Método de adición estándar

El método de adición estándar es una técnica de análisis cuantitativo utilizada para minimizar los efectos de la matriz que interfieren con las señales de medición del analito.

Las concentraciones de componentes desconocidos a menudo se dilucidan a través de una variedad de técnicas analíticas, como la espectroscopia de luz, la espectrometría de masas y la electroquímica. Sin embargo, la medición puede verse afectada por otros componentes de la muestra, llamada matriz, y causar la reducción o mejora inadvertida de la señal, llamados efectos de matriz. Estos efectos pueden sesgar los resultados y causar errores significativos en el análisis.

El método de adición de patrones se puede utilizar para minimizar los efectos de la matriz en las señales de medición. Esto se realiza añadiendo volúmenes precisos de una solución de analito conocida a la muestra.

Este video presentará los conceptos básicos del método de adición de patrones y demostrará cómo realizar la técnica en el laboratorio utilizando una medición de fluorescencia.

Los efectos de matriz pueden surgir en muestras complejas en las que varias otras moléculas interactúan con el analito. Por ejemplo, esto puede ocurrir cuando las moléculas se unen o aglomeran con el analito, cambiando así su capacidad de fluorescencia. O la matriz puede cambiar la fuerza iónica de la solución general, cambiando las propiedades específicas del analito.

Para mitigar estos efectos utilizando el método de adición estándar, se agrega un rango de volúmenes de una solución estándar de analito hasta volúmenes iguales de la muestra. A continuación, los volúmenes de solución se igualan con disolvente.

A continuación, se mide la señal para las muestras con y sin la adición estándar. Los datos se representan como intensidad frente a la cantidad del patrón añadido a la muestra, en lugar de una curva de calibración clásica. La concentración real del analito en un matraz determinado se define mediante la siguiente ecuación. La respuesta instrumental será igual a una constante multiplicada por la concentración de analito. La ecuación resultante toma la forma lineal y=mx+b. Por lo tanto, cuando el gráfico se extrapola a la absorbancia cero, la intersección es igual a la concentración desconocida de la muestra.

El diagrama de la señal debe ser lineal en el rango de concentración de interés. Además, la interferencia no debe variar a medida que cambia la relación entre el analito y la matriz de la muestra. Por último, la matriz en sí misma no debe generar ninguna señal de medición por sí sola.

El siguiente experimento estudia el aluminio, una especie no fluorescente, haciéndolo reaccionar con 8-hidroxiquinoleína, o 8HQ, para formar el complejo fluorescente ALQ3.

Se mide la fluorescencia del complejo de aluminio en un solvente orgánico y luego se relaciona con la concentración de la solución de aluminio original. Este enfoque es común en el análisis de iones metálicos.

Ahora que se han esbozado los conceptos básicos del método de adición estándar y se han explicado los conceptos básicos del experimento, realicemos la técnica en el laboratorio.

Primero, prepare la solución madre de aluminio de 100 ppm en agua y luego úsela para preparar una solución estándar de 1 ppm.

A continuación, añada 2 g de 8-hidroxiquinoleína, o 8HQ, a un matraz aforado de 100 ml.

Agregue con cuidado 5,74 ml de ácido acético glacial, luego diluya hasta la marca de 100 ml con agua desionizada. Este paso permite que el 8HQ se disuelva en la fase acuosa.

A continuación, prepare el tampón añadiendo 20 g de acetato de amonio y 7 mL de hidróxido de amonio al 30% en un frasco marcado de 100 mL y diluya. Verifique el pH con una varilla indicadora de pH. Este tampón ayuda a neutralizar el ácido en la solución 8HQ cuando se combina.

Otros reactivos necesarios incluyen sulfato de sodio anhidro y cloroformo de grado espectrofotométrico.

Ahora prepare las muestras, en este caso extrayendo la muestra acuosa a la fase orgánica mediante extracción líquido-líquido. Coloque seis embudos separadores de 125 ml en los anillos del soporte de anillo dentro del capó. Asegúrese de que toda la cristalería esté escrupulosamente limpia, ya que la cristalería sucia sesgará los resultados. Etiquete secuencialmente los embudos como "en blanco", "0", "1", "2", "3" y "4".

Con una pipeta, agregue 25 ml de la solución de aluminio desconocida a cada uno de los cinco embudos separadores etiquetados como "0" a "4". Prepare el blanco agregando 25 mL de agua desionizada al embudo etiquetado como "blanco".

A continuación, agregue 1, 2, 3 y 4 mL de la solución estándar de 1 ppm a los embudos numerados correspondientes. No agregue ninguna solución estándar a los embudos en blanco o 0.

Agregue 1 mL de la solución 8HQ y 3 mL de solución tampón a cada uno de los 6 embudos.

Realice una extracción líquido-líquido añadiendo 10 mL de cloroformo a cada matraz. Agite el embudo vigorosamente y, de vez en cuando, ventile el embudo para liberar la acumulación de presión. Vuelva a colocar el embudo en el anillo y permita que las capas de líquido se separen.

A continuación, recoja la fase de cloroformo en un vaso de precipitados de 100 ml limpio, seco y etiquetado. Dado que el cloroformo tiene una densidad más alta que el agua, es la capa inferior del embudo.

Transfiera el extracto de cloroformo a un matraz aforado de 25 ml y tape cada matraz para evitar la evaporación.

Realice una segunda extracción líquido-líquido en la solución acuosa restante, agregando 10 mL de cloroformo a cada embudo. Agite el embudo, como antes, para transferir el analito restante a la fase de cloroformo. No debe quedar color amarillo en la fase acuosa superior.

Repita la segunda extracción para cada embudo, luego recoja las fases de cloroformo en los vasos de precipitados etiquetados correspondientes. Vierta el cloroformo recogido en sus respectivos matraces aforados y diluya hasta la marca con cloroformo fresco.

Para eliminar las trazas de agua, agregue aproximadamente 1 g de sulfato de sodio anhidro a cada uno de los seis vasos de precipitados de 100 ml. Transfiera las soluciones de nuevo a sus respectivos vasos de precipitados y gírelas para facilitar la deshidratación de la muestra.

Decantar el extracto de cloroformo en una celda de fluorímetro de cuarzo.

Configure el fluorímetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante y ajuste el voltaje a 400 V. A continuación, abra el programa de adquisición de datos en la computadora.

Utilice la muestra 2 para determinar las mejores longitudes de onda de excitación y emisión. Establezca la longitud de onda de emisión en 500 nm y ejecute un escaneo de excitación de 335 a 435 nm, con una velocidad de escaneo de 2 nm/s.

A partir del gráfico de fluorescencia, determine la longitud de onda máxima para la excitación. Ajuste el instrumento a ese valor de longitud de onda de excitación, en este caso 399 nm.

A continuación, determine la longitud de onda de emisión realizando un escaneo de 450 a 550 nm. A partir del diagrama de fluorescencia resultante, determine la longitud de onda máxima y establezca la longitud de onda de emisión, en este caso 520 nm.

Mida cada muestra, incluido el blanco en la longitud de onda de excitación y emisión seleccionada. Registre cada lectura de intensidad de fluorescencia.

Reste la fluorescencia medida de la muestra en blanco de cada una de las otras 5 muestras.

Traza la intensidad de fluorescencia de cada una de las cinco muestras en comparación con la cantidad de aluminio añadida a la muestra. Determine el valor de mínimos cuadrados de la gráfica resultante y registre la pendiente y la intersección.

El gráfico de la intensidad de fluorescencia frente a la cantidad de aluminio agregado produjo una línea de mínimos cuadrados, como se muestra. La cantidad de aluminio en la muestra se puede calcular usando esta línea. Dado que la cantidad de incógnita añadida fue de 25 mL, el valor determinado, 2,916 μg, se divide por 25 mL. Esto da un resultado final de 0,117 μg/mL, o 0,117 ppm. Esto está bastante cerca del valor conocido de 0,110 ppm.

Ahora, veamos algunas otras técnicas analíticas que pueden tener resultados sesgados debido a los efectos de la matriz.

La espectroscopia de absorción atómica es un método analítico que mide la absorbancia de la luz por un analito objetivo en la fase gaseosa. Para la mayoría de las muestras, una curva de calibración simple que relacione la absorción con la concentración de la muestra puede servir como un método confiable para cuantificar una concentración desconocida.

Sin embargo, esta técnica puede perder precisión si otros componentes de la mezcla interactúan con el analito objetivo y suprimen o mejoran la absorción. El método de adición estándar se puede utilizar en este caso para tener en cuenta los efectos de estas interacciones, especialmente en muestras en las que la matriz no se puede eliminar antes del análisis.

La calibración del instrumento juega un papel crucial en la precisión de una medición. El método de adición de patrones se utiliza a menudo para ayudar en la calibración de instrumentos como ICP-MS. ICP-MS es un método comparativo, lo que significa que la medición de una muestra desconocida se basa en la medición de un patrón químico.

Por lo tanto, la incertidumbre de una medición de una incógnita no puede ser mejor que la incertidumbre de la calibración. Por lo tanto, el método de adición estándar se puede utilizar para crear una curva de calibración que sea más precisa que el método estándar y tenga en cuenta las interacciones de la matriz en la muestra.

Muchas moléculas biológicas se analizan mediante cromatografía líquida de alta resolución o HPLC. La HPLC es una técnica que separa y analiza mezclas complejas en función de las propiedades de las moléculas, como la polaridad, la carga y el tamaño. El momento en el que el analito abandona la columna permite al usuario identificar cada componente de la mezcla.

Las moléculas biológicas a menudo pueden interactuar en una mezcla y se ven muy afectadas por la matriz en la que están suspendidas. A menudo, el método de adición estándar se utiliza para crear una curva de calibración que tiene en cuenta estos efectos.

Acabas de ver la introducción de JoVE al método de adición estándar. Ahora debe comprender cómo realizar la técnica para tener en cuenta los efectos de la matriz en el análisis de muestras.

¡Gracias por mirar!