Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas humanas utilizando queratinocitos derivados del cabello. Esto se logra primero aislando los cabellos de un donante. El segundo paso es colocar los pelos en placas para facilitar el crecimiento de los queratinocitos.

A continuación, los queratinocitos se mantienen y expanden in vitro. El paso final es reprogramar los queratinocitos en células madre pluripotentes inducidas por humanos utilizando un método de reprogramación episomal. En última instancia, las células IPS humanas se pueden aislar y caracterizar mediante inmunohistoquímica para mostrar la expresión de marcadores pluripotentes.

La ventaja general de este método sobre los métodos existentes, como el método retroviral o lentiviral, es que al utilizar el factor episomal, estamos evitando transgenes indeseables. Se integran en el genoma en las células madre que se generan Comience descongelando un vial de solución de matriz extracelular en hielo durante la noche. A la mañana siguiente, utilice las puntas de pipeta preenfriadas para añadir 200 microlitros de la solución a 12 mililitros de medio DM F 12 refrigerado.

Agregue un mililitro de la solución diluida de la matriz extracelular a cada pocillo de un 12. Coloque la placa e incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados para cubrir los pocillos con matriz. A continuación, recoja el cabello humano primario de la cabeza del donante colocando los dedos cerca de la raíz del cabello y arrancando el cabello con un movimiento rápido y suave.

Verifique para confirmar que cada cabello recolectado contenga un folículo piloso intacto. Coloque el folículo bajo un microscopio de disección y determine la fase de crecimiento de cada cabello. Recoja de cinco a 10 pelos de antígeno de cada individuo para extraer hielo queratinoso.

La fase antígeno, a diferencia de la fase T, contiene múltiples capas de epitelio. Coloque las muestras de cabello en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de una mezcla de antibióticos durante cinco minutos y luego lávelas en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, agarre el cabello con pinzas estériles y use un par de tijeras estériles para cortar el exceso de tallo de cabello, dejando un fragmento de cabello con un folículo piloso intacto y alrededor de 0,5 a un centímetro de tallo de cabello.

Transfiera con cuidado un fragmento de cabello a cada pocillo de la placa recubierta de matriz extracelular. Usando las pinzas estériles, acaricio aproximadamente de 100 a 200 microlitros de reemplazo de suero. Medio gota a gota a cada pocillo que contenga muestras de cabello.

Luego coloque la placa en la incubadora y deje que los folículos se adhieran durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono al día siguiente. Agregue suavemente otros 100 a 200 microlitros de reemplazo de suero, gota a gota para mantener las muestras de cabello húmedas. Revise las muestras de cabello diariamente para confirmar que los folículos pilosos se han adherido con éxito a la placa.

Una vez colocado, agregue suavemente 500 microlitros adicionales de medio al pocillo. Cambie los medios cada dos días. Preco una placa de seis paredes con colágeno.

Tipo uno, utilizando un pretratamiento, como un kit de matriz de recubrimiento, a 680 microlitros del medio de dilución desde el kit hasta cada pocillo, seguido de 6,8 microlitros de la solución de matriz de recubrimiento. Agite la placa suavemente para asegurar un recubrimiento uniforme. Deje que la placa recubierta se incube durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de colocar los queratinocitos.

Retire la solución de recubrimiento, disocie los queratinocitos en cultivo en una suspensión de una sola célula agregando 500 microlitros de tripsina al 0,25% por pocillo e incube las placas durante dos a cinco minutos a 37 grados Celsius. Una vez que las células se liberan de la placa, inactive la tripsina con 500 microlitros de suero que contenga medio y recoja las células en un tubo estéril de 15 mililitros. Retire el fragmento de cabello con pinzas esterilizadas, granule las células y luego resus.

Suspenderlos en una placa fresca de medio de crecimiento de queratinocitos 40, 000 queratinocitos en un pocillo de la placa recubierta de colágeno en presencia de medio de queratinocitos. Cambie el medio todos los días y pase las células cuando el cultivo sea aproximadamente 80% confluente código V una placa de seis paredes con gelatina agregando dos mililitros de una solución de gelatina al 0.1% en cada una, bien deje que la gelatina se cubra durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, disocie los queratinocitos que están en el pasaje seis o inferior en una suspensión de una sola célula agregando un mililitro de 0,25% de tryin por pocillo e incubando las células durante dos a cinco minutos.

A 37 grados centígrados, inactive la tripsina con un mililitro de medio que contenga suero y recoja las células en un tubo de 15 mililitros. Granular las células y volver a suspenderlas en medio de queratinocitos. A continuación, coloque de 100.000 a 150.000 queratinocitos por pocillo en una placa gelatinizada de seis pocillos e incubelos durante la noche del día siguiente, día cero, revise la placa para asegurarse de que las células estén confluentes en un 50 a 60%.

Realice una transfección de los vectores de reprogramación episomal en los queratinocitos utilizando una proporción de ocho microlitros de reactivo de transfección por dos microgramos de ADN plasmático total, como se describe en el protocolo de texto adjunto. Al día siguiente, el primer día, cambie el medio de queratinocitos y verifique la eficiencia de la transfección estimando el porcentaje de células positivas para proteínas fluorescentes verdes bajo un microscopio fluorescente. Se espera una eficiencia de transfección del 60 al 70% en el segundo día.

Repita la transfección para aumentar la eficiencia de la transfección a más del 90%Luego codifique previamente un plato de 10 centímetros con cinco mililitros de gelatina al 0,1% durante al menos 20 minutos. Coloque 4 millones de células alimentadoras mitóticamente inactivadas por placa de 10 centímetros en medio FBS como se describe en Conrad Al all y permita que las células se asienten y se adhieran durante la noche en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono en el tercer día. Recoja los queratinocitos transfectados como se muestra anteriormente y vuelva a suspenderlos en una placa mediana KSR.

El 90% de los queratinocitos de uno de los pocillos en un plato de 10 centímetros preparado con células alimentadoras y cubrirlos con KSR. Medio Aislar colonias de células madre pluripotentes inducidas humanas mediante disección manual a partir del día 21. Evite las colonias que estén muy agrupadas y elija solo colonias que estén claramente separadas de las demás.

Para la disección manual, use una aguja de calibre 26 para cortar las colonias en pedazos pequeños de alrededor de 300 a 600 micrómetros de largo bajo un microscopio de disección. Transfiera las piezas de una colonia a una nueva placa alimentadora de MEF para establecer una línea clonal de células madre pluripotentes inducidas humanas. Una vez que el cultivo alcanza el 70 al 80% de fluidez con colonias de células madre pluripotentes inducidas humanas de aproximadamente 1,5 milímetros de diámetro, las células utilizan métodos de empaquetamiento enzimático estándar como Accutane, sase o colagenasa.

Cuatro, según las instrucciones del fabricante. Al seguir este protocolo, las excrecencias de recy se pueden observar tan pronto como tres días después de la fijación del cabello y continuarán proliferando. Los queratinocitos que se muestran aquí fueron pasados a una nueva placa y estas células se pueden mantener durante múltiples pasajes.

Esta imagen muestra una colonia típica de células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de queratinocitos. Después de 32 días de reprogramación, puede ocurrir alguna diferenciación en el centro de la colonia de células madre pluripotentes inducidas humanas. Una vez seleccionadas manualmente, las células derivadas suelen mostrar una alta proporción de núcleos a citoplasmas y un límite de colonia definido.

También expresan una serie de marcadores pluripotentes, como OCT cuatro nag y TRA uno 60. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer queratinocitos del cabello y reprogramarlos en células madre inducidas por humanos.