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En una placa de Petri, si una sola bacteria se somete a múltiples rondas de reproducción asexual, conducirá a la formación de una colonia clonal. Sin embargo, obtener una sola bacteria a partir de una muestra mixta, como una suspensión del suelo, puede ser difícil. Si se toma un bucle de este cultivo heterogéneo, puede contener hasta un billón de bacterias individuales. Para esparcir tantas bacterias en la superficie de una placa de agar y obtener una sola colonia, incluso usando un patrón en zig-zag, el bucle tendría que ser arrastrado continuamente sobre la superficie de suficientes placas colocadas una al lado de la otra para rodear la totalidad de la Isla de la Libertad. Obviamente, los científicos no usan realmente tantas placas. En su lugar, utilizan una técnica llamada enchapado en rayas.
La técnica de placa de rayas se basa en la dilución progresiva de una muestra bacteriana y se realiza sobre la superficie sólida del medio de una sola placa de Petri. Para empezar, la superficie del medio se divide visualmente en cinco secciones asignando cuatro fragmentos de la circunferencia como las primeras cuatro secciones, y el centro de la placa como la quinta. Esto creará efectivamente cinco placas de medios a partir de una sola placa de Petri. A continuación, utilizando un bucle de inóculo deseado, la primera sección se raya con un patrón en zig-zag. Luego, se usa un nuevo lazo desechable o, en el caso de un lazo de alambre, se esteriliza con un mechero Bunsen, flameándolo hasta que esté al rojo vivo a lo largo del alambre. Este uso de un nuevo bucle, o bucle de esterilización por llama, elimina las células bacterianas restantes, lo que ayuda a la dilución de las bacterias. Luego, el bucle caliente se enfría en el aire durante unos segundos antes de ser arrastrado a través de la primera sección para crear tres o cuatro líneas separadas, cada una de las cuales transporta solo una fracción de bacterias a la segunda sección. Las secciones restantes se rayan de la misma manera, usando un bucle estéril cada vez, y una sola pasada a través de la raya anterior.
Usando este ciclo de rayado y esterilización, la concentración bacteriana en cada sección subsiguiente debe diluirse para que la sección final contenga solo unas pocas bacterias discretamente ubicadas. Tras la incubación, estas bacterias discretas se multiplican para producir colonias clonales aisladas de células hijas, que se conocen como Unidades Formadoras de Colonias o UFC. Estos se pueden cosechar y volver a rayar para garantizar que el trabajo posterior involucre un solo tipo de bacteria, lo que se conoce como cultivo puro. Además de aislar colonias individuales de un cultivo de bacterias mixtas, la técnica de siembra de rayas también se utiliza para seleccionar cepas específicas del medio, determinar la morfología de las colonias bacterianas o identificar diferentes especies bacterianas. En este video, demostraremos cómo aislar colonias de bacterias individuales de una suspensión de muestra de bacterias mixtas mediante la técnica de recubrimiento de rayas.
Para empezar, ponte guantes de laboratorio y una bata de laboratorio. A continuación, esterilice el espacio de trabajo con etanol al 70%. A continuación, seleccione un medio adecuado que sustente las especies o cepas bacterianas utilizadas y comience a preparar el medio. Aquí, el agar LB común se prepara pesando diez gramos de medios preformulados en polvo y 7,5 gramos de agar. Agregue los componentes pesados y secos a una botella de vidrio que pueda contener el doble del volumen final para evitar desbordamientos. Luego, agregue 500 mililitros de agua a la botella y táplate semiherméticamente. Esterilice el medio colocando el biberón en un autoclave ajustado a 121 grados centígrados durante veinte minutos. Una vez finalizado, use guantes resistentes al calor o una almohadilla caliente para quitar el medio de la máquina y luego gire inmediatamente la tapa de la botella para cerrarla herméticamente.
Para el uso en el mismo día, deje que el medio se enfríe colocando la botella en un baño de agua calentado a aproximadamente 45 grados Celsius, para preservar el medio en estado líquido. Alternativamente, los medios se pueden dejar a temperatura ambiente para almacenarlos en estado sólido. Cuando sea necesario, cocine la botella en el microondas con la tapa ligeramente abierta para derretir el medio y deje que el medio se enfríe con un baño de agua a 45 grados centígrados.
A continuación, tome una funda de placas de Petri estériles y, con un marcador permanente, etiquételas con los nombres del investigador y los medios de comunicación, así como la fecha. Luego, transfiera el volumen requerido de medios a un recipiente estéril y agregue antibióticos u otros componentes sensibles si es necesario. Aquí, 50 mililitros de medio se mezclan con 100 microlitros de kanamicina para obtener una concentración final de 25 microgramos por mililitro. Gire el tubo para asegurar una distribución uniforme de los componentes agregados a través del medio. Lentamente, para evitar la formación de burbujas, vierta de 20 a 25 mililitros de medio de cultivo de aproximadamente 45 grados centígrados en cada una de las placas. Si aparecen burbujas o espuma, retírela rápidamente con una pipeta normal y una punta estéril. Luego, reemplace inmediatamente todas las tapas para evitar la contaminación. Deje que el agar se solidifique a temperatura ambiente durante al menos dos horas o toda la noche. Una vez solidificadas, almacene las placas de cultivo boca abajo a cuatro grados centígrados para minimizar la condensación en la superficie del medio.
Para rayar el cultivo de su elección, primero tome un plato de cultivo limpio y retire la tapa. Trabajando rápidamente, sumerja un asa estéril desechable en el inóculo deseado y luego frote inmediatamente el asa sobre el primer cuadrante de la placa con un movimiento en zig-zag. Vuelva a colocar la tapa del plato, deseche el asa de inoculación usada y luego seleccione un nuevo asa estéril. Usando el nuevo bucle, haga tres o cuatro trazos cruzando la línea de hisopo original que irradia desde el primer cuadrante, que debe contener una población de bacterias relativamente densa en el segundo cuadrante. Cierre la tapa una vez más y deseche el bucle. Con un nuevo bucle, repita esta acción de nuevo, pero esta vez pasando del segundo al tercer cuadrante. Luego, con un nuevo bucle de nuevo, haz otra raya desde la tercera hasta la cuarta sección del plato. Finalmente, con un bucle nuevo, haz un último trazo en un patrón en zig-zag desde el cuarto cuadrante hacia el centro de la placa. La prevalencia bacteriana será menor en esta área, lo que idealmente permitirá establecer colonias individuales a partir de una sola célula madre viable.
Vuelva a colocar la tapa de la placa y, si es apropiado para las especies bacterianas, selle la placa con una película para evitar el flujo de aire. Dé la vuelta a la placa de cultivo para evitar goteos de condensación y luego colóquela a una temperatura adecuada para el crecimiento. Aquí, una incubadora está configurada a 37 grados centígrados. Deje que la placa se incube hasta que las colonias bacterianas sean visibles. Para generar una población bacteriana clonal, seleccione una colonia discreta de esta placa. Ahora, con el bucle estéril, toque la colonia objetivo y, como antes, haga una raya en el primer cuadrante de una nueva placa. Continúe esterilizando alternativamente el bucle y raye los cuadrantes restantes de la placa como se demostró anteriormente, terminando con el zig-zag hacia el centro. Cierre el plato y colóquelo para incubar hasta que se formen colonias discretas. Una vez que estas colonias crezcan, generalmente representarán cepas clonales puras.
La placa de rayas inicial puede contener colonias que se originan a partir de células de diferentes especies bacterianas o células con diferente composición genética, dependiendo de la pureza de la muestra. A través del aislamiento posterior de una sola colonia, donde todas las unidades se derivan de una célula madre común, el segundo procedimiento de rayado genera una población bacteriana relativamente clonal, adecuada para una mayor caracterización o inoculación en caldo.
