Ensayo del anillo aórtico

El objetivo general del ensayo del anillo aórtico es proporcionar un sistema experimental flexible en el que los vasos sanguíneos brotan de piezas enteras de aorta de ratón dentro de una matriz 3D. Esto se logra diseccionando primero la aorta torácica de un ratón y luego limpiándola cuidadosamente de cualquier tejido circundante sobrante. Las rebanadas de la aorta limpia o los anillos aórticos se colocan en pocillos individuales de una placa de 48 pocillos, cada uno con extracto de matriz basal o BME moldeado en cúpulas.

Una gota extra de BME encierra el anillo en una estructura 3D. La matriz puede contener cualquier reactivo experimental de su elección. Después de la incubación durante varios días, se puede observar que los vasos brotan de los anillos aórticos y se puede evaluar el potencial angiogénico de los compuestos problema.

Hola, soy Karen Bein del laboratorio del Dr. E Lewis en el Departamento de Bioquímica Clínica de la Universidad Beon de los Negativos en Be Sheva Israel. Hoy te mostraremos un procedimiento para la prueba del anillo aórtico en ratón. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los efectos de diversos materiales en la formación de vasos sanguíneos.

Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, deje que el extracto de matriz basal o BME se descongele en hielo o a cuatro grados centígrados. Una vez descongelado, sigue manteniendo frío el BME para evitar que se solidifique de nuevo.

El día del experimento, se sacrificó a un ratón de seis a siete semanas de edad con una inyección estándar de ketamina y xilacina que sangró rápidamente a través de las arterias del cuello, seguido de una dislocación cervical. Comience el procedimiento limpiando el animal con etanol al 70% en una campana de flujo laminar estéril. A continuación, mientras trabaja con un endoscopio de disección, utilice pinzas estériles y tijeras de disección para realizar una incisión vertical de la piel y abrir la pared peritoneal.

La incisión debe hacerse para exponer la parte superior del esternón, donde también se corta la caja torácica y se retira el diafragma. Proceda a empujar con cuidado todos los órganos a un lado exponiendo completamente la aorta torácica ubicada a lo largo de la columna vertebral con la aorta expuesta, inserte pinzas delgadas estériles entre la aorta y la columna. Abra las pinzas y levante gradualmente la aorta de su lecho, separando el segmento torácico del resto de la aorta.

Ahora que la aorta está separada, use unas tijeras afiladas para cortarla del ratón, comenzando por el extremo, que está muy cerca de los vasos renales y terminando cerca del corazón. Coloque la aorta torácica extirpada en una placa de Petri llena de PBS frío y estéril. Ahora que se ha extirpado la aorta, los anillos aórticos se pueden preparar con dos pinzas estériles y trabajando bajo unos prismáticos.

Limpie la aorta torácica del tejido graso circundante. Asegúrese de no dañar la aorta y sosténgala solo en los bordes. La aorta debe sumergirse repetidamente en la placa de Petri que contiene PBS para evitar la deshidratación hasta que finalmente se limpie.

Ahora que la aorta torácica está limpia, use una cuchilla quirúrgica y trabaje debajo de los binoculares para cortar la aorta de manera uniforme en anillos de un milímetro. Usando una regla colocada debajo de la superficie de corte como guía, asegúrese de usar una cuchilla nueva y reemplácela de vez en cuando para mantener el afilado. Los extremos de la aorta no se usan Después de cortar cada anillo, use pinzas para transferirlo muy suavemente a un plato nuevo que contenga PBS frío.

Coloque todos los anillos en la misma placa contenedora de PBS para asegurarse de que el ensayo sea aleatorio. Dado que cada segmento de la aorta tiene un potencial angiogénico algo diferente, mantenga los anillos en hielo. A continuación, prepare la placa de ensayo utilizando puntas de pipeta preenfriadas.

Agregue a cada pocillo en una placa de 48 pocillos alrededor de una gota de 150 microlitros de BME frío, la gota se solidifica en una cúpula a mitad de movimiento. El BME permite el transporte de sustancias, la quimiotaxis de las células y, lo que es más importante, la diferenciación y migración celular que conduce a la formación de neovasos. Los pozos perimetrales se llenan con PBS. Para evitar la deshidratación de BME, permita que la gota de BME se solidifique a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Una vez que el BME se haya solidificado, extraiga cuidadosamente un anillo aórtico de la placa de Petri con pinzas para evitar daños, el anillo debe transferirse dentro de la gota de lípido que se forma entre las puntas de las pinzas. Como resultado de la tensión superficial del líquido, coloque un solo anillo aórtico en la parte superior central de cada cúpula e incube durante 10 minutos a 37 grados centígrados en la parte superior de cada anillo, añadir 150 microlitros adicionales de BME e incubar durante 20 a 30 minutos.

A 37 grados centígrados, el anillo ahora está encerrado en BME y ensayo. Se pueden agregar materiales a la placa para iniciar el ensayo. Pres suplemento previamente preparado para suero endotelial humano en medio libre con el material experimental o el suplemento de crecimiento de células endoteliales como control positivo para un control negativo.

Use el medio solo. Agregue 500 microlitros del medio de suplemento pres a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados durante seis a 12 días. Durante este período de incubación, examine la placa bajo el microscopio y busque vasos que broten de la aorta y vasos maduros avanzados identificados por vasos ramificados adicionales.

Debe extenderse desde el tejido del anillo, fotografiar tridimensionalmente los anillos entre el día seis y el día 12 bajo estereoscopio de contraste de fase estándar. Además, recoja los sobrenadantes en varios días entre el día seis y el día 12 y guárdelos a cuatro grados para usarlos dentro de un día o Eloqua y guárdelos a menos 20 o menos 80 para uso futuro. Los sobrenadantes se pueden analizar mediante diversas técnicas, como Eliza para vgf o el ensayo de grasa para los niveles de óxido nítrico.

Estas imágenes se recolectaron 12 días después de la colocación de los anillos en los pocillos y la incubación con cultivo, medio visto en la fila superior de imágenes o ECG utilizados como control positivo para la brotación de vasos. En el panel inferior. Cada imagen es una instantánea representativa de cuatro de los 12 anillos, que se utiliza normalmente en el ensayo por condición.

La esquina de cada anillo aórtico en cada pocillo separado es negra. Cuando se fotografían de esta manera, los anillos aórticos que se expusieron a los ECG exhiben crecimiento de los vasos y las flechas apuntan a varios de los muchos vasos que se han formado. Cada vaso se caracteriza por ser cadenas de células endoteliales con ramificaciones ocasionales que indican que están maduras.

No se pueden observar vasos germinados en el cultivo. Pocillos medianos en el panel superior, Acabamos de mostrarle cómo realizar el ensayo de cor aórtico al realizar este procedimiento. Es importante recordar que hay que trabajar con precisión y entender sus condiciones.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.