Secuenciación del ARNr 16s: Una técnica basada en PCR para identificar especies bacterianas

1. Configurar

1. Mientras se manipulan microorganismos, se requiere seguir buenas prácticas microbiológicas. Todos los microorganismos, especialmente las muestras desconocidas, deben tratarse como patógenos potenciales. Siga la técnica aséptica para evitar contaminar las muestras, los investigadores o el laboratorio. Lávese las manos antes y después de manipular las bacterias, use guantes y use ropa protectora.
2. Llevar a cabo una evaluación de riesgos para el protocolo experimental para el aislamiento del ADN genómico y la purificación del producto PCR. ¡Algunos reactivos pueden ser dañinos!
3. El cultivo puro es esencial para la secuenciación de rRNA 16S. Antes de proceder al aislamiento del ADN genómico, asegúrese de que el material de partida sea completamente puro. Esto se puede hacer mediante el revestimiento de rayas para aislar colonias individuales. Estos pueden ser más cultivados rayados en platos individualmente, o en caldo, si es necesario.
4. Equipo de laboratorio requerido:
   1. Ciclor térmico para PCR. La función del ciclor térmico es subir y bajar la temperatura según un programa establecido. Al crear el programa se le pedirá que introduzca los valores de temperatura y tiempo para cada paso de PCR, así como el número total de ciclos.
   2. Sistema de electroforesis de gel de agarosa. Se utiliza para separar fragmentos de ADN en función de su tamaño y carga. En este protocolo, la electroforesis de gel de agarosa se utilizará para visualizar la calidad de los productos aislados de ADN genómico y PCR.

2. Protocolo

Nota: El protocolo demostrado se aplica a la secuenciación del gen rRNA 16S de un cultivo puro de bacterias. No se aplica a estudios metagenómicos.

1. Bacterias de cultivo para el aislamiento del ADN genómico (ADN)
   1. Haga crecer su microorganismo en un medio adecuado. Tanto los medios líquidos como los sólidos se pueden utilizar en este paso. Elija condiciones que produzcan el mejor crecimiento. Al planear el experimento, tenga en cuenta que las bacterias de crecimiento lento pueden necesitar varios días para llegar a la fase de crecimiento estacionario o registro tardío. En este protocolo, Bacillus subtilis 168 fue cultivado en caldo de lisabagenia (LB) durante la noche en una incubadora de agitación establecida a 200 rpm, 37oC.
2. Aislamiento de gDNA.
   1. Si las bacterias se cultivaban en un medio sólido, raspar algunas células usando un lazo estéril y resuspenderlas en 1 ml de agua destilada
   2. Si las bacterias se cultivan en medio líquido, utilice aproximadamente 1,5 ml de un cultivo nocturno.
   3. Reventar las células por centrifugación (1 minuto, 12.000 - 16.000 g), eliminar el sobrenadante y utilizar las células para el aislamiento de ADNes utilizando un kit comercial o protocolos estándar[ por ejemplo, preparación total del ADN CTAB (13) o extracción de fenol-cloroformo (14)]. Aquí, se utilizó un kit comercial para aislar el ADNr de 1,5 ml de cultivo nocturno De B. subtilis 168, OD₆₀₀ a 1,5.
      Nota 1: Para algunas bacterias Gram-negativas este paso puede ser omitido y reemplazado por la simple liberación de ADN de las células por ebullición. Resuspender el pellet bacteriano en agua destilada e incubar en un bloque de calentamiento establecido a 100 oC durante 10 minutos.
      Nota 2: Las células bacterianas Gram-positivas son difíciles de interrumpir. Por lo tanto, se recomienda elegir un método o kit de aislamiento de ADNado que se dedique al aislamiento de este grupo de bacterias.
3. control de calidad gDNA.
   1. Compruebe la calidad del ADNamediante aislado mediante electroforesis de gel de agarosa. En primer lugar, mezcle 5 ml del ADNN aislado con 1 l del tinte de carga (6x) y cargue la muestra en un gel de agarosa del 0,8% que contenga un reactivo de tinción de ADN.
   2. Cargue un estándar de masa molecular y ejecute la electroforesis hasta que el frente del tinte alcance la parte inferior del gel.
   3. Una vez completada la electroforesis, visualice el gel en un transiluminador adecuado (luz UV o azul). gDNA aparece como una banda molecular alta gruesa (por encima de 10 kb). En la Figura 3se muestra un ejemplo de la comprobación de calidad de gDNA.
   4. Si el gDNA pasa el control de calidad(es decir,la banda molecular alta está presente y hay poco o ningún frotis del ADN) , diluir su gDNA en serie mediante el primer etiquetado de 3 tubos de microcentrífuga de la siguiente manera: "10x", "100x" y "1000x".
   5. Pipetear 90 l de agua destilada estéril en cada uno de los 3 tubos.
   6. Tomar 10 sde la solución de ADNG y añadirla al tubo marcado como "10x".
   7. Encinerñe todo el volumen(es decir, 100 l) hacia arriba y hacia abajo a fondo para asegurarse de que la solución se mezcla uniformemente. A continuación, tome 10 s de la solución de este tubo y transfiérala al tubo marcado como "100x".
   8. Mezclar como se ha descrito anteriormente y repetir el mismo procedimiento transfiriendo 10 l de la solución del tubo "100x" al tubo "1000x". Estas diluciones se utilizarán como plantilla en la reacción PCR.

Figura 3: Electroforesis de gel de agarosa de ADNaaislado de Bacillus subtilis. Carril 1: M - marcador de masa molecular (de arriba a abajo: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000 bp). Carril 2: gDNA - ADN genómico aislado de Bacillus subtilis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Amplificación del gen rRNA 16S por PCR.
   Nota: El protocolo PCR que figura a continuación está optimizado para un par de imprimación y polimera sin ADN en particular 8F - 1492R (véase el cuadro 1). Se requiere la optimización del protocolo para cada par de polimerasa e imprimación.
   1. Descongela todos los reactivos en hielo.
   2. Prepare la mezcla maestra PCR tal y como se muestra en del Cuadro 2. Dado que la polimerasa de ADN está activa a temperatura ambiente, la configuración de reacción debe realizarse en hielo, es decir, los tubos PCR y los componentes de reacción deben mantenerse en hielo todo el tiempo. Prepare una reacción por cada muestra de ADNr y una reacción para un control negativo. El control negativo es una mezcla de PCR sin la plantilla de ADNr y se utiliza para garantizar que los demás componentes de la reacción no estén contaminados.
      Nota: En el caso de varias muestras, se prepara comúnmente una mezcla maestra. La mezcla maestra es una solución que contiene todos los componentes de reacción excepto la plantilla. Ayuda a omitir el pipeteo repetitivo, evitar errores de pipeteo y garantiza una alta consistencia entre las muestras. Para preparar la mezcla maestra, multiplique el volumen de cada componente (excepto la plantilla de ADN) por el número de muestras analizadas. Mezclar todos los componentes en el tubo de microcentrífuga y canalizar todo el volumen hacia arriba y hacia abajo varias veces.
   3. Aliquot 49 l de la mezcla maestra en los tubos PCR individuales.
   4. Añadir plantilla de 1 L en tubos con mezcla maestra. Para un control negativo, agregue 1 l de agua estéril. Para asegurarse de que los componentes estén bien mezclados, entube suavemente la mezcla hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta establecida en 30-50 l.
   5. Ajuste la máquina PCR con el programa que se muestra en la Tabla 3.
   6. Coloque los tubos en la máquina PCR e inicie el programa.
   7. Una vez completado el programa, examine la calidad de su producto PCR mediante la electroforesis de gel de agarosa.
   8. Una reacción de PCR exitosa utilizando el par de imprimación 8F-1492R produce una sola banda de aproximadamente 1,5 kb(Figura 4). Si hay otras bandas (es decir, productos inespecíficos), optimice el programa de PCR ajustando la temperatura de recocido. Si hay una sola banda del tamaño esperado, continúe con el paso siguiente. Aquí, la reacción de PCR con plantilla de ADNado diluido 100x produjo el mejor producto, ya que tenía una banda afilada de tamaño esperado y carecía de productos inespecíficos. Por lo tanto, fue elegido para ser purificado y enviado para la secuenciación.
   9. Antes de la secuenciación, el producto debe limpiarse de imprimaciones residuales, desoxirribonucleótidos, polimerasa y tampón que estaban presentes en la reacción de PCR. Los productos PCR se pueden aislar utilizando un kit de purificación de PCR comercial. La reacción PCR se carga en una columna que contiene una matriz de enlace de ADN. El producto PCR se enlaza a la columna, mientras que otros componentes fluyen a través de la columna. La columna se lava con tampón de lavado, y finalmente, el ADN se eluye en el tampón de elección. Confirme que el búfer de elución que se complementa con el kit es compatible con la secuenciación.
   10. Envíe el producto PCR purificado para la secuenciación de ADN. Siga las directrices para la presentación de muestras de secuenciación en la instalación de secuenciación elegida. Para obtener la mejor cobertura de secuencia, utilice las imprimaciones de amplificación de PCR (las mismas que se utilizan en la sección 2.4.1) que las imprimaciones de secuenciación. Aquí, las imprimaciones 8F y 1492R se utilizaron para secuenciar el producto PCR.

Componente	Concentración final	Volumen por reacción	Volumen por x reacciones (mezcla maestra)
Búfer de reacción 5x	1x	10 l	10 l x x
DNTP de 10 mM	200 M	1 L	1 l x x
10 M Primer 8F	0,5 m	2,5 l	2,5 sL x x
10 M Primer 1492R	0,5 m	2,5 l	2,5 sL x x
Phusion polimerasa	1 unidad	0,5 l	0,5 sL x x
ADN de plantilla *	-	1 L	-
ddH2O	-	32,5 l	32,5 l x x
Volumen total		50 l	49 l x x

Cuadro 2: Componentes de reacción PCR. * Utilice el ADNado diluido de 10x, 100x o 1000x del paso 2.3.

Paso	Temperatura	hora	Ciclos
Desnaturalización inicial	98oC	30 seg
Desnaturalización	98oC	10 seg	25-30
Recocido	60oC	30 seg
Extensión	72oC	45 seg
Extensión final	72oC	7 min
Mantener	4oC	∞

Cuadro 3: Programa PCR para la amplificación del gen rRNA 16S.

Figura 4: Electroforesis de gel de agarosa de productos PCR amplificadas utilizando imprimaciones 8F y 1492R y gDNA como plantilla. La muestra de ADN g de B. subtilis (ver figura 3) se diluyó 10, 100 y 1000 veces con el fin de probar el mejor resultado. Carril 1: M - marcador de masa molecular (de arriba a abajo: 10000 bp, 8000 bp, 6000 bp, 5000 bp, 4000 bp, 3500 bp, 3000 bp, 2500 bp, 2000 bp, 1500 bp, 1000bp, 750 bp, 500 bp, 250 bp). Carril 2: Reacción PCR con plantilla diluida 10x. Carril 3: Reacción PCR con plantilla diluida de 100x. Carril 4: Reacción PCR con plantilla diluida 1000x. Carril 5: (C-) - control negativo (reacción sin la plantilla de ADN). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Análisis de datos y resultados

Nota: El producto PCR se secuencia utilizando las imprimaciones delanteras (aquí 8F) y inversas (aquí 1492R). Por lo tanto, se generan dos conjuntos de secuencia de datos, uno para el avance y otro para el primer inverso. Para cada secuencia se generan al menos dos tipos de archivo: i) un archivo de texto que contiene la secuencia de ADN y ii) un cromatograma de ADN, que muestra la calidad de la ejecución de secuenciación.

1. Para la imprimación delantera, abra el cromatograma y examine cuidadosamente la secuencia. Un cromatograma ideal para una secuencia de calidad debe tener picos espaciados uniformemente y pocas o ninguna señal de fondo(Figura 5A).
2. Si el cromatograma no es de alta calidad, la secuencia debe descartarse o el archivo de texto de secuencia debe revisarse de acuerdo con lo siguiente:
   1. La presencia de picos dobles a lo largo del cromatograma indica la presencia de múltiples plantillas de ADN. Esto puede ser el caso si el cultivo bacteriano no era puro. Dicha secuencia debe descartarse(Figura 5B).
   2. Un cromatograma ambiguo puede surgir de la presencia de picos de diferentes colores en la misma ubicación. Uno de los errores más comunes es la presencia de dos picos de colores diferentes en la misma posición y la asignación incorrecta de las bases por el software de secuenciación(Figura 5C). Corrija manualmente los nucleótidos asignados incorrectamente y edítelos en el archivo de texto.
   3. Los cromatogramas de baja resolución pueden dar lugar a "picos amplios" que a menudo causan recuentos erróneos de los nucleótidos en estas regiones(Figura 5D). Este error es difícil de corregir y, por lo tanto, las posibles discrepancias en el paso de alineación posterior no deben tratarse como fiables.
   4. La mala calidad de lectura de cromatogramas y la presencia de múltiples picos se ve comúnmente en los extremos de 5' y 3' de la secuencia. Algunos software secuenciador eliminan estos fragmentos de baja calidad automáticamente(Figura 5E),y los nucleótidos no se incluyen en el archivo de texto. Si la secuencia no se truncó automáticamente, determine los fragmentos de baja calidad(por ejemplo, señal débil, picos superpuestos, pérdida de resolución) en los extremos y elimine las bases respectivas del archivo de texto.

Figura 5: Ejemplos de solución de problemas de secuenciación de ADN. A) Un ejemplo de una secuencia de cromatogramas de calidad (picos uniformemente espaciados e inequívocos). B) Secuencia de mala calidad que generalmente ocurre al principio del cromatograma. El área de la zona gris se considera de baja calidad y se elimina automáticamente por el software de secuenciación. Más bases se pueden recortar manualmente. C) Presencia de picos dobles (indicados por flechas). Un nucleótido que se indica mediante la flecha roja ha sido leído por el secuenciador como "T" (pico rojo), pero el pico azul es más fuerte, y también se puede interpretar como "C". D) Los picos superpuestos indican contaminación del ADN(es decir, más de una plantilla). E) Pérdida de resolución y los llamados "picos anchos" (marcados por rectángulo) que impiden la llamada base confiable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Repita 3.1 y 3.2 para la imprimación inversa.
4. Por último, ensamble las secuencias de avance e retroceso en una secuencia contigua. Una buena ejecución de secuenciación produce una secuencia de hasta 1100 bp. Teniendo en cuenta que el producto PCR tiene 1500 bp de largo, las secuencias obtenidas utilizando imprimaciones hacia delante y hacia atrás deben superponerse parcialmente.
   1. Combine las dos secuencias utilizando el programa de ensamblaje de secuencia de ADN, por ejemplo, una herramienta gratuita como CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
   2. Inserte las dos secuencias en formato FASTA en el cuadro indicado. Haga clic en el botón "Enviar" y espere a que los resultados vuelvan.
   3. Para ver la secuencia montada pulse "Contigs" en la pestaña de resultados. Para ver los detalles de la alineación pulse "Detalles de ensamblaje".
      Nota 1: Si el software CAP3 se utiliza para el ensamblaje contig, no es necesario convertir la secuencia de imprimación inversa en complementaria inversa; sin embargo, este paso podría ser necesario si se utiliza otro programa.
      Nota 2: El formato FASTA es un formato basado en texto para representar la secuencia de nucleótidos. La primera línea (la línea de descripción) de un archivo FASTA comienza con un símbolo ">" seguido del nombre o un identificador único de la secuencia. Siguiendo la línea de descripción está la secuencia de nucleótidos. Pegue las secuencias en el siguiente formato:
      
      >sequence_frw_primer
      pegar su secuencia desde el archivo de texto aquí
      >sequence_rvs_primer
      pegar su secuencia desde el archivo de texto aquí
5. Realice una búsqueda en la base de datos visitando el sitio web para la Herramienta básica de búsqueda de alineación local (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
   1. Seleccione la herramienta "Nucleotide BLAST" para comparar su secuencia con la base de datos.
   2. Introduzca su secuencia (la contig ensamblada en 3.5) en el cuadro de texto "Secuencia de consulta" y, a continuación, seleccione la base de datos "Secuencias rRNA 16S (Bacterias y Archea)" en el menú de desplazamiento hacia abajo.
   3. Pulse el botón "BLAST" en la parte inferior de la página. Se devolverán las secuencias más similares. En la Figura 6se muestra un ejemplo de resultado BLAST. En el experimento presentado el éxito más alto es B. subtilis strain 168, mostrando 100% de identidad con la secuencia disponible en la base de datos BLAST.
   4. Si el hit superior no muestra la identidad del 100%, vaya a la alineación y compruebe si hay discrepancias. Al hacer clic en el golpe superior, se le dirigirá a los detalles de la alineación. Los nucleótidos alineados se unirán por líneas verticales cortas, mientras que los nucleótidos no coincidentes tienen un espacio entre ellos. Vuelva al cromatograma que recibió de la empresa de secuenciación y revise la secuencia una vez más con el foco en la región no coincidente. Corrija la secuencia si se encuentra algún error adicional. Ejecute BLAST de nuevo utilizando la secuencia corregida.

Figura 6: Ejemplo del resultado de la BLAST de nucleótidos. La secuencia del gen 16S rRNA del cultivo puro de B. subtilis 168 se utilizó como secuencia de consulta. El primer éxito muestra 100% de identidad (subrayado) a la cepa B. subtilis 168, como se esperaba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.