Los análisis de población celular durante la carcinogénesis de piel

El objetivo general de este procedimiento es realizar análisis de poblaciones celulares en el modelo murino de carcinomas basocelulares de cáncer de piel. Esto se logra induciendo primero la expresión génica diana en ratones. En el segundo paso, la epidermis se aísla de la piel del ratón.

Después de generar una suspensión de una sola célula, las células epidérmicas se marcan con marcadores de servicio celular específicos. En última instancia, los cambios en la población celular durante el desarrollo del tumor en la piel se pueden monitorear mediante análisis de citometría de flujo. El desarrollo del cáncer es un proceso que involucra a muchos tipos de células.

El objetivo de este procedimiento es ayudar a los investigadores a investigar cómo las diferentes células contribuyen al desarrollo del cáncer de piel. Este método puede proporcionar información sobre las interacciones celulares durante el desarrollo del cáncer de piel, pero también se puede aplicar a otros sistemas, como el cáncer de páncreas. La demostración visual de este método es crítica, ya que es difícil determinar cuándo se debe terminar el experimento sin una evaluación visual.

Para empezar, los ratones ma queratina 14 Cree ER denominados ratones K 14 y los ratones Rosa 26 que contienen el gen mutante suavizado SMU M marcado con YFP dos denominados SMU. Ratón. A continuación, sumerja los especímenes de cola de 0,5 centímetros de largo cosechados de ratones doble positivos de tres a seis semanas de edad en una solución de lisis de cola por PCR directa con un miligramo por mililitro de proteinasa K. Luego incube los especímenes durante la noche a 55 grados Celsius con agitación. Al día siguiente, haga girar el tejido a máxima velocidad en una microcentrífuga para eliminar los residuos.

A continuación, para genotipar cada animal, utilice un microlitro de SNAT de cada espécimen en reacciones individuales de PCR con los cebadores y las condiciones recomendadas por el proveedor. Use una aguja de alimentación curva de calibre 20 para administrar tamoxifeno a los animales. Doble positivo para K 14 C er, y ROSA 26 por sonda oral durante cinco días consecutivos para inducir la expresión de OO M dos en los queratinocitos.

En general, los fenotipos son más severos en la oreja y la cola de los ratones K 14 OO marcados con GFP para recolectar la piel para el análisis celular. Primero, use un temblor para quitar el pelaje del animal sacrificado. A continuación, retire la piel del ratón y sumerja el tejido en una solución de desecho a 37 grados centígrados durante una o dos horas.

Después del tratamiento de dispa, utilice un par de pinzas para separar la epidermis de la dermis. Ahora usa un par de tijeras para picar la epidermis. A continuación, sumerja el tejido en la solución de colagenasa cuatro durante una o dos horas a 37 grados centígrados en un tubo de 50 mililitros.

Agitar suavemente el tubo cada 20 minutos para disociar las células. Utilice un microscopio para confirmar la disociación celular cuando se puedan detectar células individuales en el medio colagenasa. Incube el espécimen durante 30 minutos adicionales para aumentar el rendimiento de las celdas.

A continuación, filtre la mezcla de tejidos a través de un colador de células de 70 micras y lave las células durante 10 minutos a 500 veces G y temperatura ambiente para etiquetar las células comenzando por resus, suspendiendo el pellet recién lavado en PBS suplementado con 10% de FBS a 2,5 veces 10 de las seis células por mililitro. A continuación, coloque la solución celular en hielo durante 30 minutos para bloquear cualquier unión no específica. A continuación, transfiera las alícuotas de las células a microtubos de 1,5 mililitros para el marcaje de anticuerpos específicos.

Añadiendo los anticuerpos a cada tubo a una concentración final de dos microgramos por mililitro. Agite suavemente los tubos durante varios segundos para mezclar los anticuerpos con las células y luego vuelva a colocar los tubos en hielo durante otros 30 minutos. Después de lavar los tubos en un mililitro de PBS, vuelva a suspender los gránulos en PBS y luego agregue DPI a una concentración final de un miligramo por mililitro.

Al analizar los datos, primero seleccione celdas individuales en función del diagrama de dispersión directa frente a dispersión lateral, excluyendo las celdas muertas positivas DABI. Los ratones no desarrollan carcinomas de células basales, excepto cuando se activa la señalización del erizo, como se ve en estas imágenes. La expresión inducida por tamoxifeno del M dos YFP oncogénico liso suavizado da como resultado un fenotipo cutáneo que es evidente incluso a nivel anatómico de crecimiento en los especímenes teñidos con h y e de la piel de estos animales.

Se pueden observar tumores cutáneos en ratones K 14 SMU. Sin la inducción de SMU M dos YFP, la piel del animal no mostró morfología anormal por h y e. La tinción de estos diagramas de puntos muestra un análisis representativo de las células mieloides en ratones normales y portadores de tumores.

Las células CD 11 B positivas GR one positivas se derivan de células mieloides, algunas de las cuales son células supresoras derivadas de mieloides en ratones normales y no smu M dos inducidos por YFP. La población de células positivas para GR 11 B CD 11 B es apenas detectable, pero aumenta en respuesta a la inflamación o al desarrollo de tumores. En ratones K 14 SMU.

La expresión inducida de smu, M, dos YFP y queratinocitos en la piel da como resultado un aumento en la población de células positivas para CD-11 B, GR one. Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de la biología de la piel realizar análisis moleculares del carcinoma de células B en ratones.