Un enfoque práctico de elaboración de mapas genéticos inducible destino: una guía visual para marcar y rastrear las células En Vivo

Los mapas de destino se generan marcando y rastreando células in vivo para determinar cómo los progenitores contribuyen a estructuras específicas y tipos celulares en tejidos en desarrollo y adultos. Un avance en este concepto es la cartografía genética inducible de destino, o GIFM, que vincula la expresión génica y los comportamientos celulares in vivo para crear mapas de destino basados en linajes genéticos. Hola, me llamo Deborah Ellisor del Laboratorio de Mark Services y del departamento de Biología Molecular, Biología Celular y Bioquímica de la Universidad de Brown.

Hoy mis colegas Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown y yo demostraremos un procedimiento para la cartografía genética inducible del destino celular. Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar el desarrollo temprano del cerebro. También podemos aplicar esta técnica a estudios de inactivación génica y modelos animales de enfermedades humanas.

Entonces, comencemos con embriones X cre, E-R-M-G-F-P. MGFP LAE es un alelo reportero presente en todas las células, representadas por óvalos grises X cre, er, donde X representa elementos reguladores del gen. El control de la expresión de C ER está restringido espacialmente al dominio de expresión del gen X, mostrado en azul, y la proteína CRE ER se encuentra atrapada en el citoplasma por HSP 90.

En ausencia de tamoxifeno, el gen reportero estará inactivo. La administración de tamoxifeno da como resultado células marcadas por destino en el dominio X porque CER se libera de HSP 90, transloca al núcleo y elimina el casete de parada del alelo reportero. La recombinación permanente y heredable asegura que las células expresen constitutivamente MG FP LA Z. La combinación del alelo reportero CER y el tamoxifeno permite el marcado cuando una población celular se marca inicialmente en una región encefálica primordial del embrión basándose en la expresión génica; estas células marcadas por destino se rastrean incluso después de que se extingue la expresión génica inicial utilizada para activar CER.

De esta manera, se puede identificar la distribución final y el destino terminal de una linaje celular genéticamente definido en el adulto. Este procedimiento comienza con la preparación de una solución de tamoxifeno de 20 miligramos por mililitro, disolviendo 200 miligramos de tamoxifeno en 10 mililitros de aceite de maíz precalentado en un vial de vidrio para inhalación.

Luego, incubar la solución a 37 grados Celsius durante dos horas en un vórtex Tator. Proteger intermitentemente la solución stock de tamoxifeno preparada de la luz envolviendo el vial con papel de aluminio y almacenarla a cuatro grados Celsius. El stock se puede utilizar durante un mes como máximo.

Para experimentos de mapeo de linaje, establezca una pareja de cría compuesta por una hembra de tipo silvestre Swiss Webster y un macho que lleve tanto un alelo específico del gen CreER como un alelo reportero. Para los fines de esta demostración, utilizaremos un macho win to one CreER MG FP. Revise cada mañana a la hembra Swiss Webster en busca de la aparición de un tapón vaginal.

Designe la mañana del día en que se observe el tapón vaginal como 0,5 días post coitum y calcule la fecha de administración de tamoxifeno. A partir de este punto inicial, en este experimento el tamoxifeno se administrará en el día embrionario 8,5. Utilizando una jeringa de un mililitro con una aguja para alimentación animal, aspire 200 microlitros de la solución stock de tamoxifeno.

Restrinja firmemente a la hembra Swiss Webster con embarazo cronometrado sujetando la piel del cuello y la espalda para inmovilizar la cabeza y gire al ratón de modo que el lado ventral quede mirando hacia arriba. Sujete la cola entre los dedos libres para mantener el cuerpo en línea recta. A continuación, coloque la aguja de alimentación en la comisura de la boca y guíe suavemente la aguja paralela al paladar hasta que la punta de la aguja de alimentación esté aproximadamente a la altura del ojo.

Incline suavemente la cabeza hacia atrás para acceder al esófago. Dirija la aguja más allá de la epiglotis y hacia abajo por el esófago en dirección al estómago. Tenga cuidado de no introducirse en la tráquea.

Una vez que la aguja de alimentación esté en el estómago, administre el tamoxifeno y retire la aguja. Luego, devuelva a la hembra a su jaula de origen hasta la fecha de disección. En la fecha de disección, los embriones E 12.5 de la hembra preñada sincronizada se separan mediante disección y luego se evalúan en busca de marcación GFP.

En un embrión positivo para GFP, observamos que las neuronas derivadas del viento uno contribuyen al mesencéfalo, al rombencéfalo y a la médula espinal. El reportero MG FP marca las proyecciones axonales, que también pueden observarse en embriones transferidos que son positivos para GFP mediante montaje en portaobjetos a una placa de Petri que contiene PPS y se fotografían utilizando un marco de imagen. Después de que los embriones hayan sido fotografiados, use pinzas para pinzar un pequeño trozo de cola de cada embrión y coloque cada trozo en un tubo de PCR. Los tejidos serán genotipificados mediante PCR para ambos alelos a fin de confirmar los resultados observados mediante análisis en montaje completo.

Los siguientes procedimientos nos permiten analizar cómo las células marcadas derivadas de regiones embrionarias colonizan el cerebro adulto antes de comenzar la craneotomía. Confirmado mediante un pellizco en el dedo del pie que el ratón está completamente anestesiado, se realizan incisiones para acceder al corazón a través de la caja torácica.

A continuación, coloque una aguja tipo mariposa en el ápice o en el ventrículo izquierdo del corazón y sujétela con la abrazadera en C. Cree un sitio de salida del líquido en la aurícula derecha con tijeras, luego perfunda con 10 a 15 mililitros de solución salina fría con hielo hasta que el líquido salga transparente. A continuación, con 20 a 25 mililitros de paraformaldehído al 4 %.

Cuando la perfusión intracardiaca esté completa, retire la cabeza con tijeras cortando la columna vertebral justo por encima de los hombros. Pase un escalpelo a lo largo de la línea media dorsal de la cabeza, desde la región rostral del cuello, para cortar el cuero cabelludo y exponer el cráneo. Con el escalpelo, raspe cualquier tejido o músculo excesivo a lo largo de los lados y la parte posterior del cráneo.

Con pinzas, punce el cráneo en la línea media, justo craneal a los bulbos olfatorios, y cree un pequeño orificio para alojar las puntas de unas tijeras finas. Introduzca las tijeras finas en este orificio y realice dos incisiones bilaterales desde la línea media, siguiendo la longitud de los bulbos olfatorios. Este corte fracturará el cráneo en la intersección del hueso nasal y el hueso frontal, proporcionando un buen acceso para las tijeras.

Corte a lo largo de las suturas sagitales del cráneo, asegurándose de mantener las puntas de la tijera orientadas lejos del cerebro para evitar dañar el tejido subyacente. A continuación, sujete suavemente el cráneo con pinzas y retire el hueso a lo largo de la incisión medial para exponer el cerebro. El cráneo puede desprenderse en fragmentos pequeños o separarse en secciones más grandes.

Continúe utilizando la pinza para retirar todos los huesos frontales parietales, interparietales y occipitales. Libere los paraoculares ubicados a lo largo de los bordes laterales del cerebro a nivel del cerebelo presionando suavemente los huesos esféricos de cada lado. Use tijeras para cortar cuidadosamente la parte dorsal del hueso que rodea el tronco encefálico.

Introduzca un lado de la tijera justo debajo del borde dorsal del hueso, comenzando desde donde se cortó la médula espinal y cortando hacia el cerebelo. Para liberar el bulbo raquídeo y el cerebelo. Retire el hueso restante alrededor del bulbo raquídeo con la pinza.

Retire suavemente los huesos, gire la cabeza con el lado dorsal hacia abajo y use la pinza para seccionar los nervios craneales y liberar el cerebro del cráneo. Coloque el cerebro en una placa de Petri con hielo. Evalúe el cerebro adulto en busca de marcación GFP en PPS frío, utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia y tome fotografías usando un marco de imagen.

En este ejemplo, el mesencéfalo está marcado por GFP, además de utilizarse para el análisis de linaje durante la embriogénesis; en el adulto, el GIFM puede combinarse con otras aplicaciones comúnmente usadas en biología del desarrollo, como la microdisección y los experimentos con explantes de tejido. Por ejemplo, el mesencéfalo ventral es la zona de progenitores para las neuronas dopaminérgicas en desarrollo, que expresan el gen wind one. Por lo tanto, el aislamiento del mesencéfalo ventral mediante microdisección permite establecer un entorno in vitro para investigar más a fondo su desarrollo.

Este representa solo un ejemplo del uso de GIFM para aislar una zona de progenitores de interés definida por la historia genética. Para comenzar este procedimiento, transfiera los embriones positivos para GFP previamente identificados a PBS estéril frío con hielo en una placa de cultivo celular utilizando tijeras finas. Retire la porción cefálica de un embrión cortando transversalmente coddled a rommy.

A continuación, retire la porción rostral de la cabeza mediante un corte coronal a través del cefalón. Esto expondrá una estructura en forma de tubo en la que el cuarto ventrículo, a través de la vesícula mesencefálica, forma un conducto entre los tejidos dorsal y ventral. Inserte cuidadosamente las puntas de la tijera en el cuarto ventrículo y corte a lo largo de la línea media dorsal hasta la región rostral, abriendo completamente el tubo, creando así una preparación tipo "libro abierto".

El mesencéfalo ventral quedará ahora expuesto medialmente. Mientras que las dos mitades dorsales del mesencéfalo quedarán ubicadas lateralmente, puede ser necesario eliminar cualquier tejido no neural restante debajo del mesencéfalo ventral. Para que el explante quede plano, este ahora debe asemejarse a una mariposa en la que el mesencéfalo dorsal representa las alas y el tálamo meridional la cola.

Para aislar aún más el mesencéfalo ventral para análisis por fax o experimentos de cultivo celular, retire las regiones laterales del tejido. Ahora mostraremos algunos resultados representativos de GIFM. En este experimento, las células que expresan WINT1 marcadas en E 8.5 se visualizan para determinar cómo las células dirigidas por WINT1 contribuyen a las estructuras neuronales durante el desarrollo.

Por ejemplo, en embriones C EER MG FP a las 12,5 E, se observa fluorescencia GFP principalmente en el mesencéfalo, el hindbrain posterior y la médula espinal; a gran aumento, se visualizan finas proyecciones neuronales que inervan. Las células marcadas en la pared del cuerpo del mesencéfalo, las extremidades y la región craneofacial también pueden visualizarse y analizarse a nivel celular mediante inmunohistoquímica. Como se muestra en esta sección óptica de un micrómetro de grosor de un embrión de 12,5 E marcado mediante la administración de tamoxifeno a las 8,5 E, la marcación con anticuerpo contra beta galactosidasa nuclear en rojo y la marcación con anticuerpo GFP en verde indican células mapeadas en el mesencéfalo ventral.

Aquí combinamos células doblemente positivas debido a la naturaleza del reportero condicional MGFP en el cerebro adulto. La densidad del tejido maduro puede ocultar la fluorescencia GFP que emana de estructuras cerebrales internas. Por lo tanto, la microscopía de fluorescencia en preparación completa revela solo una débil fluorescencia GFP en el CUI superior del adulto al evaluar el resultado.

Una línea marcada en E 8.5 en secciones adultas con microscopía de baja magnificación revela que la línea WIN da origen a estructuras del mesencéfalo, incluyendo el colículo superior e inferior. En esta imagen de mayor magnificación tomada del mesencéfalo ventral en la vecindad de neuronas dopaminérgicas, pueden observarse células positivas para beta cal nuclear y un rico plexo axonal positivo para GFP, en contraste. El marcado en E 9.5 da como resultado una etiquetación sustancial con GFP que se observa fácilmente en el colículo inferior del mesencéfalo mediante fluorescencia en preparación completa. La línea WINT marcada en E 9.5 en secciones adultas se concentra en el colículo inferior, tal como se observa con microscopía de baja magnificación.

En esta imagen de mayor aumento tomada del mesencéfalo ventral de neuronas dopaminérgicas, pueden observarse células positivas para beta gal nuclear y un rico plexo axonal positivo para GFP. Así, mientras que las neuronas derivadas de WIN uno marcadas desde E 8.5 hasta E 9.5 se van restringiendo progresivamente en su contribución al mesencéfalo dorsal, la línea celular de WIN uno persiste contribuyendo al mesencéfalo ventral.

Acabamos de mostrarle el procedimiento para el mapeo genético inducible de destino celular con el fin de marcar y rastrear linajes celulares in vivo. Esto nos permite marcar células según su linaje genético y rastrearlas a lo largo del tiempo, incluso después de que la expresión génica ha sido extinguida. Con la administración de tamoxifeno a las ocho semanas y media, hemos demostrado que el dominio wit uno contribuye al desarrollo del mesencéfalo, además de conformar todo el mesencéfalo en el adulto.

En contraste, la administración de tamoxifeno a las nueve semanas y media, cuando el dominio wit1 se vuelve restringido, da como resultado una contribución más restringida al mesencéfalo en desarrollo durante la embriogénesis, lo cual persiste en el adulto. Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta que el sistema marca las células de forma mosáica, por lo que no todas las células de una estructura determinada pueden estar etiquetadas. Esto probablemente se deba a la línea CRE er o al alelo reportero condicional que se está utilizando.

Es importante destacar que, aunque la marcación celular es mosáica, el patrón y la distribución de las células marcadas es altamente reproducible. Hemos encontrado que la administración de tamoxifeno mediante gavaje oral es ventajosa en comparación con la administración mediante inyección intraperitoneal, ya que minimiza la inflamación en el espacio intraperitoneal, así como el daño mecánico a los embriones. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.