DOI: 10.3791/1687-v
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Genéticos inducible destino de asignación (GIFM) las marcas y las células de las pistas con un control preciso espacial y temporal
Los mapas de destino se generan marcando y rastreando células in vivo para determinar cómo los progenitores contribuyen a estructuras y tipos de células específicas en tejido adulto y en desarrollo. Y el avance en este concepto es el mapeo de destino genético inducible, o GIFM, que vincula la expresión génica, el sulfato y los comportamientos celulares in vivo para crear mapas de destino basados en el linaje genético. Hola, mi nombre es Deborah Ellisor del Laboratorio Mark Services y del departamento de Biología Molecular, biología celular y bioquímica de la Universidad de Brown.
Hoy mis colegas Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown y yo demostraremos un procedimiento para el mapeo genético del destino inducible. Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar el desarrollo temprano del cerebro. También podemos aplicar esta técnica a estudios de inactivación génica y modelos animales de enfermedades humanas.
Así que comencemos con embriones X CRE, E-R-M-G-F-P. MGFP LAE es un alelo reportero presente en todas las células representadas por óvalos grises X cre, er, donde X representa elementos reguladores de genes. El control de la expresión de C ER está espacialmente restringido al dominio de expresión del gen X que se muestra en azul y la proteína CRE ER es secuestrada en el citoplasma por HSP 90.
En ausencia de tamoxifeno, el reportero estará apagado. La administración de tamoxifeno da como resultado células mapeadas de destino en el dominio X porque CER se libera de HSP 90 se transloca al núcleo y elimina el casete de parada del alelo reportero. La combinación del alelo reportero CER y el tamoxifeno da como resultado el marcaje cuando una población celular se marca inicialmente en una región primordial del cerebro del embrión en función de la expresión génica, estas células mapeadas del destino se rastrean incluso después de que se extingue la expresión génica inicial utilizada para impulsar CER.
De esta manera. La distribución final y el destino terminal de un linaje celular genéticamente definido se pueden identificar en el adulto. Este procedimiento comienza con la preparación de una solución de tallo de 20 miligramos por mililitro de tamoxifeno, disuelva 200 miligramos de tamoxifeno en 10 mililitros de aceite de maíz de antes de la guerra en un frasco de vidrio para inhalación.
A continuación, incubar la solución a 37 grados centígrados durante dos horas en un vórtice de Tator. La solución protege de forma intermitente la solución madre de tamoxifeno preparada de la luz envolviendo el vial con papel de aluminio y almacenándola a cuatro grados centígrados. El stock se puede utilizar hasta por un mes.
Para los experimentos de mapeo del destino, establezca una pareja reproductora compuesta por una hembra Swiss Webster de tipo salvaje y un macho portador de un alelo CreER específico del gen y un alelo reportero. A los efectos de esta demostración, utilizaremos una victoria para un macho CreER MG FP. Revise la hembra de Swiss Webster todas las mañanas para ver si hay un tapón vaginal.
Designe la mañana del día del tapón vaginal como 0,5 días después del cotus y calcule la fecha de administración de tamoxifeno. A partir de este punto de partida en este experimento, se administrará tamoxifeno en el día embrionario 8,5. Con una jeringa de un mililitro con una aguja de alimentación animal, extraiga 200 microlitros de la solución de tallo de tamoxifeno.
Sujete firmemente a la hembra de Webster suizo embarazada agarrando la nuca y la espalda para inmovilizar la cabeza y gire el ratón para que el lado ventral quede hacia arriba. Sostén la cola entre los dedos libres para mantener el cuerpo en línea recta. A continuación, coloque la aguja de alimentación en la comisura de la boca y guíe suavemente la aguja paralela al paladar hasta que la punta de la aguja de alimentación esté aproximadamente en la posición del ojo.
Inclina suavemente la cabeza hacia atrás para acceder al esófago. Guíe la aguja más allá de la epiglotis y por el esófago hacia el estómago. Tenga cuidado de no entrar en la tráquea.
Una vez que la aguja de alimentación esté en el estómago, administre el tamoxifeno y retire la aguja. Luego regrese a la hembra a su jaula de origen hasta la fecha de la disección. En la fecha de la disección, los embriones E 12.5 de la hembra embarazada programada se diseccionan sin demora y luego se evalúan para el marcado GFP.
En un embrión GFP positivo, observamos que las neuronas derivadas del viento uno contribuyen al mesencéfalo, miman el cerebro posterior y la médula espinal. El reportero MG FP etiqueta las proyecciones axonales, que también se pueden ver transfiriendo embriones que son GFP positivos mediante montaje en casa a una placa de Petri que contiene PPS y fotografiarlos con un marco de fotos Después de que los embriones hayan sido fotografiados, use fórceps para pellizcar un pequeño trozo de cola de cada embrión y coloque cada pieza en un tubo de PCR. Los tejidos se genotipificarán mediante PCR para ambos alelos para confirmar los resultados observados a través del análisis de montaje completo.
Los siguientes procedimientos nos permiten analizar cómo las células marcadas derivadas de regiones embrionarias pueblan el cerebro adulto antes de iniciar la craneotomía. Confirmado por un pellizco en el dedo del pie que el mouse está completamente innu. El nembutal realiza incisiones para acceder al corazón a través de la caja torácica.
A continuación, coloque una aguja de mariposa en el ápice o ventrículo izquierdo del corazón y asegúrela con la pinza C. Cree un sitio de salida de líquido en la aurícula derecha con tijeras, luego perfunde con 10 a 15 mililitros de solución salina helada hasta que el líquido salga claro. Seguido de 20 a 25 mililitros de aldehído paraformado al 4%.
Cuando la profusión intracardíaca sea completa, retire la cabeza con unas tijeras cortando la columna vertebral justo por encima de los hombros. Pasa un bisturí a lo largo de la línea media dorsal de la cabeza, rostral de cottle para cortar el cuero cabelludo y exponer el cráneo S. Con el bisturí, raspe cualquier exceso de tejido o músculo a lo largo del costado y la parte posterior del cráneo.
Con pinzas, perfore el cráneo en la línea media, justo rostral a los bulbos olfativos y cree un pequeño orificio para acomodar las puntas de las tijeras finas. Inserte las tijeras finas en este orificio y haga dos incisiones bilaterales desde la línea media siguiendo la longitud de los bulbos olfativos. Este corte romperá el cráneo en la intersección del hueso nasal y el hueso frontal y proporcionará un buen acceso para las tijeras.
Corta a lo largo de las suturas sagitales en el cráneo, asegurándote de mantener las puntas de las tijeras en ángulo lejos del cerebro para evitar dañar el tejido subyacente. A continuación, agarre suavemente el cráneo con pinzas y retire el hueso a lo largo de la incisión medial para exponer el cerebro. El cráneo puede desprenderse en pedazos pequeños o desprenderse en secciones más grandes.
Continúe usando las pinzas para extirpar todos los huesos parietal frontal, interparietal y occipital. Libere los paraóculos ubicados a lo largo de los bordes laterales del cerebro a nivel del cerebelo pellizcando suavemente los huesos esféricos a cada lado. Use unas tijeras para cortar cuidadosamente la parte dorsal del hueso que rodea el tronco encefálico.
Inserta un lado de las tijeras justo debajo del borde dorsal del hueso, comenzando desde donde se cortó la médula espinal y cortando hacia el cerebelo. Para liberar el tronco encefálico y el cerebelo. Retire el hueso restante alrededor del tronco encefálico con las pinzas.
Retire suavemente los huesos, gire la cabeza con el lado dorsal hacia abajo y use las pinzas para cortar los nervios craneales y liberar el cerebro del cráneo. Coloca el cerebro en una placa de Petri con hielo. Evalúe el cerebro adulto para detectar el marcado de GFP, utilizando un telescopio de disección fluorescente y fotografíe con un marco de imagen.
En este ejemplo, el mesencéfalo está marcado por GFP, además de su uso para el análisis de linaje durante la embriogénesis y en el adulto, el GIFM se puede combinar con otras aplicaciones comúnmente utilizadas en biología del desarrollo, como experimentos de microdisección y explante de tejido. Por ejemplo, el mesencéfalo ventral es la zona progenitora para el desarrollo de las neuronas dopaminérgicas que expresan el gen viento. Por lo tanto, el aislamiento del mesencéfalo ventral mediante microdisección permite establecer un entorno in vitro para investigar más a fondo su desarrollo.
Esto representa solo un ejemplo del uso de GIFM para aislar una zona de interés de progenitores definida por la historia genética. Para comenzar este procedimiento, transfiera los embriones positivos a GFP previamente identificados a PBS estéril helado en una placa de cultivo celular con tijeras finas. Retire la parte de la cabeza de un embrión cortándola transversalmente hasta que esté rommy.
A continuación, se extirpa la porción rostral de la cabeza con un corte coronal a través del céfalo. Esto expondrá una estructura en forma de tubo en la que el cuarto ventrículo a través de la vesícula mesocefálica forma un conducto entre los tejidos dorsal y ventral. Inserte con cuidado las puntas de las tijeras en el cuarto ventrículo y corte a lo largo de la línea media dorsal mimada hasta la rostra, abriendo completamente el tubo, creando una preparación de libro abierto.
El mesencéfalo ventral ahora estará expuesto medialmente. Si bien las dos mitades dorsales del mesencéfalo residirán lateralmente, puede ser necesario eliminar cualquier tejido no neural restante debajo del mesencéfalo ventral. Para que el explan quede plano, el explan debe parecerse ahora a una mariposa en la que el mesencéfalo dorsal representa las alas y thrombo apenas una la cola.
Para aislar aún más el mesencéfalo ventral para análisis por fax o experimentos de cultivo celular, extirpe los aspectos laterales del tejido. Ahora mostraremos algunos resultados representativos de GIFM. En este experimento, se visualizan las células que expresan WINT one marcadas con E 8.5 para determinar cómo contribuyen las células directas wint one a las estructuras neuronales a lo largo del desarrollo.
Por ejemplo, en un solo embrión de C EER, MG FP en E 12.5, exhiben fluorescencia GFP principalmente en el mesencéfalo, el cerebro posterior posterior y la médula espinal a gran aumento, se observan proyecciones neuronales finas inervantes. Las células marcadas con la pared del cuerpo del mesencéfalo, la extremidad y la región facial craneal también se pueden visualizar y analizar a nivel celular mediante inmunohistoquímica. Como se muestra en esta sección óptica de un micrómetro de espesor de un embrión E 12.5 marcado por la administración de tamoxifeno en E 8.5, el marcaje de anticuerpos beta galacto nucleares en rojo y el marcaje de anticuerpos GFP en verde indica células mapeadas por el destino que se muestran en el mesencéfalo ventral.
Aquí, las células combinadas son doblemente positivas debido a la naturaleza del reportero condicional MGFP en el cerebro adulto. La densidad del tejido maduro puede oscurecer la fluorescencia de GFP que emana de las estructuras internas del cerebro. Por lo tanto, la microscopía de fluorescencia de montaje completo revela solo una fluorescencia GFP débil en el CUI superior del adulto que evalúa la victoria.
Un linaje marcado en E 8.5 en secciones de adultos con microscopía de bajo aumento revela que el linaje WIN one da lugar a estructuras del mesencéfalo, incluidos los cui superior e inferior. En esta imagen de mayor aumento tomada desde el mesencéfalo ventral en las proximidades de las neuronas dopaminérgicas, se pueden ver células nucleares beta cal positivas y un plexo axonal rico en GFP positivo en la marca de contraste en E 9.5 que da como resultado un marcaje sustancial de GFP que se observa fácilmente en el colo inferior del mesencéfalo por fluorescencia de montaje completo. El linaje WINT one marcado en E 9.5 en las secciones adultas se concentra en el kaulu inferior, como se ve con microscopía de bajo aumento.
En esta imagen de mayor aumento tomada desde el mesencéfalo ventral en las neuronas dopaminérgicas, se pueden ver células nucleares beta positivas y un plexo axonal rico en GFP positivo. Por lo tanto, mientras que las neuronas derivadas de E 8.5 frente a E 9.5 se restringen progresivamente para contribuir al mesencéfalo dorsal. El linaje WIN one persiste en contribuir al mesencéfalo ventral.
Acabamos de mostrarte el procedimiento para el mapeo de destinos genéticos inducibles, para marcar y rastrear linajes celulares in vivo. Esto nos permite marcar las células en función de su linaje genético y rastrearlas a lo largo del tiempo, incluso después de que se haya extinguido la expresión génica. Con el tamoxifeno administrado a los ocho años y medio, hemos demostrado que el dominio ingenio contribuye al desarrollo del mesencéfalo, además de todo el mesencéfalo en el adulto.
Por el contrario, la administración de tamoxifeno a un nivel de nueve y medio cuando el dominio se restringe, da como resultado una contribución más restringida al mesencéfalo en desarrollo durante la embriogénesis, que persiste en el adulto. Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta que el sistema marca las células, en mosaico, y, por lo tanto, no todas las células de una estructura en particular pueden estar etiquetadas. Es probable que esto se deba a la línea CRE er o al alelo reportero condicional que se está utilizando.
Es importante destacar que, aunque el marcado de las células es un mosaico, el patrón y la distribución de las células de marcado son altamente reproducibles. Hemos encontrado que la administración de tamoxifeno por sonda oral es ventajosa en comparación con la administración por inyección interperitoneal porque minimiza la inflamación en el espacio interperitoneal, así como el daño mecánico a los embriones. Así que eso es todo.
Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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