¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el Drosophila Larval unión neuromuscular

El objetivo general de esta metodología es mostrar cómo realizar análisis cuantitativos de los rasgos anatómicos. Se demuestra la cuantificación de fenotipos que afectan a la morfología, tamaño y posición de los núcleos con los músculos estriados de larvas de Drosophila. Comprender el mecanismo molecular que controla la morfología, el tamaño y la distribución de los orgánulos intracelulares es una de las cuestiones más importantes de la biología moderna.

En el pasado, las variaciones morfológicas entre y dentro de los grupos experimentales solo se sometían a análisis cualitativos. Aquí proponemos, en un análisis cuantitativo que combina la genética de Drosophila con el análisis cuantitativo morfométrico para identificar los genes que controlan el tamaño, la forma y la distribución de los núcleos dentro de los músculos. Leire Ledahawski, una estudiante graduada de mi laboratorio, ayudará con la demostración del procedimiento.

Después de diseccionar y teñir las uniones neuromusculares de las larvas según el protocolo de texto, use pinzas para extraer las muestras del tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y colóquelas en un portaobjetos de procesamiento. Con unas tijeras de microdisección, corte la cabeza y la cola de los filetes y mantenga sus superficies internas hacia arriba. Ahora, prepare una corredera de montaje envolviendo tres tiras de cinta de celulosa alrededor de una corredera limpia, a un centímetro de distancia.

Coloque el cubreobjetos sobre este espacio provisto para que no aplaste las muestras. A continuación, deposite unos 20 microlitros del medio de montaje entre las tiras de cinta de celulosa y extienda el medio con pinzas limpias. Ahora retira el tejido extra de las preparaciones.

Arrastre las larvas diseccionadas desde el portaobjetos de procesamiento hasta el portaobjetos de montaje y hacia el medio de montaje, manteniendo la superficie interna hacia arriba. A continuación, aplique suavemente un cubreobjetos teniendo cuidado de evitar que el aire quede atrapado. A continuación, selle el portaobjetos con esmalte de uñas transparente y deje que el portaobjetos se seque durante al menos 10 minutos antes de tomar imágenes.

Para este análisis, utilice imágenes confocales que muestren los músculos de la pared corporal de las larvas teñidos con anticuerpos DeVAP, anticuerpos laminar y un marcador nuclear. A continuación, arrastra y suelta las imágenes confocales de la pila Z en la arena. Haga doble clic en las imágenes para abrirlas automáticamente en la vista de Surpass, a la que se accede mediante un icono de la barra de herramientas.

La vista Surpass tiene tres paneles principales de espacio de trabajo. Área de vista, lista de objetos y área de propiedades de objetos. A continuación, haga clic en el icono de vista 3D para crear una imagen de tres canales renderizada por volumen.

A continuación, seleccione Añadir nuevos puntos de medición en la barra de herramientas Objetos y siga el Asistente de creación en el área Propiedades del objeto. Seleccione primero la pestaña Editar y, a continuación, en Canal específico, seleccione el marcador nuclear o el canal laminado para resaltar los núcleos. A continuación, establezca el puntero en el modo Seleccionar presionando la pestaña Escape y, a continuación, ajuste el tamaño del cuadro del cursor 3D con la rueda del mouse para que contenga un núcleo determinado en la imagen.

Agregue un punto de medición manteniendo presionada la tecla Mayús y haciendo clic con el botón izquierdo en el mismo núcleo. Luego, agregue el segundo punto en un núcleo cercano del mismo músculo usando la misma técnica. Se dibujará automáticamente una línea entre los dos puntos y la distancia entre los dos núcleos se mostrará y registrará como una variable estadística.

Repita el procedimiento para todos los núcleos que rodean un núcleo dado. A continuación, de todos los puntos de medición recopilados, que se encuentran en Datos de distancia detallados de estadísticas, seleccione la distancia más corta. En el área Propiedades del objeto, seleccione la opción Exportar estadísticas con visualización de pestañas a archivo disponible.

Esto guarda los datos en una hoja de cálculo. Para este análisis, utilice imágenes confocales de los músculos de la pared corporal teñidos con lamina y un marcador nuclear para visualizar los núcleos. Para evaluar la forma de los mionúcleos, mida su esfericidad, que compara el área de la superficie nuclear con la de una esfera con el mismo volumen.

Alternativamente, mida la elipticidad que distingue prolatos, oblatos o elipsoides y esferoides. Abra la imagen como se ha descrito anteriormente. A continuación, haga clic en el icono de la barra de herramientas Objetos Añadir nuevas superficies.

En el Asistente de creación que aparece en el área Propiedades del objeto, seleccione la tinción del marcador nuclear como canal de origen para mostrar los núcleos. Establezca la opción Intensidad absoluta como umbral. Asegúrese de que la mayoría de los núcleos muestren una representación suave y no sobrecargada cambiando el valor en la curva de umbral.

Al mismo tiempo, evite la presencia de agujeros o máscaras incompletas de cualquier núcleo. A continuación, utilice la herramienta Filtro para eliminar el ruido del renderizado de la superficie. En la pestaña Editar de la capa de superficie recién creada, divida las superficies de los núcleos que se renderizan incorrectamente.

Otra opción es fusionar las superficies de los núcleos que se renderizan incorrectamente. Los valores de elipticidad y esfericidad de los núcleos renderizados en superficie están disponibles en la pestaña Estadísticas. Exporte estos datos para su análisis.

Para este protocolo, se utilizan imágenes confocales que informan sobre los músculos de la pared corporal teñidos con un marcador nuclear y con anticuerpos específicos para lamina y DeVAP. Abra la imagen que le interese desde la opción Editar del menú principal y, a continuación, Recortar 3D. Siga el Asistente para la creación de superficies utilizando el canal de laminación como se describe en la sección anterior.

Una vez creada la superficie, haga clic en Editar en el área de Propiedades de los objetos y seleccione Enmascarar todo para aislar una señal dentro del núcleo. A continuación, seleccione la señal DeVAP. En el menú desplegable Seleccionar canal, haga clic en la opción Establecer vóxeles fuera de la superficie y haga que ese valor sea cero.

Esto crea un nuevo canal enmascarado disponible en la ventana Ajuste de pantalla. Para visualizar la presencia de señal dentro del núcleo, cree un plano de contorno haciendo clic en el icono Agregar nuevo plano de recorte de la barra de herramientas Objetos. A continuación, ajuste de forma interactiva el ángulo del plano de recorte y su posición para visualizar la distribución de la señal dentro del núcleo.

Las mutaciones de cambio de sentido en la proteína B asociada al VAMP humano están implicadas en la patogénesis de la ELA. Utilizando el método descrito, se compararon los músculos estriados que expresan el gen ortólogo de la mosca DeVAP que alberga la mutación V2601 causante de la ELA con los controles, que expresan niveles comparables de DeVAP de tipo salvaje o niveles más altos de DeVAP de tipo salvaje. Se utilizó el análisis del vecino más cercano para evaluar la distribución de los núcleos a lo largo de las fibras musculares.

En comparación con los músculos de control que expresan el transgén DeVAP mutado, o los que sobreexpresan la proteína de tipo salvaje, la mutación de interés causó una reducción drástica en la distancia promedio más corta entre los núcleos. A continuación, se examinó la esfericidad de los núcleos. Se encontró que los transgenes que redujeron el espaciamiento de los núcleos también aumentaron el volumen de los núcleos.

Las reconstrucciones en 3D y las representaciones de volumen de los núcleos revelaron que los músculos que expresan la mutación de interés forman grupos que se localizan en los núcleos. Este método también puede extenderse al análisis cuantitativo de las características morfológicas asociadas a otros orgánulos, como las mitocondrias. Los cambios en la arquitectura, la posición y el tamaño del núcleo se han asociado con el envejecimiento y una serie de trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Parkinson y la ELA.

La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la dispraxisis puede conducir a la identificación de nuevas dianas farmacológicas para intervenciones terapéuticas eficaces.