Drosophila Cuantificación de la unión neuromuscular (NMJ): un método para evaluar la morfología y la función sináptica

- En primer lugar, inmunotinción de larvas de Drosophila con marcadores que resaltan diferentes aspectos de las NMJs o uniones neuromusculares. Esta es la región donde la terminación del axón de una neurona motora entra en contacto con un músculo, y su morfología se utiliza como lectura de la función sináptica.

El axón termina en varias ramas que forman protuberancias llamadas botones. Los neurotransmisores se liberan de los botones y causan la contracción muscular. Las áreas de liberación de neurotransmisores se denominan zonas activas. En este caso, un marcador es específico para una proteína sináptica que delinea la NMJ, y el otro marcador es para una proteína presente en zonas activas.

A continuación, adquiera imágenes de NMJ mediante microscopía y evalúe cuantitativamente su morfología con un software de análisis de imágenes semiautomatizado. Aplique una serie preestablecida de comandos de software a las imágenes. Los archivos de salida contienen imágenes NMJ analizadas y resultados de morfología. Las características que se pueden medir incluyen el número y el área de superficie de los botones, la longitud y el número de ramificaciones de NMJ, el número de compartimentos NMJ no conectados y el número de zonas activas.

En el siguiente ejemplo, analizaremos la morfología de las NMJs de Drosophila teñidas con DLG1, un marcador postsináptico, y BRP, un marcador de zona activa.

- Para este protocolo, genere pilas de imágenes de NMJ y guárdelas como archivos TIFF individuales donde el canal 1 muestra la tinción DLG1 o un marcador similar y el canal 2 muestra la tinción BRP. Para empezar, cree proyecciones Z e hiperpilas de los archivos de imagen NMJ. Abre las opciones del plugin y selecciona Drosophila NMJ morphometrics.

Ahora, identifique la cadena de archivo única que el microscopio ha asignado a la serie de imágenes al almacenarlas como TIFF. Estará al final del nombre de la imagen. Copie y pegue la cadena dada en el plano y el número de canal más bajos en la ventana de configuración de cadena de archivo única. A continuación, seleccione la submacro 'Convertir en pila' y elija el directorio o la carpeta donde se encuentran las imágenes.

Para cada archivo de imagen, se crean dos archivos nuevos con los nombres predeterminados stack y flat stack, seguidos del nombre de la imagen original. A continuación, los archivos originales se pueden eliminar para ahorrar espacio de almacenamiento. A continuación, en la interfaz de morfometría NMJ de Drosophila, seleccione la submacro ROI definida y elija el directorio de archivos de imagen.

Cuando se abra la primera proyección, seleccione la herramienta de selecciones a mano alzada y, a continuación, utilice el ratón para definir una región que contenga un terminal NMJ completo de interés. Una vez seleccionado, haga clic en Aceptar en la ventana de terminal definida. Continúe haciendo esto hasta que los terminales NMJ estén definidos en todas las proyecciones. La macro avanza el proceso automáticamente. Para cada archivo de imagen, se crea un nuevo archivo con los nombres predeterminados ROI seguidos del nombre de la imagen original.

Para cuantificar las características de NMJ, primero vaya a la interfaz morfométrica de Drosophila NMJ y establezca la escala. Por ejemplo, si un píxel de la imagen corresponde a 0,72 micras, establezca la escala de píxeles en 1 y la escala de distancia en 0,072. A continuación, seleccione la sub-macro Analizar, y si hay dos imágenes de canal, también active Esperar. Presione OK y cuando se le solicite, seleccione el directorio de archivos de imagen. El tiempo de procesamiento puede ser de varios minutos por sinapsis.

Después del análisis, los nuevos archivos de imagen para cada sinapsis analizada se almacenan en la carpeta principal y las mediciones cuantitativas se encuentran en el archivo results.txt. Inspeccione todas las imágenes y excluya las imágenes con errores de segmentación.

Por ejemplo, es posible que partes del terminal sináptico no se incluyan en el contorno amarillo. Es posible que se incluyan partes del fondo en el terminal sináptico. Una línea de esqueleto azul puede extenderse más allá del terminal sináptico. Es posible que haya demasiadas zonas activas o que algunas zonas activas permanezcan sin detectar.