Cultivos puros y siembra por estrías: aislamiento de colonias bacterianas únicas de una muestra mixta

En un plato de Petri, si una sola bacteria se somete a múltiples rondas de reproducción asexual, conducirá a la formación de una colonia clonal. Sin embargo, obtener una sola bacteria de una muestra mixta, como una suspensión del suelo, puede ser difícil. Si se toma un bucle lleno de este cultivo heterogéneo, puede contener hasta un billón de bacterias individuales. Para esparcir estas muchas bacterias en la superficie de una placa de agar y obtener una sola colonia, incluso usando un patrón en zig-zag, el bucle tendría que ser arrastrado continuamente sobre la superficie de suficientes placas establecidas una al lado de la otra para rodear la totalidad de Liberty Island. Obviamente, los científicos no usan tantas placas. En su lugar, utilizan una técnica llamada revestimiento de rayas.

La técnica de la placa de raya se basa en la dilución progresiva de una muestra bacteriana, y se realiza sobre la superficie de medios sólidos de una sola placa De Petri. Para empezar, la superficie del medio se divide visualmente en cinco secciones asignando cuatro fragmentos de la circunferencia como las primeras cuatro secciones, y el centro de la placa como la quinta. Esto creará efectivamente cinco placas de medios de un solo plato de Petri. A continuación, usando un bucle lleno de inóculo deseado, la primera sección se raya usando un patrón en zig-zag. Luego, ya sea un nuevo bucle desechable se utiliza, o en el caso de un bucle de alambre, se esteriliza con un quemador Bunsen, quese quema hasta que está rojo caliente a lo largo de la longitud del alambre. Este uso de un nuevo bucle, o bucle de esterilización de llama, elimina las células bacterianas restantes, ayudando en la dilución de las bacterias. El bucle caliente se enfría en el aire durante unos segundos antes de ser arrastrado a través de la primera sección para crear de tres a cuatro líneas separadas, cada una llevando sólo una fracción de bacterias en la segunda sección. Las secciones restantes se rayan de la misma manera, usando un bucle estéril cada vez, y un solo paso a través de la raya anterior.

Usando este ciclo de rayado y esterilización, la concentración bacteriana en cada sección posterior debe diluirse de modo que la sección final contenga sólo unas pocas bacterias discretamente localizadas. Tras la incubación, estas bacterias discretas se multiplican para producir colonias clonales aisladas de células hijas, que se conocen como Unidades formadoras de colonias, o UFC. Estos pueden ser cosechados y re-streaked para asegurar que el trabajo posterior implica sólo un solo tipo de bacteria, conocido como un cultivo puro. Además de aislar colonias individuales de un cultivo mixto-bacteriano, la técnica de revestimiento de rayas también se utiliza para seleccionar cepas específicas de medios, determinar la morfología de colonias bacterianas o identificar diferentes especies bacterianas. En este video, demostraremos cómo aislar colonias monobacterianas de una suspensión de muestra smezclar-bacteriana a través de la técnica de revestimiento de rayas.

Para empezar, ponte guantes de laboratorio y un abrigo de laboratorio. A continuación, esterilizar el espacio de trabajo con 70% de etanol. A continuación, seleccione un medio adecuado que sostenga las especies bacterianas o cepas utilizadas y comience a preparar los medios. Aquí, el agar LB común se prepara pesando diez gramos de medios pre-formulados en polvo y 7,5 gramos de agar. Agregue los componentes pesados y secos a una botella de vidrio que es capaz de sostener el doble del volumen final para evitar el desbordamiento. Luego, agregue 500 mililitros de agua a la botella, y colóquela semi-firmemente. Esterilice el medio colocando la botella en un autoclave ajustado a 121 grados centígrados durante veinte minutos. Después de la finalización, use guantes a prueba de calor o una almohadilla caliente para quitar el medio de la máquina y luego gire inmediatamente la tapa de la botella para cerrarla firmemente.

Para el uso en el mismo día, deje que el medio se enfríe colocando la botella en un baño de agua calentado a aproximadamente 45 grados centígrados, para preservar los medios en estado líquido. Alternativamente, el medio se puede dejar a temperatura ambiente para almacenar en estado sólido. Cuando sea necesario, microonda la botella con la tapa ligeramente abierta para derretir el medio, y deje que el medio se enfríe con un baño de agua celsius de 45 grados.

A continuación, tome una manga de platos estériles de Petri, y con un marcador permanente, etiquételos con el investigador y los nombres de los medios de comunicación, así como la fecha. A continuación, transfiera el volumen requerido de medios a un recipiente estéril y agregue antibióticos u otros componentes sensibles si es necesario. Aquí, 50 mililitros de medios se mezclan con 100 microlitros de Kanamicina para una concentración final de 25 microgramos por mililitro. Gire el tubo para asegurar una distribución uniforme de los componentes añadidos en todo el soporte. Lentamente, para evitar la formación de burbujas, verter 20 a 25 mililitros de aproximadamente 45 grados celsius medio de cultivo en cada una de las placas. Si aparecen burbujas o espuma, retírelo rápidamente con una pipeta normal y una punta estéril. A continuación, sustituya inmediatamente todas las tapas para evitar la contaminación. Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente durante al menos dos horas o durante la noche. Una vez solidificado, guarde las placas de cultivo boca abajo a cuatro grados centígrados para minimizar la condensación en la superficie del medio.

Para rayar el cultivo de elección, primero tome una placa de cultivo limpia y retire la tapa. Trabajando rápidamente, sumerja un lazo desechable y estéril en el inóculo deseado y luego frote inmediatamente el lazo sobre el primer cuadrante de la placa usando un movimiento en zig-zag. Reemplace la tapa del plato, deseche el bucle de inoculación usado y, a continuación, seleccione un nuevo lazo estéril. Usando el nuevo bucle, haz de tres a cuatro golpes cruzando la línea original del hisopo que irradia desde el primer cuadrante, que debe contener una población de bacterias relativamente densa en el segundo cuadrante. Cierre la tapa una vez más y deseche el lazo. Con un nuevo bucle, repita esta acción de nuevo, pero esta vez rayando desde el segundo hasta el tercer cuadrante. Luego, con un nuevo lazo de nuevo, hacer otra raya desde la tercera en la cuarta sección de la placa. Finalmente, con un lazo fresco, haz un último trazo en un patrón en zig-zag desde el cuarto cuadrante hacia el centro de la placa. La prevalencia bacteriana será menor en esta área, lo ideal es permitir que se establezcan colonias individuales a partir de una sola célula madre viable.

Sustituya la tapa de la placa y, si es apropiado para las especies bacterianas, selle la placa con para película para evitar el flujo de aire. Gire la placa de cultivo al revés para evitar goteos de condensación y, a continuación, colóquela a una temperatura adecuada para el crecimiento. Aquí, una incubadora se establece en 37 grados Celsius. Deje que la placa se incuba hasta que las colonias bacterianas sean visibles. Para generar una población bacteriana clonal, seleccione una colonia discreta de esta placa. Ahora, con el lazo estéril, toque la colonia objetivo, y como antes, haga una raya en el primer cuadrante de una placa nueva. Continúe esterilizando alternativamente el lazo y raye los cuadrantes restantes de la placa como se demostró anteriormente, terminando con el zig-zag hacia el centro. Cierre la placa y colóquela para incubar la cual se formen colonias discretas. Una vez que estas colonias se cultivan, por lo general representan cepas clonales puras.

La placa de raya inicial puede contener colonias originarias de células de diferentes especies bacterianas o células con diferente composición genética, dependiendo de la pureza de la muestra. A través del aislamiento posterior de una sola colonia, donde todas las unidades se derivan de una célula madre común, el segundo procedimiento de rayado genera una población bacteriana relativamente clonal, adecuada para una mayor caracterización o inoculación en caldo.