La Red de Evaluación Preclínica del Ictus Modelo Multilaboratorio del Ictus Tromboembólico con Trombolisis: TE-MCAo

Resumen

Para simular el ictus tromboembólico, se inyectaron émbolos preparados a partir de sangre heteróloga de rata en la arteria cerebral media, seguidos de la administración de trombólisis sistémica para recanalización. Esta versión del modelo está optimizada para su uso en una red multilaboratorio y soporta la prueba de múltiples terapéuticas candidatas.

Resumen

Los modelos actuales de ictus traslacional en roedores inducen la oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) utilizando filamentos de nailon, émbolos inyectados, trombina intraluminal o endotelina-1 perivascular para simular el ictus humano. Entre estos métodos, la inyección de tromboembolos seguida de trombólisis imita mejor los eventos neuroinflamatorios observados en pacientes humanos y puede ser preferible al método del filamento de nailon inerte más utilizado. Sin embargo, los modelos tromboembólicos estándar, utilizados en laboratorios individuales líderes, pueden ser lentos, producir resultados variables y requerir una habilidad considerable para dominarlos. Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un modelo MCAo tromboembólico que se dirige a la oclusión vascular y utiliza la trombólisis intravenosa para lograr la recanalización, paralelamente a la trombólisis sistémica administrada en escenarios clínicos. Para reducir el número de animales, desarrollamos un método para almacenar sangre de animales donantes para la preparación posterior de los émbolos en varios sujetos. Nuestro uso de microcatéteres Doccol prefabricados simplifica la preparación e inyección de trombos al pre-cargar tromboembolos en los microcatéteres que luego se insertan en la arteria carótida interna. Para lograr la recanalización, inyectamos Tenecteplasa intravenosa a una dosis de 1,5 mg/kg. Para promover la reproducibilidad, preparamos y probamos en el campo procedimientos operativos estándar, vídeos de formación y talleres prácticos de formación quirúrgica. El modelo utiliza un enfoque quirúrgico estándar que debería ser familiar para todos los investigadores que emplean el modelo ampliamente aceptado de filamento de nylon. El paso del microcatéter hacia la arteria carótida interna distal, evitando la arteria pterigopala, se realiza de manera similar a la inserción de filamento de nylon. La recuperación y las evaluaciones post-ictus pueden realizarse con protocolos conductuales, radiológicos e histológicos típicos. Este modelo ofrece un enfoque práctico, reproducible y accesible para los investigadores que buscan un modelo MCAo tromboembólico con recanalización controlada.

Introducción

El ictus es una de las principales causas de muerte y discapacidad en todo^{el mundo.} Muchos pacientes se benefician de la trombólisis intravenosa, y algunos pacientes se benefician de la trombectomía mecánica. Dado que no todos los pacientes llegan al hospital a tiempo para la trombólisis o la trombectomía, y que no todos se benefician de una recuperación completa, sigue existiendo una necesidad considerable de desarrollar terapias cerebroprotectoras adicionales o complementarias. El modelo de ictus isquémico en roedores más utilizado es la oclusión monofilamentosa de la arteria cerebral media (MCA) seguida de reperfusión completa. Este modelo simula la oclusión de grandes vasos (LVO), modelando pacientes con ictus grandes que se someten con éxito a una trombectomía mecánica completa. Sin embargo, este modelo abarca un pequeño porcentaje de ictus clínicos. En cambio, más pacientes sufren ictus tromboembólicos secundarios a aterosclerosis (rotura aterosclerótica in situ o atero-embolos por enfermedad sistémica), y se les trata solo con trombólisis sistémica, que el modelo de nailon no logra^{replicar 2,3}. Además, el modelo MCAo de filamento de nailon carece de la cascada inflamatoria asociada a la oclusión trombótica ^4,5. Los modelos animales que emplean tromboembolos seguidos de administración trombolítica sistémica representarían la fisiopatología y la biología básica que ocurren en muchos pacientes con^{ictus 4,6}. Sin embargo, hasta ahora se sabe que los modelos de ictus tromboembólico en roedores son complejos y difíciles de reproducir. En laboratorios aislados con expertos dedicados, se puede lograr un modelo tromboembólico con una reproducibilidad razonable. Un modelo así no se presta fácilmente a un uso generalizado, como es necesario en proyectos multilaboratorio.

En este caso, ofrecemos protocolos detallados para una oclusión tromboembólica de la arteria cerebral media (TE-MCAo) actualizada y estandarizada, seguida de un modelo de trombólisis sistémica. Específicamente, simplificamos la preparación del trombo, estandarizamos la carga de trombos en catéteres y validamos la escalabilidad de este modelo para ensayos multilaboratorio. Desarrollamos este modelo para su uso en la Red de Evaluación Preclínica del Ictus (SPAN). Sin embargo, nuestra intención era que el modelo fuera útil para cualquier red que busque implementar ensayos preclínicos de gran volumen de nuevos tratamientos candidatos. Utilizando nuestro modelo estandarizado, pudimos inducir TE-MCAo en 6 ratas por día por centro de estudio durante el periodo de estudio.

SPAN y redes similares han crecido en respuesta a fracasos repetidos y continuos para traducir los prometedores cerebroprotectores del entorno preclínico al éxito en la práctica^{clínica 7}. En 2019, los Institutos Nacionales de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) iniciaron SPAN⁸. SPAN pretende filtrar de forma más eficaz las posibles terapias minimizando el sesgo mediante enmascaramiento centralizado, aleatorización y análisis automatizado y centralizado de resultados. SPAN 1 empleó el modelo de filamento de nailon en sus dos primeras iteraciones porque todos los laboratorios participantes ya lo utilizaban, y fue fácil desplegar^{el 9}. Para modelar de forma más fiel muchos aspectos del tromboembolismo y la trombolisis, SPAN buscó crear el modelo TE-MCAo descrito aquí. Este modelo sería útil para los cirujanos preclínicos que están haciendo la transición del modelo de filamento de nailon al modelo TE-MCAo. Recomendamos que los laboratorios preclínicos confirmen la presencia de ictus 24/48 horas después de MCAo (o TE-MCAo) utilizando una técnica de imagen, por ejemplo, resonancia magnética (RM).

La Red SPAN ha sido descrita completamente en estudios^{previos 9}, y todos los Procedimientos Operativos Estándar (SOP) de SPAN están disponibles en la página web de SPAN. En resumen, la red es gestionada por un centro coordinador (CC) que se encarga de la distribución de fármacos, el control de calidad de datos, la verificación del cumplimiento del protocolo y la comunicación en red. Todos los SOP son redactados por el CC y aprobados por un Comité Directivo tras su revisión. En SPAN, todos los roedores llevan una etiqueta auricular compatible con resonancia magnética colocada al llegar a los laboratorios de investigación, y todos los sujetos están registrados en la base de datos de captura electrónica de datos de investigación SPAN Research (REDCap). Los animales son aleatorizados por el CC usando tablas de aleatorización estratificadas por sitio y sexo. En SPAN 1 y SPAN 2, se investigaron la eficacia de terapias potenciales en seis laboratorios de investigación participantes. Todos los fármacos de prueba se envasaron en viales de aspecto idéntico, se etiquetaron en el centro coordinador y se enviaron a laboratorios de investigación al inicio del proyecto.

Protocolo

Todos los laboratorios participantes de SPAN, incluido el centro coordinador de la USC, siguieron las directrices de los NIH y AAALAC para el trato humano y ético de los animales. Se obtuvo la aprobación de la IACUC local en todos los sitios.

1. Preparación del trombo

NOTA: Toda la sangre y los trombos deben manipularse conforme a todas las directrices institucionales locales sobre riesgos biológicos. Todos los materiales que entren en contacto con la sangre deben ser eliminados como residuos biopeligrosos o, en el caso de los instrumentos quirúrgicos, limpiarse y desinfectarse a fondo mediante autoclave. Para reducir el uso de animales donados en este ensayo, desarrollamos un método para almacenar sangre de donante y luego usar sangre para producir tromboembolos según sea necesario.

1. Extrae sangre fresca de donante de una arteria en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL o en microtubos de ácido tetraacético de etilenediamina (EDTA) pediátrico, llenando solo hasta el nivel de 500 μL.
   NOTA: Preferimos la canulación de la arteria femoral para nuestras extracciones de sangre, ya que la arteria femoral tiene un gran diámetro luminal que permite la cateterización, es bilateral y permite realizar 2 análisis de sangre separados, y es una cirugía que puede sobrevivir para los roedores. Según nuestra experiencia, la sangre puede almacenarse a 4 °C durante 4 semanas.
2. Añade 1 mL de solución de CaCl₂ (5 mg/mL) a 500 μL de sangre almacenada y anticoagulada.
3. Inmediatamente después de la reversión de la anticoagulación con_{CaCl 2}, aspirar sangre del tubo de la microcentrífuga a un tubo de PE-50 de 100 cm mediante succión suave.
   NOTA: El retraso provocará coágulos sanguíneos antes de que pueda ser absorbido por el tubo de PE-50.
4. Incuba el tubo enrollado en solución fisiológica precalentada con fosfato (PBS) a 37 °C durante 2 horas en un horno de mesa.
   NOTA: Colocar la placa de Petri sobre una placa caliente abierta da como resultado inconsistente debido a una distribución inconsistente del calor.
5. Al final de la incubación de 2 horas, transfiera inmediatamente el tubo de PE-50 lleno de sangre a 4 °C para su almacenamiento. Seguirá siendo utilizable durante los siguientes pasos, entre 20 y 72 horas.

2. Carga de catéter

1. Conecta el tubo enrollado de PE-50 (diámetro interno: 0,58 mm) a una jeringuilla de 3 o 5 cc llena de solución salina y expulsa suavemente el trombo a una placa de Petri que contiene PBS.
   NOTA: Esto puede requerir una fuerza considerable. Mantenga la presión en el sitio de conexión para asegurar que el catéter y la jeringuilla no se desconecten al extrusión. El catéter PE-50 puede cortarse en segmentos más pequeños (10-50 cm) si es necesario para facilitar la extrusión.
2. Corta secciones de trombo de aproximadamente 6 cm de longitud con una cuchilla de afeitar.
3. Lava cada segmento de trombo introduciéndolo suavemente en un catéter PE-50 y expulsándolo completamente 5 veces.
4. A continuación, lava el trombo introduciéndolo suavemente en un catéter PE-10 (diámetro interno: 0,279 mm) y expulsándolo completamente 15 veces.
   NOTA: Si durante este paso se experimentan roturas frecuentes, considere utilizar la magnificación con un microscopio quirúrgico o una lupa quirúrgica para asegurarse de que el trombo se aspira en línea con la abertura del catéter.
5. OPCIONAL: Usar el azul de Evan para visualizar trombos
   1. Prepara Evan's Blue al 4% en una solución PBS 1x.
   2. Añade 200 μL del 4% de azul de Evan en una placa de Petri llena con 10 mL de PBS 1x. Esta será la solución más concentrada = Dilución azul de Evan #1.
   3. Toma 400 μL de Evan's Blue Dilution #1 y mézclalos en una placa de Petri aparte llena con 20 mL de 1x PBS. Esta es una solución diluida de Azul de Evan = Dilución azul de Evan #2.
   4. Coloca el coágulo en la solución más concentrada de la placa de Petri azul de Evan (dilución #1) durante 1 s y luego transfiere a la placa de Petri azul de Evan diluida (dilución #2).
6. Carga un trombo lavado en microcatéteres prefabricados (diámetro interior: 0,2 mm, diámetro exterior: 0,360 mm, longitud: 300 mm, conectado al bloqueo de Luer femenino) sin émbolos de aire usando el método húmedo a húmedo.
   NOTA: Recomendamos usar aumento (por ejemplo, lupas 2,5x) para este paso.
7. Una vez que el trombo está completamente cargado, se extruye suficiente trombo para que queden exactamente 5,0 cm en el microcatéter. Recorta el exceso con una cuchilla de afeitar.
   NOTA: La longitud del trombo cargado puede adaptarse a diferentes aplicaciones según el tamaño del ictus deseado.
8. Marca el microcatéter a 16 mm de la punta, para delimitar la extensión del catéter que debe avanzar intraluminalmente más allá de la bifurcación de la arteria carótida común.

3. Cirugía y anestesia animal

1. Inducir anestesia con isoflurano al 4% en una mezcla 30:70 de oxígeno y óxido nitroso y mantener la anestesia con isoflurano al 1-2% en la misma mezcla de gases.
2. Administrar analgésicos de carprofeno 5 mg/kg por vía subcutánea y atropina 0,05 mg/kg intraperitonealmente para mantener la comodidad animal durante la operación.
   NOTA: Muchos cirujanos infunden la zona de la incisión con 1,0 mL de bupivacaína (2,5 mg/mL).
3. Mantenga la temperatura corporal en 37 ± 0,5 °C durante toda la cirugía utilizando una almohadilla térmica controlada con una sonda de temperatura rectal.

4. Recogida de sangre de donante

1. Recoger sangre de donante mediante cateterismo arterial femoral. Coincide con el sexo biológico del donante y del receptor.
2. Si se va a usar sangre el mismo día:
   1. Prepara tres tubos centrífugos de 1,5 mL. Marque cada tubo en la marca de 500 μL con una pluma de laboratorio imborrable.
   2. Prepara tres juegos de tubos de PE-50, cada uno de 100 cm de longitud, sujetos a una jeringuilla de 1,0 mL mediante una aguja roma calibre 23.
3. Si se va a almacenar sangre para su uso posterior, prepare seis microtubos EDTA pediátricos. Afloja los tapones para que sea más fácil después.
4. Prepara un tubo PE-50 de 10,0 cm de longitud, sujeto en un extremo con una pinza calzada con goma y biselado en el otro extremo.
   1. Para hacer una abrazadera calzada con goma, inserta una puntilla de una abrazadera hemostática estándar en tubos PE-100 y recorta para ajustarla. Repite al otro lado.
   2. Para hacer que el PE-50 quede biselado romo, primero corta el extremo en ángulo biselado. Luego recorta la punta del biselo con microtijeras.
      NOTA: Es importante que se retire la punta para evitar perforar la pared posterior de la arteria tras la inserción, pero si se retira demasiado de la punta, la pérdida del efecto de biselado dificultará mucho la inserción intraluminal.
5. Realiza un corte estándar hacia abajo en la arteria femoral.
6. Prepara al animal (afeita la zona interna del muslo), coloca en reclinación dorsal sobre la mesa de cirugía. Esteririce la piel con 3 lavados de etanol al 70% seguidos de 1 lavado con betadine u otra solución antiséptica.
7. Asegura las patas traseras de forma abierta usando sujeciones blandas.
8. Realiza una incisión vertical en la parte interna del muslo de aproximadamente 1,5-2 cm de longitud a lo largo del pliegue natural de la intersección inguinal con la pierna. Esta incisión será ortogonal al curso anatómico esperado de la arteria femoral.
9. Con disección roma, disecciona cuidadosamente hasta los vasos femorales. Separa cuidadosamente la arteria femoral de la vena y el nervio que discurren en el mismo hace.
10. Ocluir distalmente la arteria femoral con una ligadura de seda 5-0 y utilizar las colas de la sutura para proporcionar una ligera tensión distalmente con hemostatos.
11. Esqueletarizar la arteria femoral tan proximal como sea permitido, rastreando la arteria hasta su origen retroperitoneal. Coloca de forma suelta un lazo de seda 5-0 alrededor de la arteria femoral y vuelve a usar las colas para proporcionar una tensión suave en el extremo proximal de la arteria. No aprietes el nudo de seda en este punto. Esta tensión provocará hemostasia después de la arteriotomía.
    NOTA: El lazo puede moverse más proximalmente con una pinza para aneurisma.
12. A unos dos tercios de la distancia desde el lazo de sutura proximal, coloca un trozo de sutura de seda bajo la arteria y haz una pequeña arteriotomía distal a la sutura suelta usando microtijeras. La sutura suelta se atará para asegurar el catéter intraluminal tras la canulación.
13. Con pinzas afiladas, levanta la abertura superior de la arteriotomía e introduce el catéter obseo y biselado en la abertura. Avanza el catéter lo más próximo posible.
    NOTA: Puede haber fricción entre el catéter y la pared interna del vaso. Dos cosas pueden ayudar con esto: 1) recubrir el exterior del extremo del catéter con líquido seroso del interior de la pierna justo antes de introducirlo en el vaso, y 2) usar pinzas romas y ranuradas, sujetar el exterior del vaso mientras avanzas el catéter al mismo tiempo. Esto evita que el vaso avance junto con el catéter.
14. Una vez que la punta del catéter ha avanzado casi hasta el punto del lazo proximal, se libera la tensión de las colas de esa sutura. El sangrado debe evitarse mediante el ajuste ajustado del catéter dentro del vaso.
15. Avanza el catéter lo suficiente para que el lazo flojo, al aprietarse, abrade el catéter. Aprieta la sutura suavemente, asegurándote de que no se tense hasta el punto de ocluir el catéter. Además, asegúrese de que la sutura no esté en el bisel del catéter, dado que este segmento es cónico.
16. Suelta la abrazadera con calzado de goma. El catéter debe llenarse inmediatamente de sangre.
17. Llenar los tubos abiertos de la centrífuga o los microtubos EDTA pediátricos, colocando no más de 500 μL en cualquiera de los recipientes de recogida.
18. Una vez rellenados los microtubos, retirar el catéter PE-50 de la arteria femoral, ligar el extremo proximal y cerrar la incisión con sutura interrumpida de prolene 5-0.
19. Si más adelante se va a usar sangre, coloca las tapas en los tubos EDTA pediátricos llenos y guárdalos a 4 °C.
20. Si se va a preparar el trombo para su uso el mismo día, proceda al paso 1.2 anterior.
21. Repite inmediatamente con los tubos centrifugadores restantes.
22. Los donantes de sangre arterial pueden ser devueltos al vivario tras recuperarse de la anestesia si se ha realizado un cateterismo unilateral. La arteria femoral contralateral podría ser cateterizada más tarde, pero tras la cateterización bilateral de la arteria femoral, los donantes deben ser sacrificados conforme a las normativas de la IACUC.

5. TE-MCAo

NOTA: El enfoque TE-MCAo utiliza el corte estándar en la arteria carótida común. La elección de anestesia y el método de reducción depende del usuario. El protocolo aquí comienza en el punto en que el cirujano ya ha aislado la arteria carótida común (ACC), la arteria carótida interna (ACI) y la arteria carótida externa (ECA).

1. Expone el CCA y retrae con una ligadura de seda 3-0. Haz lo mismo para el ECA y el ICA.
2. Utilizando una ligadura o cauterización, expone y ocluye la arteria occipital.
3. Exponer y retraer u ocluir la arteria pterigopalatina (PPA).
   NOTA: Con suficiente experiencia, este paso puede omitirse. Recomendamos realizar siempre este paso al aprender el procedimiento.
4. Utilizando una retracción suave, mueve el ECA y el ICA a una configuración en "T".
5. Ata la ligadura CCA solo después de completar todos los pasos anteriores.
6. Haz una arteriotomía en la ECA (metodología abierta Zea Longa^{CCA 10}) usando microtijeras.
7. Utilizando el método del bisel romo descrito en el paso 4.4.2, prepara la punta de uno de los microcatéteres ya cargados (diámetro interior: 0,2 mm, diámetro exterior: 0,360 mm, longitud: 300 mm, conectado a la cerradura de Luer hembra).
8. Inserta cuidadosamente el microcatéter con el trombo precargado en el ECA. Aflojar el lazo de retención de la ACI y avanzar el microcatéter intracranealmente hasta 16 mm en la bifurcación carotídea bajo visualización directa para evitar la canulación accidental de la PPA extracraneal.
   NOTA: Si el catéter prefiere entrar en el ACC, una presión suave con un aplicador puntiagudo de algodón puede ayudar a orientar el catéter en avance hacia el ACI.
9. Fija el microcatéter intraluminal a ICA y CCA usando seda 3-0, teniendo cuidado de no apretarlo demasiado.
10. Inyectar 20 μL en la jeringuilla de 1 mL con una bomba motorizada a una velocidad de 10 μL/min durante una duración de 2 minutos.
    NOTA: Normalmente, la bomba de jeringuilla no avanza al principio hasta que se acumula suficiente presión.
11. Inyecta 20 μL adicionales de solución salina estéril usando los mismos ajustes de bomba.
    NOTA: Durante el estudio del flujo sanguíneo usando imagen láser moteada, tuvimos un éxito del 100% con un enjuague de 20 μL.
12. Retira el microcatéter y liga permanentemente la ECA con una sutura próxima al sitio de la arteriotomía. Quita todos los lazos de sujeción. Observa cuidadosamente cualquier fuga de sangre y asegura con ligaduras adicionales si es necesario.
13. Cierra temporalmente la incisión cutánea con grapas o una sutura prolene 5-0 en curso.
14. Saca al animal de la anestesia y colócalo en una jaula de recuperación caliente.
15. Opcional: Los laboratorios pueden usar fluidmetría Doppler láser para confirmar la oclusión exitosa de la MCA. Alternativamente, se puede realizar la resonancia magnética a las 24 o 48 horas para confirmar y cuantificar el infarto cerebral.
    NOTA: Muchos usuarios prefieren administrar 1,5 mL de solución salina o de Ringer lactata por vía subcutánea al finalizar la cirugía.

6. Trombólisis sistémica

NOTA: La tenecteplasa (TNK, 1,5 mg/mL) puede adquirirse para su uso como trombólisis sistémica. Los usuarios pueden preferir otros agentes líticos. Los viales individuales de 50 mg se reconstituyen con 50 mL de agua destilada, y luego 2,5 mL se alicuan con precisión en viales de 3,0 mL. Las alicuotas pueden congelarse a -20 °C para su uso posterior. La estabilidad del activador recombinante de plasminógeno recombinante almacenado a -20 °C es de 60 días¹¹.

1. Descongela una alitería congelada de TNK para cada sujeto. Descongela a temperatura ambiente durante unos 15 minutos.
2. Con una jeringuilla de 1 cc, extrae exactamente 1,5 mg/kg. Por ejemplo, una rata de 300 g necesitará 0,45 mg.
3. Re-anestesiar al animal y eliminar el cierre temporal de la piel.
4. Expone cualquier rama de la vena yugular externa.
   NOTA: La vena caudal podría usarse si el laboratorio está más cómodo con esta vía. Preferimos usar la vena yugular porque los cirujanos SPAN se sienten más cómodos con la movilización externa de la vena yugular, y esto se hace de forma rutinaria en nuestro modelo de filamento.
5. Con una aguja de 30 o 32 G, administra el TNK por punción directa en la vena.
   NOTA: Al principio, los usuarios pueden querer aislar la vena entre 3-0 lazos de seda. Con práctica, esto no será necesario.
6. Cierra la incisión con proleno 5-0 interrumpido u otra sutura no absorbible.
7. Devuelva al animal a la jaula de recuperación como en el paso 5.14.

7. Métodos estadísticos

1. Para hacer estadística descriptiva, se utiliza la media y la desviación estándar para datos numéricos normalmente distribuidos, y el rango mediano e intercuartílico para datos no distribuidos de forma normal. Presenta datos categóricos como distribuciones de frecuencia. Para la prueba de hipótesis, aplicar la prueba t o ANOVA según corresponda para datos paramétricos normalmente distribuidos; de lo contrario, no realicéis pruebas de hipótesis.

Resultados

Figura 1: Recogida de sangre de animales donantes y preparación de trombos. Se extraía sangre del animal donante mediante cateterismo de la arteria femoral y se transfería a un tubo microcentrífuga con (puede almacenarse hasta 4 semanas) o sin EDTA (uso en el mismo día). Para preparar el trombo, se añadió solución de cloruro de calcio a los tubos de sangre almacenados y se aspiró inmediatamente a un catéter PE-50. El tubo de PE-50 enrollado se incubó en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) precalentada a 37°C durante 2 horas en un horno de mesa. Tras 2 horas, la tubería de PE-50 llena de sangre se transfería inmediatamente a 4°C para su almacenamiento. Consulte la sección 1 del protocolo para más información. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Cargando trombo en el catéter para la inyección. (A) El día de la cirugía MCAo, se extruyó un trombo desde el tubo de PE-50 a una placa de Petri que contenía PBS. (B) En la placa de Petri, el trombo se recortaba a aproximadamente 6 cm de longitud con una cuchilla de afeitar. (C) El trombo se lavaba con PBS aspirándolo a un tubo de PE-50 y expulsándolo 5 veces, y luego a un tubo de PE-10 15 veces. (D) El trombo se transfirió a una placa de Petri que contenía la solución concentrada de Evan's Blue. (E) El trombo se transfirió a una placa de Petri que contenía solución diluida de Evan's Blue y se cargó en un microcatéter prefabricado. (F) El microcatéter se avanzó a través de la arteria carótida interna de la rata hasta que, a 16 mm de la punta del catéter, pasó de la bifurcación carotídea de la arteria carótida común e inyectó mediante una bomba de jeringuilla motorizada. Consulte la sección 2 del protocolo para más información. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura. 

En un estudio piloto de viabilidad, inscribimos a 135 sujetos en 6 laboratorios de investigación. Aunque los sujetos fueron asignados aleatoriamente a uno de 8 tratamientos, aquí informamos sobre datos agregados solo para ilustrar la viabilidad del modelo. De 135 sujetos inscritos, la TNK se administró en la dosis y momento correctos en 132 (98%). La resonancia magnética se realizó 3 días después de la TE-MCAo en 102 (75%) debido a la muerte de un animal antes de la ecografía en 33 (24%). La pérdida de animales antes del día 3 fue consistente en los 6 laboratorios (Tabla 1), lo que indica que el modelo puede desplegarse en múltiples sitios. El tamaño medio ± del DS de las lesiones fue del 13 ± 16% (el área de la lesión incluye isquemia y edema como porcentaje del hemisferio ipsilateral), con cierta variabilidad entre laboratorios (Tabla 2). Imágenes representativas de la resonancia magnética y émbolos post-mortem pueden verse en la Figura Suplementaria 1.

	Laboratorio
Variable	AG	DK	IW	MG	SD	YL
Tamaño de la muestra (N)	23	30	11	28	24	19
Resonancia magnética realizada	19	24	9	23	14	13

Tabla 1: Viabilidad por laboratorio. Los laboratorios de estudio fueron Augusta University (AG), Duke (DK), University of Iowa (IW), Massachusetts General Hospital (MG), University of San Diego (SD) y Yale University (YL). Se muestran el número de animales inscritos (N) y el número que sobrevivieron para hacerse la resonancia magnética realizada el tercer día tras el ictus. Estos datos respaldan la viabilidad del modelo.

Emplazamiento	Tamaño de la muestra (N)	Volumen de lesión (%) Media ± DE	Índice de Turno de Línea Media (%) Media ± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	04 ± 19
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

Tabla 2: Volumen de lesión observado en las resonancias magnéticas del día 3, por sitio. Para establecer la reproducibilidad del modelo en seis sitios de estudio, se compararon el volumen de la lesión (isquemia más edema) y el desplazamiento de la línea media. El volumen de la lesión se expresa como el porcentaje areal del hemisferio ipsilateral. El desplazamiento de la línea media se expresa como el porcentaje lineal del ancho máximo del espacio intracraneal. Los datos confirman la heterogeneidad entre los laboratorios.

Figura suplementaria 1: Imágenes representativas. (A-E) Diversas imágenes multieco, multiescaneo (MEMS) de cerebros de rata tomadas 48 horas después de TE-MCAo. Las secciones son aproximadamente 1 mm anteriores al bregma. (F-J) Varios ejemplos de émbolos alojados en el origen de MCA. Por favor, haz clic aquí para descargar esta figura.

Discusión

Refinamos el modelo tromboembólico de roedor del ictus isquémico para su uso en una red de pruebas preclínicas multilaboratorio, SPAN. Redujimos considerablemente el número de animales utilizados desarrollando un método para almacenar sangre de donantes para su uso posterior. También simplificamos la preparación de tromboembolos y el enfoque quirúrgico para facilitar la realización de varios procedimientos de MCAo en un solo día. Nuestra intención es que el TE-MCAo alcance los mismos niveles de comodidad y volúmenes quirúrgicos que es posible con la versión ampliamente utilizada de filamento de nailon del MCAo. Para lograr este resultado, organizamos dos talleres presenciales de formación de cirujanos, y todos los cirujanos implicados en este estudio ya tenían varios meses, si no años, de experiencia con el modelo de filamento más estándar. Demostramos viabilidad en seis laboratorios de investigación diferentes y demostramos una excelente adherencia al protocolo.

Al elegir implementar este protocolo, un investigador debe considerar los siguientes elementos que determinan el éxito del protocolo. Primero, el cuidado escrupuloso en la recogida de sangre influirá en la formación exitosa de trombos. Se debe recoger sangre arterial, no venosa, para evitar la coagulación prematura. En segundo lugar, es importante recoger más sangre de la que parece necesaria. A veces, un ejemplar no tromba durante la noche, mientras que los demás sí. En tercer lugar, recomendamos encarecidamente que la carga del catéter se realice mediante aumento óptico, ya sea con lupas quirúrgicas con frontal o con lupa con iluminación. Cuarto, es esencial una disección cautelosa y cuidadosa de la CCA, ICA y ECA para evitar desgarros y trombosis intravascular. Además, es esencial visualizar la PPA para asegurarse de que el catéter de administración entre correctamente en la ICA. Quinto, es raro observar algún efecto adverso en los roedores debido a la inyección de trombolíticos. En nuestros estudios, no observamos ningún efecto adverso, como angioedema o sangrado periférico, tras la inyección de TNK. Esto no quiere decir que no sea posible, pero no tenemos constancia de ningún informe de efectos secundarios sistémicos de trombolíticos en roedores. Un investigador que decida implementar este protocolo por primera vez podría ser aconsejado consultar con uno de los investigadores nombrados como coautor aquí, ya que encontramos que la instrucción personalizada es muy útil.

Al seleccionar un modelo de enfermedad animal para probar terapias candidatas, es importante representar con precisión la población de pacientes a la que se pretende tratar el fármaco. Los modelos de ictus isquémico focal incluyen modelos fototrombóticos de Rose Bengal, oclusión de la arteria pial cortical e inyección estereotáctica de endotelina-1 13,14,15. Estos modelos tienen la ventaja de crear lesiones altamente reproducibles en áreas predecibles de la corteza. Esta ventaja los hace preferibles en estudios de mecanismos celulares o en la correlación de la localización de la lesión con los resultados conductuales. El coste añadido, la complejidad y la ausencia de componentes de reperfusión los hacen menos útiles para el cribado de drogas.

La MCAo con monofilamento intraluminal o tromboembolismo son los modelos establecidos de elección para la oclusión de grandes vasos (LVO⁾10,16,17. El modelo monofilamento recubierto de silicio es sencillo de ejecutar y ampliamente utilizado. Aunque la ubicación y el tamaño de la lesión son menos predecibles, en las pruebas de drogas a gran escala esta heterogeneidad se considera una ventaja porque los ictus humanos también son bastante heterogéneos^18,19. Una desventaja del método del monofilamento es que la oclusión es biológicamente inerte. En los pacientes, los trombombes y la trombólisis producen una cascada inflamatoria asociada con la liberación de trombina, plasminógeno y otros elementos del trombo 20,21,22. Para superar esta limitación, muchos han propuesto modelos de tromboembolismo en estudios con conejos, porcinos, caninos y primates^{no humanos} 23,24,25,26,27. Estos estudios son complejos y requieren una especialización en general. No obstante, buscamos adaptar el modelo tromboembólico para su uso en nuestra red de pruebas preclínicas y multilaboratorio. Esto requirió simplificar la preparación del tromboembolo, agilizar el enfoque quirúrgico y reducir significativamente el número de animales necesarios. Ideamos un modelo tromboembólico, el TE-MCAo, que pudo desplegarse con éxito en seis laboratorios diferentes con una excelente adherencia al protocolo (Tabla 1) y un tamaño de lesión razonablemente consistente (Tabla 2). El rendimiento fue suficiente, con una media de 6 asignaturas por semana.

Hay varios pasos de solución de problemas que pueden resultar útiles. La falla de trombose de la sangre es la causa más frecuente de fallo del protocolo y suele deberse a la contaminación del catéter de preparación con EDTA o heparina si se coloca en la mesa quirúrgica. Recomendamos una técnica de recogida escrupulosa. También recomendamos preparar la solución de cloruro de calcio que se utiliza para inactivar el EDTA fresca cada semana o cada dos semanas. Tras eluir el trombo del catéter de preparación, puede ser difícil cortar el trombo en los fragmentos de 5 cm requeridos. Algunos trombos son frágiles y se fracturan con facilidad. Recomendamos preparar los coágulos con aumento óptico y, en casos extremos, pasar a otro trombo donante. Los trombos aspiradores y elutivos requieren un nivel moderado de habilidad; Por eso recomendamos un periodo de entrenamiento bastante largo. Asegúrate de que la punta del catéter de aspiración esté libre de atascos mediante aumento óptico. Los trombos pueden colocarse en el catéter de implantación; recomendamos una alternancia suave de ida y vuelta entre aspiración y elución. Para los cirujanos con experiencia en el modelo típico de filamento MCAo, la identificación del PPA puede ser un paso nuevo. Recomendamos encarecidamente marcar el trombo con azul de Evan, para que el catéter pueda ser rastreado y seguido mientras asciende a través de la ACI. La bifurcación de la ACI/PPA puede localizarse fácilmente mediante una disección profunda y cuidadosa siguiendo la ACI, y se localiza de forma fiable hasta una rama delgada del nervio carótido interno.

Este protocolo tiene algunas limitaciones. Es necesario un elemento de habilidad quirúrgica para realizar la canulación de las arterias carótidas de roedores. Sin embargo, esto es igualmente cierto en el modelo de filamento. El manejo del trombo sanguíneo también requiere habilidad quirúrgica. Como en todos los modelos tromboembólicos, la tasa de infarto exitoso es menor en comparación con el modelo de filamento. Si el objetivo de la investigación es que los incidentes de infarto sean más frecuentes, el modelo de filamento sería preferible. Por otro lado, si el objetivo es replicar el trombo y la trombólisis, entonces este modelo es deseable.

Este modelo está destinado a probar candidatos a protectores cerebrales utilizando un modelo que emplea fielmente trombo y trombolisis. Las futuras direcciones podrían incluir también estudios de terapia adyuvante dirigida al fenómeno de no reflow. Muchos han propuesto anticoagulantes y agentes antiplaquetarios para este propósito.

En conclusión, el protocolo TE-MCAo presentado aquí está adaptado para permitir su despliegue en múltiples laboratorios. Simplificamos la preparación de trombos y agilizamos el enfoque quirúrgico. Ideamos un método para almacenar sangre de donantes, reduciendo significativamente el número de animales necesarios.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringuilla de 1 ml	BD	309628
Lupas 10x
Jeringuilla de 1 cc	Terumo	SS-01T
Aguja roma de 23g	Grainger	5FVK7
Jeringuilla de 3,0 cc	BD	309656
Ligadura de seda 3-0
Aguja de 30g	BD	305128
Sutura de proleno 5-0	Ethicon	8698	Para cerrar el corte de piel
Ligadura de seda 5-0	Ethicon	A182
Pinza para aneurisma
Sulfato de atropina	Vet One	NDC86136-006-10	Reducir las secreciones bronquiales
Pinzas con ranuras romas
Bupivacaína	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	Anestésicos locales
Cloruro de calcio	Sigma	C7902
Carprofeno	Zoetis Inc	NADA #141-199	Analgésicos
Tubos centrífugas	Eppendorf	22364111	Para la recogida de sangre
Etanol	Koptec	UN1170
Evan' s Azul	Sigma	E2129
Almohadilla térmica	Aparato de Harvard	K021-435
Pinza hemostática
Isoflurano	Vet One	NDC13985-528-60
Bucles definitivos de tejido hechos por mí	Grupos de horizonte	No aplicable	Ataduras blandas
Microtijeras	F.S.T.	15000-00
Microcatéteres	Corporación Doccol	PE-FL-360-200-300	Catéteres de inyección prefabricados
Catéter PE-10	BD	427401
Tubería PE-100	Intramédico	7426
Tubería PE-50	BD	427410
Tubos EDTA pediátricos	BD Microtainer	K2E-363706	Almacenar sangre de donante
Placa de Petri	Eppendorf	30702115
Solución salina tamponada con fosfato	Fisher	B2438
Vanguardia	PDI Inc.	NDC10189-1080-1	Antiséptico
Bastoncillo	VWR	89031-288
Cuchilla de afeitar	AccuTec Pro	71960
Solución salina	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
Tijeras	F.S.T.	14958-11
Pinzas afiladas
Bomba de jeringuilla	New Era Pumps Inc.	BS-300
Horno de mesa	Boekel	132000
Tenecteplase (TNK)	Genentech, San Francisco	NDC50242-120-47	Trombólisis
Etiqueta auricular	Laboratorio RapID, San Francisco, CA	Etiquetas RapID