Aislamiento de células madre de melanoma: un método para obtener células de melanoma positivas y negativas CD133 mediante la clasificación de células activadas magnéticamente

- El melanoma alberga una pequeña subpoblación de células madre cancerosas que poseen capacidades de autorrenovación e iniciación de tumores. CD133 o Prominin-1, una glicoproteína transmembrana pentaspan, es uno de los marcadores clave expresados por las células madre de cáncer de melanoma metastásico. Para aislar las células CD133 positivas, comience con una suspensión de las células primarias de melanoma en un tampón adecuado.

Incubar con un reactivo de bloqueo que contiene proteínas que bloquean los sitios de unión no específicos en la superficie celular. Tratar las células con anticuerpos primarios CD133 biotinilados. Estos anticuerpos se unen a los antígenos CD133 expresados en las células CD133 positivas. Ahora, agregue microperlas magnéticas anti-biotina a la suspensión. Incuba para que las microperlas se unan a las células marcadas con biotina.

Finalmente, pase la suspensión incubada a través de una columna colocada en un campo magnético. Con la influencia magnética, todas las células positivas para CD133 marcadas con las microperlas se adhieren a la columna, mientras que las células no marcadas pasan a través de ella. Recoja estas células CD133 negativas sin marcar. Retire la columna del campo magnético. Enjuague el contenido con un tampón adecuado para eluir y recoger las células CD133 positivas.

En el siguiente protocolo, mostraremos el aislamiento de células madre cancerosas CD133 positivas y negativas a partir de un cultivo de melanoma primario obtenido de tejido tumoral. Lave el 80% de las células confluentes con PBS precalentado. Agregue la cantidad adecuada de Accutase e incube hasta que las células se desprendan de la superficie de cultivo. Recoja las células en medio Quantum 263 y transfiéralas a un tubo de 50 mililitros.

Enumere las celdas. Luego, centrifugue el número requerido de celdas durante 5 minutos a 300 x g y de 4 a 8 grados centígrados. Aspirar el sobrenadante por completo, y resuspender hasta 1 veces 10 a la octava celda en tampón MACS de 350 microlitros. Añadir 100 microlitros de reactivo bloqueante FcR y 50 microlitros de CD133/1-Biotina. Mezclar bien e incubar a 4 grados centígrados durante 10 minutos.

Lavar las células con 10 mililitros de tampón MACS, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 300 x g y de 4 a 8 grados centígrados. Aspire el sobrenadante por completo. Después de un segundo lavado, vuelva a suspender el pellet celular en 400 microlitros de tampón MACS. Agregue 100 microlitros de microesferas anti-biotina y mezcle bien. Incubar a 4 a 8 grados centígrados durante 15 minutos.

Mientras tanto, para preparar el separador MACS para la separación magnética, conecte el QuadroMACS al separador MACS Multi Stand. Inserte el número requerido de columnas LS con las alas de la columna al frente en el campo magnético del QuadroMACS. Coloque un filtro de preseparación en cada columna LS y un tubo de recolección apropiado debajo de cada columna.

Enjuague el filtro y la columna con tampón MACS de 3 mililitros y deseche el flujo. Después de lavar las celdas en el tampón MACS como se describió anteriormente, vuelva a suspender las celdas en un tampón MACS de 500 microlitros y aplique la suspensión de celdas en la columna LS preparada. Lavar tres veces con 3 mililitros de tampón MACS por columna. Recoja el efluente total de la fracción de células negativas CD133 no marcadas.

A continuación, deseche el filtro de preseparación, retire la columna del separador y colóquela en un tubo de recolección adecuado. Aplicar 5 mililitros de tampón MACS. Enjuague inmediatamente las células positivas para CD133 marcadas empujando firmemente el émbolo en la columna. Para aumentar la pureza de la fracción negativa, aplique la suspensión de la celda en una nueva columna LS equilibrada y recoja la fracción negativa CD133 del efluente.

• Melanoma - A type of skin cancer with self-renewing tumor initiation capabilities.
• CD133 - A marker in metastatic melanoma stem cells that enables their isolation.
• MACS Separator - A device used for magnetic cell sorting isolation.
• Quantum 263 medium - A culture medium used for melanoma cell cultivation.
• Anti-Biotin Microbeads - Tiny magnetic particles used to label cells for isolation.

• Understanding Melanoma - It's a skin cancer with self-renewable tumor cells (e.g., MACS separator).
• Principles of Magnetic Cell Sorting - The process of sorting cells based on their magnetic properties (e.g., CD133).
• Role of Microbeads - They assist in segregating cells during magnetic isolation (e.g., Anti-Biotin Microbeads).
• Isolation of CD133 - The melanoma stem cells are differentiated using MACS separator.

• [Question 1] What is melanoma and how is it connected to CD133 stem cells?
• [Question 2] What role does a MACS separator play in cell isolation?
• [Question 3] How are Anti-Biotin Microbeads used in the magnetic cell isolation process?

• Cell Isolation Techniques - Understanding melanoma therapy (e.g., MACS Separator).
• Medical Industry Impact - Improved cancer treatment methodologies (e.g., CD133).
• Scientific Progression - Better understanding of stem cells can lead to medical advancements.
• Research Developments - Isolation techniques pave way for newer studies.