Ensayo de formación de colonias de queratinocitos: un ensayo in vitro para evaluar la capacidad de los queratinocitos para convertirse en colonias

- El ensayo de formación de colonias determina la capacidad de las células individuales para proliferar y formar colonias. Comience con una piel de dorsal de ratón extirpada en una placa de cultivo. Raspe el tejido subcutáneo y la grasa del lado ventral de la piel. Trate el tejido con una solución de digestión. Las enzimas proteolíticas de la solución degradan la matriz extracelular, induciendo la disociación de las células epidérmicas.

Raspe suavemente la capa epidérmica para liberar las células y los pelos disociados en un medio de recolección. Filtre la suspensión a través de un colador adecuado para atrapar pelos o cualquier residuo y obtener una suspensión unicelular de células epidérmicas. Transfiera el volumen deseado de esta suspensión celular a una placa recubierta de colágeno que contiene una capa adherente de células alimentadoras detenidas por el crecimiento. Suplementar con un medio adecuado que favorezca la supervivencia de los queratinocitos.

Durante el cultivo, los queratinocitos se adhieren a la capa alimentadora. Además, estas células alimentadoras secretan factores de crecimiento y sintetizan proteínas de la matriz extracelular que apoyan el crecimiento de los queratinocitos. Dependiendo de la capacidad proliferativa de los queratinocitos individuales, comienzan a formar colonias. Retire los medios y fije las colonias. Tiñe las células con un tinte adecuado para detectar las colonias para el recuento. En el siguiente protocolo, realizaremos el ensayo clonogénico de queratinocitos primarios recolectados de los ratones adultos después del tratamiento con compuestos de prueba.

- Después de recolectar muestras de piel dorsal de ratones adultos sacrificados, use pinzas esterilizadas en autoclave y un bisturí para colocar una piel dorsal a la vez, con el lado velloso hacia abajo, en una placa de Petri delgada y raspe el tejido subcutáneo, incluida la grasa del lado ventral del tejido de la piel, hasta que el tejido sea semitranslúcido.

Coloque esta piel raspada en PBS hasta que se procesen todas las demás pieles restantes. A continuación, utiliza un bisturí para cortar las muestras de piel en tiras de 0,5 x 1 a 1,5 centímetros. Coloque las tiras con el lado piloso hacia arriba en una placa de Petri estéril antes de hacer flotar las muestras con el lado piloso hacia arriba en la superficie de una solución de PBS más 2x Gentamicina de 20 mililitros suplementada con tripsina al 0,25% en una placa de Petri de plástico de 100 x 20 milímetros durante 2 horas a 32 grados Celsius.

Al final de la incubación, coloque una placa de Petri cuadrada de plástico estéril que contenga 15 mililitros de medio de recolección con una inclinación de 30 grados y use pinzas curvas para transferir con cuidado una tira de piel flotante a la placa. Sosteniendo una nueva hoja de bisturí en un ángulo perpendicular a la piel y usando una fuerza suficiente pero no excesiva, raspe la epidermis y los pelos de la muestra en el medio.

Cuando se hayan raspado todas las tiras, decanta cuidadosamente el sobrenadante que contiene células epidérmicas en un frasco estéril de 60 mililitros que contenga una barra magnética de agitación de 1.5 pulgadas y enjuague la placa de Petri con medio de recolección adicional para recolectar las células epidérmicas restantes.

Lleve el volumen final en el frasco a 30 mililitros con medio fresco y revuelva la solución de células epidérmicas a 100 rotaciones por minuto durante 20 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación por agitación, en una cabina de bioseguridad, retire la barra de agitación y filtre la solución celular a través de un colador de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.

Use pinzas y luego una pipeta para presionar los pelos y los materiales del estrato córneo a través del colador para manipular el tejido para liberar las células ciliadas atrapadas, y use 5 mililitros adicionales de medio de recolección para liberar las células ciliadas atrapadas restantes en el tubo.

- Es fundamental que las células epidérmicas y los pelos se manipulen para liberar las células de los folículos pilosos.

- Llevar el volumen total en el tubo hasta 50 mililitros con medio fresco y recoger el filtrado de la célula por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 5 mililitros de medio de recolección fresco y unas 20 trituraciones con una pipeta de 5 mililitros. Tome 0,5 mililitros de la dilución 1:20 y transfiérala a un tubo de microfuga de 2 mililitros.

Después de mezclar la muestra cuidadosamente, tome 200 microlitros del tubo de microfuga y mezcle suavemente con un volumen igual de solución de azul de tripano al 0,4%. Mezcle suavemente esta solución tres veces y transfiera las células a un hematitómetro para contar los queratinocitos nucleados.

Marque todas las células de color azul oscuro como células no viables y marque las pequeñas células doradas de color rosado como células viables. La viabilidad promedia alrededor del 80%, y el rendimiento final de queratinocitos por ratón debería ser de unos 30 millones de células viables. Después del recuento, recoja las células con otra centrifugación y, para el cultivo masivo, resuspenda de 2 a 4 veces 10 a la sexta queratinocitos viables por placa de Petri de 35 milímetros en 2 mililitros de medio de cultivo celular.

Para un ensayo de formación de colonias clonogénicas, resuspenda las células a una velocidad de 1 por 10 al tercer queratinocito por cada 4 mililitros de medio William's E modificado con suplementos y concentración sérica por placa de Petri de 60 milímetros recubierta de colágeno en capas alimentadoras 3T3 de ratón suizo irradiadas con rayos X.

Para el cultivo en masa, cultive los cultivos a 32 grados Celsius con dióxido de carbono al 5% durante el período de cultivo celular apropiado, cambiando el medio 24 horas después de la siembra inicial para el cultivo en masa y 3 veces por semana a partir de entonces.

Al final del cultivo clonal, aspirar el medio y fijar las colonias en formol tamponado al 10% durante la noche a temperatura ambiente. A la mañana siguiente, tiñe las colonias con 0,5% de rodamina B en agua esterilizada en autoclave durante una hora antes de enjuagar los platos con agua fría esterilizada en autoclave hasta que el agua salga clara. Luego, incline los platos sobre sus tapas para que se sequen antes de contar las colonias.