se agregaron estándares iRT; el rendimiento se comparó con las ejecuciones de resumen de HeLa contra criterios predefinidos de identificación y estabilidad del tiempo de retención.

Resultados

Tras la ejecución exitosa del protocolo, los usuarios deben obtener conjuntos de datos de interacción de alta calidad adecuados para el análisis de dfPPI posterior. La identificación de proteínas se realiza a partir de datos DIA al 1% de FDR (PSM y niveles de proteínas), y la cuantificación utiliza intensidades brutas o recuentos espectrales MS/MS (no LFQ). Las firmas de control de calidad esperadas incluyen: agrupación ajustada de réplicas técnicas por PCA, CV de precursores / proteínas medianos de aproximadamente 10-12%, agrupación jerárquica impulsada por origen biológico en lugar de replicación, y enriquecimiento robusto a nivel de vía en g: Profiler / Reactome.

Generación de sondas de perlas de PU y validación de la actividad antes de su uso

Las perlas de PU se preparan acoplando un análogo de molécula pequeña que se une al epichaperoma a la agarosa activada por NHS, como se describió anteriormente²⁵. Un paquete de resina estándar de 25 ml produce ~ 25 ml de perlas de PU almacenadas como una suspensión 1: 1 en isopropanol. Alícuota en tubos de baja unión y guárdelos a -20 °C, protegidos de la luz (por ejemplo, envuélvalos en papel de aluminio). En estas condiciones, un lote permanece estable durante ≥12 meses. Antes de su uso, retire el isopropanol y equilibre las perlas en el tampón de unión nativo (paso 1.3). Cada lote se califica en la síntesis y periódicamente a partir de entonces utilizando dos ensayos (Figura 2): (i) Pull-downs emparejados realizados por especificidad biológica de un lisado de epichaperoma alto (p. ej., MDA-MB-468) y un lisado de epichaperoma bajo (p. ej., ASPC1) en condiciones idénticas (suspensión de perlas de 40 μL con 250 μg de proteína total; 3 h a 4 °C; lavados nativos), elusión/desnaturalización e inmunotransferencia para HSP90, HSC70 y HOP. Aceptación: fuerte enriquecimiento en la muestra de epichaperoma alto con señal mínima en la muestra baja; relaciones de intensidad de banda comparables a un lote de referencia (±20-30%). (ii) Capturas paralelas de perfil de carga global de un lisado con alto contenido de epichaperoma con perlas de PU frente a perlas de control inertes emparejadas, volúmenes de eluido iguales de carga en SDS-PAGE y tinción de Coomassie. Aceptación: Las perlas de PU muestran una carga rica y de alto peso molecular con un fondo mínimo en el carril de perlas de control. Un lote de 25 ml admite ~600 capturas a 40 μl por muestra; Retire mucho si la especificidad o el perfil de carga quedan fuera de la aceptación después del relavado/reequilibrio.

Resultados representativos de los protocolos en gel y en perla

En una comparación piloto directa en células MDA-MB-468 con alto contenido epichaperoma, los flujos de trabajo en gel y en perlas produjeron interactomas altamente concordantes: 4.616 de 6.333 proteínas (73%) se compartieron a nivel de grupo de proteínas, con 1.275 (20%) detectadas solo por in-gel y 442 (7%) solo por on-bead. La concordancia a nivel de vía fue aún mayor: entre los 860 términos de Reactome, 727 (85%) fueron comunes, con 81 (9%) exclusivos de in-gel y 52 (6%) exclusivos de on-bead. Las intensidades medias de las proteínas fueron ~ 3× más altas para el gel que para el de la perla, consistente con la concentración de elución en gel, pero esto no afectó materialmente la concordancia de la vía.

Ejemplo de escala de cohorte y firmas de control de calidad

Como ejemplo, analizamos doce muestras biológicas (Figura 3). Se eluyeron cuatro muestras y se procesaron mediante digestión en gel; ocho muestras se sometieron a purificación por afinidad de complejos de epichaperoma seguida de digestión en perla y nano-LC-MS/MS en duplicado técnico. Se observaron firmas de control de calidad esperadas: agrupación ajustada de réplicas técnicas por PCA, CV medio de precursores / proteínas de ~ 10-12%, agrupación jerárquica impulsada por origen biológico en lugar de replicación, y enriquecimiento robusto a nivel de vía en g: Profiler / Reactome. Estos resultados ilustran la reproducibilidad en todos los componentes del flujo de trabajo, la amplia detección de proteínas comprometidas con el epichaperoma y la clara interpretabilidad funcional de los interactores diferenciales a nivel de vía. Los enriquecimientos de vías derivados de ambos flujos de trabajo coincidieron con nuestros resultados publicados de dfPPI para esta línea, validados por varios ensayos ortogonales bioquímicos y funcionales¹⁷.

Calidad del material de entrada y digestión

Se muestra un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie representativo para cuatro de las muestras procesadas por digestión en gel (Figura 3A). El gel ilustra la captura de proteínas reproducible y la distribución consistente de bandas a través de carriles, lo que confirma el enriquecimiento exitoso de complejos de proteínas a partir de lisados nativos antes de la espectrometría de masas. Estos perfiles de interactoma desnaturalizados demuestran que el paso de captura de afinidad produce una entrada de proteínas suficiente y consistente para el análisis de MS posterior.

Los interactomas capturados muestran una amplia cobertura de proteínas en todos los pesos moleculares, lo que refleja un enriquecimiento exitoso de los ensamblajes de proteínas de lisados nativos. Críticamente, esta recuperación no se limita a proteínas abundantes, sino que incluye interactores de menor abundancia, lo que proporciona la complejidad y profundidad necesarias para el análisis a nivel de sistemas.

Controles y especificidad a escala

En este flujo de trabajo, usamos perlas de control solo para la limpieza previa (consulte los pasos 1.3 y 1.4); No realizamos capturas comparativas rutinarias de "sonda inerte" en cada bioespécimen. Para grandes cohortes clínicas, las capturas inertes consumen material precioso pero agregan poco valor interpretativo para dfPPI porque las estadísticas posteriores operan a nivel de red / vía, no a nivel de una sola proteína. Los contaminantes aleatorios o pegajosos con resina no aparecen de manera coordinada entre los miembros de la misma vía y, por lo tanto, no sobreviven a las pruebas de enriquecimiento a nivel de vía ni a los filtros de consistencia a nivel de cohorte. En la práctica, la especificidad está garantizada por (i) la limpieza previa, (ii) la reproducibilidad de la réplica ajustada (PCA/CV) y (iii) la estabilidad de la vía a través de los umbrales y el remuestreo. Históricamente, evaluamos experimentos de bloques de captura inerte y competidor soluble (PU-H71) y descubrimos que no cambiaron los resultados de la vía dfPPI 16,17,21, mientras consumíamos material clínico irremplazable; por lo tanto, los reservamos solo para la verificación del piloto. Para los grupos que prefieren verificaciones explícitas a nivel de ejecución, observamos que ambas opciones son compatibles con el protocolo, pero no son necesarias para los análisis de dfPPI a escala de cohorte.

Número de réplica

La inferencia de vías en dfPPI se basa en conjuntos y no requiere un número de réplica fijo. Con adquisiciones sólidas, una sola muestra por condición puede producir llamadas de vías exploratorias. Para los análisis confirmatorios, recomendamos ≥3 réplicas biológicas por condición para las células cultivadas (con inyecciones duplicadas de LC-MS/MS cuando sea posible) y Ns apropiadas para la cohorte para el tejido humano (típicamente ≥5-10 por grupo para el descubrimiento, más grandes si se estratifican por covariables). Evaluamos la estabilidad mediante agrupamiento replicado (PCA), CV precursor mediano (objetivo ~ 10-15%) y bootstrap / remuestreo de los resultados de enriquecimiento.

Reproducibilidad técnica en todas las ejecuciones

La reproducibilidad técnica se evaluó mediante el análisis de componentes principales (PCA) (Figura 3B) de los datos de intensidad peptídica de muestras digeridas en perlas (ocho cerebros murinos, ejecutados por duplicado). Las réplicas se agruparon estrechamente para cada muestra biológica, mientras que las diferentes muestras se separaron limpiamente a lo largo de los dos primeros componentes principales. Los dos primeros componentes principales explicaron el 28,6% y el 22,0% de la varianza total, respectivamente, y distribuyeron las muestras de acuerdo con las diferencias biológicas y no con el ruido técnico. Esta estructura refleja una alta consistencia analítica y confirma que el método conserva las diferencias biológicamente relevantes, lo cual es fundamental para permitir que dfPPI detecte el recableado de la red específico de la condición.

Consistencia de la detección entre muestras

Las distribuciones de coeficientes de variación (CV) para las intensidades de iones precursores demuestran que la gran mayoría de las características caen por debajo del 20% CV, con valores medianos que oscilan entre el 9,7% y el 11,9% en todas las condiciones (Figura 3C). Estos resultados confirman la detección constante de EM y la recuperación de péptidos en todas las réplicas.

Rango dinámico y cobertura de proteoma

La agrupación jerárquica de los valores de abundancia de proteínas transformadas logarítmicamente (Figura 3D) mostró una fuerte separación de muestras y la preservación de la variación entre muestras, al tiempo que reflejaba el amplio rango dinámico capturado en las ejecuciones de MS. Las intensidades de las proteínas abarcaron desde interactores de baja abundancia hasta grupos de proteínas altamente enriquecidos, como se visualiza por el gradiente de azul a amarillo. Los datos confirman que el protocolo permite la detección de diversos conjuntos de proteínas e interactores, capturando componentes centrales y periféricos.

Interpretación funcional a través de dfPPI

Para apoyar la interpretación y la reproducibilidad, proporcionamos dos recursos complementarios para los análisis de conjuntos de datos de dfPPI: (i) una aplicación web interactiva Shiny (https://epichaperomics.mskcc.org/ actualizada a https://dfppi.mskcc.org) y (ii) flujos de trabajo abiertos y programables y archivos de sesión de Cytoscape publicados con estudios previos de dfPPI (GitHub/Zenodo)38,39,40,41. La aplicación ingiere tablas de conteo espectral de intensidad bruta o MS/MS, realiza control de calidad (agrupación de réplicas, comprobaciones de valores faltantes), manejo opcional de ruido/lotes (regresión de covariables), identifica proteínas comprometidas diferencialmente y ofrece lecturas de rutas/redes a través de gráficos interactivos e informes descargables, sin necesidad de codificación.

dfPPI trata las intensidades medidas o los recuentos espectrales como indicadores del "compromiso del epichaperoma". Los usuarios seleccionan un modelo de conectividad diferencial (DC) que va desde una simple prueba t de dos colas (predeterminada) hasta modelos lineales con reconocimiento de covariables; también se puede omitir el paso de CC. Después de DC, los usuarios establecen umbrales de cambio de pliegue y valor p (los valores predeterminados reflejan el trabajo anterior de dfPPI; por ejemplo, FC > 1.0, p nominal ≤ 0.25) para pasar candidatos al enriquecimiento. Hay dos motores de enriquecimiento disponibles: GSEA basado en rangos (en estadísticas con signo) y sobrerrepresentación (hipergeométrico) a través de g:Profiler con corrección de pruebas múltiples. Para un contexto centrado en la chaperona, la tubería también proporciona análisis de enriquecimiento de interactoma (iEA) para probar si los interactores directos de las proteínas de andamio de chaperona están sobrerrepresentados entre las proteínas comprometidas diferencialmente. La red ve los nodos/bordes de peso por tamaño del efecto y/o soporte estadístico, lo que permite la visualización de un recableado coordinado en lugar de efectos de una sola proteína. Para los usuarios que prefieren flujos de trabajo con scripts, el código R subyacente y los archivos de sesión de Cytoscape utilizados para construir mapas y figuras de red están disponibles públicamente (por ejemplo, GitHub/Zenodo)38,39,40,41 con las publicaciones asociadas 17,18,19,20 y pueden ejecutarse localmente o adaptarse para nuevos conjuntos de datos.

Se recomienda un punto de corte permisivo (cambio de pliegue > 1,0; p nominal ≤ 0,25) para retener las señales de estado de interacción introducidas por el enriquecimiento por afinidad. Luego cambiamos el control estadístico al nivel de la vía: las proteínas candidatas se prueban para el enriquecimiento en ontologías seleccionadas (por ejemplo, GO, Reactome) utilizando g: Profiler, y los valores p de la vía ajustados por múltiples pruebas determinan la importancia y la clasificación. Este diseño refleja el objetivo de dfPPI, detectar el recableado coordinado de la red, no la expresión diferencial de una sola proteína, y evita la normalización de todo el proteoma que puede oscurecer las señales de enriquecimiento en conjuntos de datos desplegables. Como se muestra en estudios previos de dfPPI^17,20, los umbrales de nivel de proteína más indulgentes producen llamadas a la vía estables y relevantes para la enfermedad, mientras que otros modelos (por ejemplo, modelos lineales con contracción empírica de Bayes) se pueden usar cuando la varianza o las covariables por lotes lo justifican, sin alterar la inferencia centrada en la vía central.

La captura de afinidad inevitablemente coenriquece proteínas "pegajosas" (por ejemplo, queratinas, proteínas citoesqueléticas, proteínas ribosómicas), y las perlas de PU también pueden capturar interactores acompañantes generales. En dfPPI, estos no impulsan la biología por varias razones. Primero, los lavados previos y estrictos eliminan la mayoría de los aglutinantes no específicos. En segundo lugar, los aglutinantes genéricos, incluidos muchos interactores chaperonas, muestran cambios de pliegue cercanos a 1.0 en todas las condiciones y / o detección inconsistente y, por lo tanto, fallan las pantallas de valor FC / p. En tercer lugar, el enriquecimiento de la vía se basa en conjuntos y tiene en cuenta los antecedentes: la importancia se calcula contra el proteoma detectado específico del experimento y requiere que varios miembros de la misma vía varíen. Los contaminantes aleatorios o de alta abundancia se dispersan en muchos términos y, por lo tanto, no forman enriquecimientos coherentes y significativos para FDR. Ninguna proteína, contaminante o de otro tipo, puede "hacer" una llamada a la vía. En cuarto lugar, dfPPI interpreta la coherencia a nivel de red, no proteínas individuales; las llamadas de vía deben sobrevivir a la corrección de múltiples pruebas (p. ej., valores p ajustados por g:Profiler), tamaños mínimos de conjuntos de genes y consistencia de replicación. Junto con los preclears de perlas inertes emparejados y el filtrado de contaminantes comunes, este marco hace que dfPPI sea robusto para el fondo: incluso si hay cientos de proteínas no informativas presentes, no alteran las clasificaciones de las vías porque el enriquecimiento depende del número de proteínas concordantes dentro de una vía, no de la longitud total de la lista de proteínas. Además, todos los estudios publicados sobre dfPPI hasta la fecha han corroborado las predicciones a nivel de vía y red con una amplia validación experimental (por ejemplo, bioquímica dirigida, lecturas de señalización, perturbaciones genéticas o farmacológicas)16,17,18,19,20, lo que demuestra que los resultados de dfPPI no son simplemente listas de proteínas ruidosas, sino mapas reproducibles de disfunción de la red de IBP relevante para la enfermedad.

Para evaluar el paisaje funcional capturado por el conjunto de datos dfPPI de la Figura 3D, realizamos un análisis de enriquecimiento utilizando g:Profiler⁴² (Figura 3E). Los resultados demuestran una sólida cobertura de anotaciones en todas las principales ontologías funcionales, incluido el proceso biológico de ontología genética (GO-BP), la función molecular (GO-MF) y el componente celular (GO-CC), así como recursos de vías seleccionadas como Reactome, KEGG y WikiPathways. Este análisis representativo ilustra una fortaleza clave del enfoque dfPPI: su capacidad para revelar asociaciones de vías biológicamente significativas en diversos tipos de anotaciones, incluso a partir de tamaños de muestra relativamente pequeños. La amplia cobertura de Reactome observada aquí probablemente refleja el hecho de que dfPPI se basa en cambios a nivel de interacción: captura de redes de proteínas que se asignan directamente a procesos multicomponentes y cascadas de señalización, que están bien representadas en la estructura de Reactome. Debido a que dfPPI aprovecha los cambios en la conectividad en lugar de la expresión, es particularmente adecuado para detectar cambios funcionales a nivel de sistemas que pueden pasar desapercibidos por la transcriptómica o la proteómica de solo abundancia. Este hallazgo se alinea con otros trabajos en los que Reactome produjo consistentemente los enriquecimientos más coherentes y relevantes para la enfermedad a partir de conjuntos de proteínas derivadas de dfPPI 14,15,16,17,18,20,21.

El reactoma se organiza en torno a procesos y complejos multiproteicos (cascadas de transducción de señales, módulos de ciclo celular, ensamblajes metabólicos). Debido a que dfPPI enriquece a los interactores comprometidos con epichaperomas, es decir, grupos de proteínas que se reclutan funcionalmente en andamios de enfermedades, su producción contiene naturalmente módulos de vías cohesivas en lugar de golpes aislados. Esta captura coordinada produce una cobertura amplia y de alta importancia del Reactoma en subvías y jerarquías relacionadas. Por el contrario, las ómicas centradas en la abundancia (transcriptómica; proteómica global) informan cambios en la expresión, no estados de interacción; AP-MS de cebo único o etiquetado de proximidad proporciona vecindarios locales alrededor de un cebo diseñado a la vez; y la reticulación / cofraccionamiento a menudo brindan una conectividad escasa. Ninguno de estos, por sí solo, produce rutinariamente los conjuntos a nivel de sistema seleccionados por contexto que dfPPI devuelve de una sola captura endógena en células o tejidos. El resultado es un enriquecimiento de la vía que es amplio (se iluminan múltiples ramas de Reactome) y mecánicamente coherente (las proteínas cambian juntas porque sus interacciones, no solo sus cantidades, son reconfiguradas por epichaperomas). Sin embargo, observamos que dfPPI es complementario, no un reemplazo: cada método de interactómica tiene distintas fortalezas y limitaciones, y la elección óptima (o combinación) debe estar impulsada por la cuestión biológica, las limitaciones de la muestra y la resolución requerida.

Juntos, estos resultados confirman que el protocolo produce conjuntos de datos reproducibles y biológicamente informativos que se pueden utilizar para descubrir la remodelación diferencial del interactoma a través de estados de enfermedad o perturbaciones experimentales. La salida de dfPPI es adecuada para la integración con marcos de enriquecimiento de vías y permite el mapeo de eventos de recableado funcional no detectables por métodos estándar basados en abundancia.

Figura 1: Descripción general de la plataforma dfPPI. (A) La plataforma dfPPI (interactoma proteína-proteína disfuncional) permite la identificación de disfunciones de la red PPI específicas de la enfermedad a través de un flujo de trabajo quimioproteómico. La sección 1 implica la preparación de muestras y la captura de interactomas utilizando sondas químicas dirigidas a epichaperomas inmovilizadas en matrices de afinidad (por ejemplo, perlas de PU). Las secciones 2 y 3 describen dos flujos de trabajo de digestión compatibles: en perla o en gel, seguidos de LC-MS/MS sin etiquetas para la identificación del interactoma. Los análisis computacionales, incluidos el modelado estadístico y el enriquecimiento de vías, se realizan utilizando la canalización bioinformática dfPPI, que no está cubierta en este protocolo pero está disponible gratuitamente en https://epichaperomics.mskcc.org/. (B) Principio de dfPPI. En contextos relevantes para la enfermedad, los epichaperomas endógenos forman andamios supramoleculares que reorganizan las redes de IBP. Las sondas químicas dirigidas por epichaperoma (por ejemplo, perlas de PU o equivalentes) capturan estos andamios junto con sus interactores unidos directamente de células intactas o de lisados nativos, produciendo un pull-down de múltiples cebos en un solo experimento. Los controles combinados (por ejemplo, control de cordón inerte y/o competencia con sonda libre) se pueden procesar en paralelo. El material capturado se eluye y digiere en perla o en gel, se analiza mediante LC-MS/MS, y se cuantifican las proteínas (intensidad o recuentos espectrales MS/MS). El interactoma resultante se utiliza para calcular interactores diferenciales a través de condiciones y para realizar el enriquecimiento de vías / redes, revelando la disfunción de PPI específica del contexto a nivel de sistemas. El flujo de trabajo no requiere etiquetado genético ni sobreexpresión, es compatible tanto con células como con tejidos, y se escala a estudios de cohortes. Por el contrario, la MS tradicional de purificación por afinidad se centra en un cebo etiquetado a la vez, produciendo un vecindario local por construcción y, por lo general, requiriendo muchas construcciones / ejecuciones para muestrear una red. Por el contrario, dfPPI utiliza epichaperomas endógenos como cebo, capturando muchos PPI disfuncionales simultáneamente del sistema nativo, lo que acelera el descubrimiento de recableado de red específico de la enfermedad y proporciona lecturas a nivel de vía a partir de una sola captura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Especificidad de validación y captura de lotes de perlas de PU. (A) Especificidad biológica y consistencia de lote a lote. Las células MDA-MB-468 (epichaperoma-alto) y ASPC1 (epichaperoma-bajo) se lisaron en tampón nativo (20 mM Tris, pH 7,4; 20 mM KCl; 5 mM MgCl₂; 0,01% NP-40; inhibidores de proteasa/fosfatasa). Para cada captura, se incubaron 40 μL de purín de perlas de PU con 250 μg de proteína total (1 μg/μL) durante 3 h a 4 °C con rotación. Las cuentas se lavaron en un amortiguador nativo; los complejos se desnaturalizaron/eluyeron en ~100 μL de tampón de muestra SDS. Se resolvieron 5-10 μL de cada eluido mediante SDS-PAGE y se inmunoblotó para HSP90, HSC70 y HOP. Los lisados de entrada se muestran como referencia. Dos lotes de cuentas de PU (Lote 1, fresco; Lote 2, envejecido) produce un fuerte enriquecimiento en MDA-MB-468 y una señal mínima en ASPC1, lo que demuestra una especificidad preservada y consistencia del lote. (B) Carga global versus cuentas de control. Los lisados MDA-MB-468 se procesaron como en (A) con perlas de PU o perlas de control emparejadas. Se cargaron ~20 μL de cada eluido, separados por SDS-PAGE, y teñidos con Coomassie. Las perlas de PU recuperan una carga compleja y de alto MW característica de los ensamblajes ligados a epichaperomas, mientras que las perlas de control muestran un fondo mínimo. Se indican marcadores de peso molecular (kDa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados representativos de la captura de afinidad de dfPPI, la identificación de interactomas y los análisis bioinformáticos. (A) Gel SDS-PAGE teñido con Coomassie de proteínas eluidas de capturas de afinidad de perlas de PU de interactomas unidos a epichaperoma de cuatro muestras representativas de cerebro humano (PT1-PT4). Los conjuntos de proteínas unidas a perlas se desnaturalizaron por ebullición en tampón de muestra SDS, se resolvieron mediante SDS-PAGE y se tiñeron para evaluar la recuperación del interactoma a través de pesos moleculares. Cada muestra se cargó en un carril separado, con un carril vacío entre las muestras para minimizar la contaminación cruzada; Una señal débil observada ocasionalmente en estos carriles vacíos refleja un menor desbordamiento de la muestra durante la electroforesis. Estos geles son representativos de las muestras enviadas a las instalaciones de MS, donde cada carril se seccionó en cinco cortes para la digestión en gel y la identificación de proteínas por MS. (B) El análisis de componentes principales (PCA) de las intensidades de proteínas identificadas de los interactomas de epichaperoma digeridos en perlas de ocho muestras representativas de cerebro murino (ejecutadas por duplicado) revela una agrupación ajustada de réplicas técnicas y una clara separación biológica a lo largo de PC1 y PC2. Esto confirma una alta reproducibilidad técnica y una varianza biológica suficiente para un análisis robusto de dfPPI. La estructura de datos demuestra que las diferencias a nivel de interacción, no los artefactos técnicos, impulsan la separación de muestras, lo que proporciona una base sólida para el modelado de interactoma diferencial posterior sin necesidad de normalización artificial. (C) Las distribuciones del coeficiente de variación (CV) para las intensidades de iones precursores en los ocho grupos de muestra muestran una varianza consistentemente baja, con CV medianos que oscilan entre el 9,7% y el 11,9% (indicados por líneas discontinuas verticales). Estos CV bajos resaltan la reproducibilidad y robustez de la línea de detección y cuantificación de MS. La consistencia respalda el uso de la intensidad bruta o los valores de MS / MS como entradas confiables para el análisis de dfPPI, donde la varianza en la fuerza de interacción, no la expresión global de proteínas, es la señal biológica de interés. (D) Mapa de calor de agrupación jerárquica de valores de intensidad de proteínas transformadas logarítmicas₂ en todas las muestras (con duplicados técnicos mostrados). Las muestras se agrupan por origen biológico en lugar de replicarse, lo que confirma la captura robusta de interactomas unidos a epichaperomas y la preservación de la varianza biológicamente relevante. El amplio rango dinámico y la detección consistente en todas las proteínas respaldan aún más la calidad del conjunto de datos para el análisis de dfPPI. La barra de escala representa los valores de intensidad de proteínas transformadas logarítmicamente₂, que van de 2 (azul, baja abundancia) a 14 (amarillo, alta abundancia). (E) Gráfico de Manhattan del análisis de enriquecimiento de vías realizado en proteínas que interactúan diferencialmente identificadas por dfPPI. El enriquecimiento se realizó utilizando g:Profiler, y los términos significativos se representan gráficamente por -log₁₀ (valor p), coloreados por la fuente de anotación: Función molecular GO (GO: MF), Proceso biológico GO (GO: BP), Componente celular GO (GO: CC), KEGG, Reactome, WikiPathways y Ontología de fenotipo humano (HP). Este resultado representa la utilidad central de dfPPI: descubrir vías funcionales biológicamente significativas perturbadas a través de la remodelación del interactoma impulsada por epichaperomas. La amplia cobertura de anotaciones subraya la información a nivel de sistemas que se puede lograr a través de este enfoque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Método	Lo que captura	Principales fortalezas	Limitaciones clave	Uso típico	Escalabilidad (cohortes)
AP-MS (purificación por afinidad-MS)	Interactivos directos/casi directos de un solo cebo	Alta especificidad; cuantitativo; bueno para composiciones complejas	Requiere cebo / etiqueta / anticuerpo; un cebo a la vez; puede pasar desapercibido transitorio/débil	Definir socios de una proteína de interés	Bajo-moderado (se necesitan muchos cebos)
Etiquetado de proximidad (p. ej., variantes BioID/APEX)	Proteínas en la vecindad a nanoescala de un cebo a lo largo del tiempo	Captura vecinos transitorios/débiles; Funciona en células vivas	Ingeniería genética; etiquetado fuera del objetivo; con muchos parámetros	Mapas de vecindarios locales; dinámica	Bajo-moderado (ingeniería por cebo)
XL-MS (MS reticulante)	Proximidades/contactos espaciales dentro/entre proteínas	Restricciones estructurales; Captura contactos transitorios	Análisis complejo; menor amplitud del proteoma; Específico de la muestra	Topología estructural/contextual	Bajo (especializado)
Cofraccionamiento/MS (CF-MS)	Coelución de ensamblajes nativos	Sin etiquetado; ensamblados nativos	Laborioso; inferencia compleja; sensibilidad limitada	Panorama global complejo	Moderado
CETSA/TPP	Perfiles de coestabilidad/coagregación	Sin etiquetas; Condiciones nativas	Indirecto para IBP; Restricciones de solubilidad	Compromiso objetivo; Cambios térmicos	Moderado
dfPPI (epichaperomics)	Recableado de interacción a nivel de red capturado por epichaperomas endógenos como cebos multiplex	Endógeno; sin etiquetado; una captura interroga a miles de IBP disfuncionales; lecturas de rutas/redes; compatible con tejidos; amigable con la cohorte	Aplicable solo al contexto de la enfermedad; sondas especializadas (perlas de PU, YK5-B); No está destinado a la detección de complejos genéricos	Remodelación del interactoma del contexto de la enfermedad, priorización de vías, generación de hipótesis	Alto (cientos de muestras factibles)

Tabla 1: Comparación de los enfoques de mapeo de PPI y dfPPI. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Configuración completa de los parámetros de Spectronaut. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo descrito aquí permite el mapeo de IBP disfuncionales en muestras biológicas nativas utilizando la plataforma dfPPI. A diferencia de los métodos tradicionales que infieren la disfunción de la abundancia o los cambios de expresión, esta plataforma captura el recableado de la red a nivel estructural al aislar los interactores específicos de la enfermedad a través de la purificación de afinidad con sondas dirigidas al epichaperoma, seguido de MS cuantitativa basada en la intensidad sin etiquetas. Aunque la aplicación actual se centra en el tejido cerebral post-mortem, el método es ampliamente aplicable a otros tipos de muestras y modelos de enfermedades, incluidas células y tejidos cultivados de modelos de cáncer, neurodegeneración y disfunción inmune 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI se basa en sondas que seleccionan cinéticamente epichaperomas y atrapan los ensamblajes con sus interactores vinculados. Las perlas de PU (derivadas de quimiotipos de unión al epichaperoma como PU-H71 / PU-AD) se involucran en epichaperomas nucleados con HSP90 de forma no covalente pero con un largo tiempo de residencia, un sello distintivo de la selectividad cinética para la conformación del epichaperoma sobre los complejos chaperonas convencionales²³. YK5-B es una sonda covalente biotinilada dirigida a HSC70 dentro de los epichaperomas, lo que permite la captura en la célula antes de la lisis y preserva los IBP endógenos¹⁷. La selectividad proviene de los PTM asociados a enfermedades que remodelan las conformaciones de HSP90 / HSC70 y la química de bolsillo y estabilizan los conjuntos de epichaperoma 14,23,43,44; estos cambios producen una unión lenta_{de k de} alta afinidad para sondas no covalentes de tipo PU⁴⁵ (y permiten la captura covalente con YK5-B dirigida a HSC70), reteniendo así cinéticamente los complejos epichaperoma y coaislando sus interactores directos e indirectos para LC-MS / MS. En la práctica, las perlas de PU son óptimas para flujos de trabajo de lisado/homogeneizado, mientras que YK5-B admite la captura de células vivas; ambos conservan ensamblados dependientes del contexto que pueden ser identificados por LC-MS/MS y utilizados para el análisis de dfPPI descendente.

Para dfPPI, se requiere experiencia especializada en química para sintetizar las sondas de captura. Sin embargo, este requisito no es exclusivo de dfPPI: los métodos de PPI ampliamente utilizados (AP-MS, etiquetado de proximidad, XL-MS) también se basan en habilidades especializadas, por ejemplo, clonación/ingeniería de cebos etiquetados, generación de líneas celulares estables, optimización de etiquetado/reticulación y tuberías bioinformáticas complejas. Por el contrario, dfPPI evita la manipulación genética y la sobreexpresión de cebo, opera directamente en células o tejidos nativos (incluidas las escasas muestras biológicas clínicas) y utiliza flujos de trabajo estándar de captura de afinidad y LC-MS que ya son rutinarios en los núcleos de proteómica. Para reducir las barreras de adopción, las perlas de PU validadas y las perlas de control emparejadas están disponibles a través de MTA en el laboratorio de Chiosis, y los pasos de manejo/control de calidad se especifican completamente en los pasos 1.3 y 1.4. Finalmente, el análisis está respaldado por una aplicación dfPPI basada en la web que implementa las estadísticas requeridas y las lecturas de vías / redes, lo que reduce la carga bioinformática (es decir, para usuarios sin experiencia en codificación y solo habilidades básicas de bioinformática).

AP-MS, XL-MS, etiquetado de proximidad, cofraccionamiento y CETSA / TPP responden a diferentes preguntas (aglutinantes directos, proximidad espacial, etiquetado de vecindad, coensamblaje o coestabilidad térmica). dfPPI es el método de elección cuando el objetivo es mapear el recableado endógeno dependiente del contexto en la enfermedad, especialmente en tejidos nativos o grandes cohortes clínicas donde el etiquetado genético no es factible, y cuando se desean lecturas a nivel de vía / red de una sola captura. dfPPI utiliza epichaperomas como cebos multiplex para capturar cambios de interacción coordinados en muchas proteínas en un solo pull-down, lo que permite la identificación escalable de LC-MS/MS y el análisis centrado en la vía del material primario. En la práctica, dfPPI puede sembrar una validación descendente centrada en el cebo (por ejemplo, AP-MS en nodos específicos), mientras que los métodos tradicionales pueden refinar la topología (contactos directos, restricciones espaciales) para complejos resaltados por dfPPI. Consulte la Tabla 1 para una comparación lado a lado.

Varios pasos críticos influyen en el éxito del flujo de trabajo. En primer lugar, los extractos de proteínas de alta calidad son esenciales. Esto requiere un manejo cuidadoso de los tejidos o células, idealmente congelados y almacenados a -80 ° C, para minimizar la proteólisis y preservar los complejos nativos. La inclusión de inhibidores de proteasa y fosfatasa no es negociable: la integridad del epichaperoma, que actúa como el "cebo" funcional en este ensayo, depende de modificaciones postraduccionales específicas de componentes centrales como HSP90^23,43. Por ejemplo, la fosforilación de Ser226 y Ser255 es esencial para estabilizar la conformación del epichaperoma y preservar su función de andamiaje²³. La omisión de los inhibidores de la fosfatasa corre el riesgo de colapso estructural y pérdida de especificidad biológica.

Otro determinante clave es la calidad y el manejo de la matriz de afinidad de las perlas de PU. Las perlas deben almacenarse en isopropanol al 100% a -20 °C y usarse dentro de una ventana de actividad definida, idealmente dentro de 1-2 años. La actividad debe validarse antes de los experimentos críticos, ya que las perlas envejecidas pueden exhibir una capacidad de unión reducida o un aumento de las interacciones inespecíficas. También se debe optimizar el tiempo de incubación y la entrada de proteínas: la sobreincubación puede elevar el fondo, mientras que la entrada insuficiente de proteínas puede comprometer la profundidad de detección. Recomendamos incubaciones de 3 h y pull-downs piloto para calibrar la entrada adecuada para cada tipo de muestra.

Dos estrategias de digestión son compatibles con este protocolo: en perla y en gel. Si bien ambos flujos de trabajo producen resultados reproducibles, cada uno ofrece compensaciones. La digestión en gel puede introducir contaminantes como la queratina y requiere pasos de manipulación adicionales. La digestión en perla agiliza el flujo de trabajo y, por lo general, se prefiere cuando el rendimiento de la muestra o la cantidad de entrada son limitados. Sin embargo, las cantidades de proteasa deben calibrarse en función de la ingesta total de proteínas: aunque el método está diseñado para 750 ng de tripsina, puede producirse una digestión incompleta si los niveles de proteínas son altos, lo que lleva a escisiones perdidas y una recuperación reducida de péptidos. Es aconsejable evaluar la eficiencia de la digestión y ajustar la entrada de enzimas en consecuencia. Todos los pasos de digestión deben realizarse en tubos de baja unión utilizando reactivos recién preparados y libres de contaminación para garantizar la consistencia y minimizar el fondo.

La carga de proteínas por inyección de LC-MS depende del flujo de trabajo de captura, el rendimiento de péptidos y la capacidad de la columna. Para los resúmenes en perlas analizados en columnas nano-LC C18 estándar (~50-75 μm ID, ~15-25 cm), normalmente cargamos 300-500 ng por inyección; No hemos observado ganancias de rendimiento por encima de ~ 400-500 ng, mientras que las cargas más altas corren el riesgo de supresión de iones y ensanchamiento máximo. Para los flujos de trabajo en gel (por ejemplo, cinco cortes por carril), generalmente inyectamos ~25% del material desalado por rebanada por réplica y retenemos ~50% como respaldo para la reinyección si es necesario. En todos los casos, mida la concentración de péptidos antes de la inyección, verifique la respuesta lineal con un resumen de control de calidad y ajuste la carga para que la forma del pico cromatográfico y la profundidad de identificación se mantengan sin sobrecargar.

La cuantificación sin etiquetas a través de DIA se usa ampliamente en proteómica debido a su reproducibilidad y profundidad⁴⁶. Sin embargo, en el contexto de experimentos de captura de afinidad como este, donde el objetivo es identificar proteínas que interactúan con andamios epichaperomas en lugar de medir la abundancia global de proteínas, las estrategias de normalización como MaxLFQ no son apropiadas. Estos enfoques asumen una entrada uniforme y una similitud en todo el proteoma, que se violan por el paso de enriquecimiento intrínseco a este protocolo. En cambio, los valores de intensidad o los recuentos espectrales MS/MS proporcionan una cuantificación suficiente y biológicamente significativa para el análisis funcional posterior. Estas métricas reflejan la fuerza relativa de interacción o la frecuencia de las proteínas con los epichaperomas en todas las condiciones. Como se demostró en estudios anteriores 16,17,18,20, estos valores son adecuados para análisis de interactoma a nivel de sistemas, como dfPPI, que identifican vías biológicas alteradas sin depender de la normalización de todo el proteoma. Al preservar la verdadera varianza biológica introducida por la enfermedad o el tratamiento, la cuantificación basada en la intensidad o MS/MS permite un mapeo preciso y robusto de las disfunciones de la red PPI.

Aunque la captura de afinidad reduce el espacio de búsqueda en comparación con el lisado completo, los pull-downs de dfPPI aún contienen cientos o miles de proteínas que abarcan un amplio rango dinámico, además de un fondo coenriquecido. Para las comparaciones a escala de cohorte, la selección estocástica de precursores de DDA conduce a valores faltantes de ejecución a ejecución y muestreo variable de interactores de baja abundancia¹⁸. DIA fragmenta sistemáticamente todos los iones en ventanas predefinidas, proporcionando una mayor profundidad, menos valores faltantes y mayores propiedades de reproducibilidad de ejecución a ejecución que son cruciales cuando la inferencia posterior es a nivel de vía / red en lugar de una sola proteína. Es por eso que estandarizamos DIA para dfPPI.

Al igual que con todos los métodos de captura de afinidad, la unión inespecífica a proteínas es una consideración inherente. Las proteínas pueden retenerse debido a la adherencia a la resina, la alta abundancia o la agregación. Si bien estos interactores inespecíficos pueden aparecer en el eluido desplegable, su presencia no socava el objetivo analítico posterior de este protocolo¹⁷. El flujo de trabajo de dfPPI no está diseñado para definir interacciones binarias, sino para extraer patrones de recableado de PPI a nivel de sistemas. Los análisis de enriquecimiento funcional se realizan en interactores diferenciales y aprovechan las estadísticas basadas en la red para revelar alteraciones coordinadas a nivel de vía. Como se demostró en trabajos anteriores¹⁷, este enfoque a nivel de sistemas minimiza el impacto de las proteínas inespecíficas aisladas y permite que surjan conclusiones biológicas sólidas a partir de datos a nivel de cohorte.

En comparación con los enfoques convencionales de mapeo de interactomas, como la coinmunoprecipitación, el etiquetado de proximidad o la reticulación, la plataforma dfPPI ofrece una clara ventaja: captura la remodelación funcional del interactoma en condiciones relevantes para la enfermedad sin necesidad de ingeniería de cebo o sobreexpresión. Debido a que el método aísla los complejos de proteínas formados alrededor de epichaperomas supramoleculares, detecta conjuntos de proteínas emergentes que no están presentes en los sistemas sanos, lo que permite el descubrimiento de nuevos impulsores de enfermedades. El enfoque es escalable y adaptable a todos los tejidos, especies y estados de enfermedad, y ya ha proporcionado información única sobre la remodelación del proteoma en el cáncer y la neurodegeneración. Como tal, este método ofrece una poderosa herramienta para descubrir redes funcionales interrumpidas en enfermedades humanas.

Más allá de los ejemplos aquí, dfPPI está bien posicionado para (i) grandes cohortes clínicas para estratificar a los pacientes por disfunción de la red y descubrir biomarcadores farmacodinámicos que informen sobre el compromiso del objetivo y la corrección de la vía; (ii) muestreo longitudinal (p. ej., pre/post terapia, estadificación de la enfermedad) para rastrear las trayectorias de recableado y predecir los respondedores; (iii) integración con fosfoproteómica y otras ómicas conscientes de PTM para vincular los cambios de estado de interacción con la señalización aguas arriba; (iv) capturas resueltas espacialmente de regiones microdisecadas (interfaces tumor-normales, subregiones cerebrales) para mapear la patobiología de la red local; v) pantallas de perturbación (genéticas o compuestas) en las que las lecturas de dfPPI designan nodos accionables y mecanismos de acción; y (vi) modelado de gráficos/IA que aprende características de red específicas de la enfermedad a partir de mapas dfPPI para pronóstico y diseño terapéutico. Metodológicamente, la miniaturización, la automatización (por ejemplo, formatos de 96 pocillos) y el control de calidad estandarizado permitirán canalizaciones de alto rendimiento para estudios traslacionales y ensayos clínicos. Finalmente, los resultados de dfPPI pueden sembrar seguimientos específicos (AP-MS, XL-MS o etiquetado de proximidad) para resolver la topología de los módulos priorizados, lo que subraya la complementariedad del método dentro del conjunto de herramientas de interactómica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250	Tóxico, Combustible
Acetonitrilo (ACN) Optima	Fisher Scientific & nbsp;	A955-1	Grado LC/MS (Inflamable)
Medios de cromatografía de afinidad activados Affi-Gel 10	Bio-Rad	1536099	Se usa para fabricar cuentas de PU y cuentas de control (Inflamables)
Bicarbonato de amonio (ABC)	Sigma-Aldrich	09830-500G
Columna UHPLC Aurora Ultimate 25x75 C18	IonOpticks	AUR3-25075C18-CSI
Película autoradiográfica	EWEN-PARKER X-RAY CORP	EBA45	Alternativa para la detección de señales quimioluminiscentes tras Western blot
Biomasher microhomogeneizador de tejidos	DWK Ciencias de la Vida Kimble	7496250010	Utilizado para homogeneizar tejido cerebral congelado para la extracción de proteínas
Azul de bromofenol	Biorreactivo de Fisher	BP115-25
Centrífuga para tubos de 1,5 mL	Eppendorf	5424
Centrífuga para tubos de 1,5 mL	Eppendorf	5417R	Con control de temperatura
Centrífuga para tubos de 15-50 mL	Eppendorf	5810R	Uso para tubos cónicos
Sistema de imagen ChemiDoc MP	Bio-Rad	17001402	Se usa para densitometría de gel/blot
Horno de columna	Sonación GmBH, Alemania	ES071/ES072	Mantiene la columna de nanoLC a 50 °C; C de retención consistente
Tubos cónicos (15 mL)	Fisher Scientific	352096
Cuentas de control	Laboratorio de Quiosis	N/A	Taldone et al. (PMID:  21459002)
Tinte Coomassie G-250 (Bio-seguro)	Bio-Rad	1610786
Tubos Eppendorf oscuros (1,5 mL)	USA Scientific	1415-2507
Ditiotreitol (TDT)	Roche	10197777001	Irritante
Fácil nLC 1000	Thermo Fisher Scientific	Fácil nLC 1000	Sistema LC utilizado con Q Exactive HF
Discos de extracción en fase sólida Empore	Compañía 3M	2215-C18 (Octadecilo)	Se utiliza para preparar StageTips para desalar péptidos; Activado con metanol al 100%
Kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL)	Thermo Fisher Scientific	32209
Tubos Eppendorf (1,5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Ácido Fórmico (FA) Optima	Fisher Scientific	A117-10X1AMP	Grado LC/MS
g:Perfilador (e111_eg58_p18_f463989d)	Grupo BIIT-Tartu & Uuml; likool	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost	Enriquecimiento de vías
Glicerol	Biorreactivo de Fisher	BP229-1	Grado en biología molecular
Glicina	Biorreactivo de Fisher	BP381-5	Polvo cristalino
Anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-ratón (RRID: AB_2619742)	Sothern Biotech	1030-05	Secundario para el anticuerpo H90-10
Anticuerpo secundario conjugado con HRP anticonejo de cabra (RRID: AB_2632593)	Sothern Biotech	4010-05	Secundaria para el HSP90 y alfa; y anticuerpos HOP
Anticuerpo secundario conjugado HRP anti-rata (RRID: AB_2716837)	Sothern Biotech	3030-05	Secundario para el anticuerpo HSC70
Agitador orbital calefactado	Eppendorf	ThermoMixer C (2231001127)
HeLa proteína digerir estándar-Pierce	Thermo Fisher Scientific	88329	Utilizado para la evaluación de control de calidad de la LC-MS
Anticuerpo HOP (RRID: AB_10828378)	Señalización celular	5670	Para control de calidad de cuentas de PU
Anticuerpo HSC70 (RRID: AB_10617277)	Enzo	SPA-815	Para control de calidad de cuentas de PU
Anticuerpo HSP90 (H90-10) (RRID: AB_854214)	StressMarq	SMC-107	Para control de calidad de cuentas de PU
Anticuerpo alfa HSP90 (RRID: AB_303423)	Abcam	Ab2928	Para la normalización según la Sección 1.2
Línea celular humana: ASPC1 (RRID:CVCL_0152)	ATCC	CRL-1682	Línea celular de control, epichaperoma bajo/chaperona alta
Línea celular humana: MDA-MB-468 (RRID: CVCL_0419)	ATCC	HTB-132	Línea celular de control, epichaperoma alto/acompañante alto
ImageJ (v1.54p)	Wayne Rasband	https://imagej.net/ij/	Densitometría
Iodoacetamida (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Nocivo
Tubos microcentrífugas de baja unión a proteínas	Sarstedt	72.706.600
Proteasa Lys-C	Promega	VA1170	Grado LC/MS
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	63068	Grado en biología molecular
MaxQuant (v2.1.1.0)	Instituto Max-Planck de Bioquímica	https://www.maxquant.org/	Flujo de trabajo MaxDIA para identificación de péptidos/proteínas y cuantificación basada en intensidad sin etiquetas
Metanol	Fisher Chemical	A454-4	Grado HPLC, inflamable, tóxico
Mini comprimido de cóctel inhibidor de proteasa (Completo)	Roche	4693124001
Mini célula de transferencia electroforética Trans Blot	Bio-Rad	1703930
Mini-tanque de electroforesis en gel y nbsp;	Thermo Fisher Scientific	A25977	Uso para geles prefabricados Novex
Célula de electroforesis vertical tetra mini-PROTEANA	Bio-Rad	1658004	Utilizado para geles proteicos prefabricados mini-PROTEAN o geles de fundición manual
Mini-PROTEAN  Geles proteicos prefabricados TGX (4– 20%)	Bio-Rad	4561094
NanoDrop	Agilent	BioTek Sinergia H1	Se utiliza para estimar la concentración de péptidos antes de la inyección de LC-MS
NanoElute 2	Bruker	https://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdf	Utilizado en el flujo de trabajo diaPASEF
Fuente Nanospray Flex	Thermo Fisher Scientific	ES071	Para acoplamiento ESI de nanospray
Nuevo objetivo PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/P	New Objective Inc.	PF360-75-10-N-5	Lleno de suspensión C18 hasta 20 cm de longitud
Membrana de nitrocelulosa	Cytiva Amersham	10600006
Leche seca desnatada	Laboratorio Científico	M0841
Geles prefabricados Novex 8% Tris-Glycine	Thermo Fisher Scientific	XP00080BOX
NP-40	Roche	11754599001
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010023
Comprimido cóctel inhibidor de fosfatasa PhosSTOP	Roche	4906837001
Kit de ensayo de proteínas BCA Pierce	Thermo Fisher Scientific	23225
Envases de plástico	Fisher Scientific	FB0875711A
Balancín de plataforma	Corning	6705
Cloruro de potasio	Biorreactivo de Fisher	BP366-1	Cristales Blancos
Fuente de alimentación universal PowerPac	Bio-Rad	1645070
Proteína Precision Plus Proteica Caleidoscopio Estándar de Proteína Prestained	Bio-Rad	1610375
Cuentas de PU-	Laboratorio de Quiosis	N/A	Taldone et al. (PMID:  21459002)
Q Espectrómetro de masas HF exactivo Orbitrap	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdf	Utilizado para DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 y micro; m	Dr. Maisch GmbH, Alemania	R13.aq	medios de sílice para la separación de péptidos; Mezcla de polvo/metanol (1:3, v/v)
Unidad de rotación (rotador de extremo sobre extremo)	Barnstead  Internacional	400110
Cartuchos Sep-Pak C18 (100 mg)	Corporación Waters	WAT023590
Dodecilo sulfato de sodio (SDS)	Biorreactivo de Fisher	BP166-500	Grado de electroforesis
Sonicador	Branson	2510
Lector de microplacas multimodo SpectraMax Paradigm	Dispositivos moleculares	Paradigma SpectraMax
Spectronaut	Biognosys	https://biognosys.com/software/spectronaut/	Flujo de trabajo directDIA
Concentrador SpeedVac	Thermo Fisher Scientific y nbsp;	Savant SPD111V
Vacío de succión	Cardinal Health	CDL-65651-320
Espectrómetro de masas TimsTOF HT	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.html	Utilizado para el análisis diaPASEF
Óptimos del Ácido Trifluoracético (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508-10AMP	Grado LC/MS (Corrosivo, combustible)
Tris	Biorreactivo de Fisher	BP152-5	Polvo cristalino; Grado en biología molecular
Tris, pH 6,8 (1 M)	Teknova	T1068
Tris, pH 7,5 (1 M)	Biorreactivo de Fisher	BP1757-500	Grado en biología molecular
Solución salina tri-buffer (20 cucharadas por alcohol)	VWR, Ciencias de la vida	97064-338
Tris-Glycine-SDS (TGS 10x) funcionando con un tampón de gel	Biorreactivo de Fisher	BP13414	Electroforesis
Tripsina y nbsp;	Promega	V5111	Grado de secuenciación
Tripsina Oro	Promega	V5280
Preadolescentes 20	Biorreactivo de Fisher	BP337-100
Urea	Sigma-Aldrich	U0631-500G
Vórtice	Fisher Scientific	02-215-414
Agua	Fisher Scientific	W6-1	Grado LC/MS