Name: Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas humanas libres de integración usando queratinocitos derivados de pelo. Este método con vectores episomales evita la integración genómica indeseable.

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Los autores desean agradecer a Harene Ranjithakumaran y Stacey Jackson por su apoyo técnico. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (R.C.B. Wong, A. Pébay), la Universidad de Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) y el Instituto de Investigación Oftálmica de Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Beca del Consejo Australiano de Investigación (A. Pébay, FT140100047), Beca de la Fundación Cranbourne (R.C.B. Wong); financiación interna de los Institutos Nacionales de Salud (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) y apoyo a la infraestructura operativa del Gobierno de Victoria.

La colección de la muestra de cabello humano de las personas requiere la aprobación ética por el comité de ética de la investigación humana en las instituciones de acogida y debe hacerse de conformidad con las directrices institucionales. 1. Aislamiento de queratinocitos de pelo Plucked <ol><li> Descongele la matriz extracelular solución (ECM) (es decir, Matrigel) en el hielo O / N. </li><li> Utilizando puntas de pipeta de pre-enfriado, añadir 200 l solución ECM de 12 ml de medio DMEM / F12 frío. Rociar una placa de 12 pocillos con 1 ml de solución ECM diluido en cada pocillo. Incubar la placa recubierta O / N a 37 ° C. Lave la placa recubierta con medio precalentado DMEM / F12 antes de su uso. </li><li> Recoger el pelo humano primario de la cabeza del individuo mediante la colocación de los dedos cerca de la raíz del cabello y el desplume el pelo en un movimiento rápido y suave. Revise para confirmar que cada pelo recogido contiene un folículo piloso intacto y determinar la fase de crecimiento del cabello de la ONUder un microscopio de disección (Figura 1). <ol><li> Suma 5-10 pelos anágena de cada individuo para extraer los queratinocitos. Proceso arrancó los pelos tan pronto como sea posible para asegurar la obtención exitosa de los queratinocitos. Nota: la Figura 1 ilustra la morfología de pelos en diferentes fases del ciclo de crecimiento. Cabello anágeno está en la fase de crecimiento, con una capa exterior visible del epitelio que rodea la longitud del pelo, conocido como los ORS. Por otra parte, el pelo telógeno representa cabello en la fase de reposo y no tiene una ORS visibles, pero tiene un talón de las células que cubren la raíz del cabello, conocido como el bulto telógeno. </li></ol></li><li> Colocar las muestras de cabello en una placa Petri que contiene 10 ml de antibiótico Mix para lavar durante 5 min a RT. </li><li> Con unas tijeras y pinzas esterilizadas, cortar cabello excesiva, dejando un fragmento de cabello con un folículo piloso intacto y alrededor de 0,5 a 1 cm de cabello. </li><li> Cuidadosamente transfer fragmento 1 de pelo en cada pocillo de la placa de ECM recubiertos con el uso de fórceps. </li><li> Con una pipeta 1 ml, añada aproximadamente 3 gotas de reemplazo Knockout Suero (KSR) medio (~ 100-200 mu l) para las muestras de cabello. Nota: Mantenga los fragmentos de pelo en estrecho contacto con la superficie de la placa para permitir la unión y posterior derivación de queratinocitos. Adición de medios excesiva en este paso puede hace que los fragmentos de pelo para flotar y disminuye la probabilidad de apego pelo éxito. </li><li> Incubar las muestras de cabello en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2 y permitir que los folículos del pelo para sujetar O / N. Al día siguiente, añadir suavemente otros 3 gotas de medio de KSR (~ 100 a 200 l) para mantener las muestras de cabello húmedo. </li><li> Tenga en cuenta las muestras de cabello todos los días para confirmar que los folículos pilosos se han unido con éxito. En general adjunto de los folículos pilosos es evidente dentro de 1-3 días. Pelos gruesos suelen ser más fáciles de colocar en comparación con los pelos finos, como pelos finos tienen mayortendencia a flotar que dificultan el proceso de apego. <ol><li> Una vez que el cabello se han unido a la placa revestida, añadir 500 l de medio de KSR al pozo. Tenga mucho cuidado al añadir el medio como muestras de cabello no puede haber bien sujeto. Desde este punto, cambiar de medios cada 2 días. Nota: excrecencias queratinocitos deben ser visibles desde la región ORS del fragmento de pelo después de 3-7 días (Figura 2A-B). Permita que los queratinocitos a crecer hasta 14 días antes de que pases las células como se describe en la siguiente sección. </li></ol></li></ol> 2. Mantenimiento y pases de queratinocitos <ol><li> Pre-coat una placa de 6 pocillos usando el Kit de matriz de revestimiento. Añadir 680 l de la dilución medio del kit a cada pocillo, seguido de 6,8 l de solución de matriz de revestimiento. Agitar la placa para asegurar la distribución uniforme de la solución matriz de revestimiento en el plato. </li><li> Dejar que la placa revestida incubar durante 30 min a TA. Quitarla solución matriz de recubrimiento antes de chapado de los queratinocitos. </li><li> Disociar queratinocitos en una sola suspensión celular con 500 l de tripsina al 0,25% por pocillo durante 2-5 min a 37 ° C. Inactivar la tripsina con 500 l de medio que contiene suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS) medio) y recoger en un tubo de 15 ml estéril. Retire el fragmento de pelo con unas pinzas esterilizadas. </li><li> Determinar el número de células cosechadas usando un hemocitómetro. </li><li> Centrifugar las células durante 3 min a 200 x g. Lavar las células con PBS y centrifugación de repetición. Aspirar el PBS y resuspender el botón celular en medio de queratinocitos fresco. </li><li> Placa abajo 4 × 10 4 queratinocitos en un pocillo de la placa de ECM-recubierto en presencia de medio de queratinocitos. Mantener los queratinocitos en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2 (Figura 2C). Cambie los medios cada día las células y de paso cuando la cultura es de ~ 80% de confluencia, which puede tardar aproximadamente 2-7 días, dependiendo del número de pases y la proliferación de los queratinocitos tasa. Los queratinocitos derivados deberían ampliarse para generar suficientes existencias congeladas utilizando métodos de criopreservación lenta congelación estándar 16. Nota: Las condiciones de cultivo descritas apoyan la expansión de la población homogénea de queratinocitos con típica morfología de adoquines (Figura 2C). De vez en cuando, un par de queratinocitos diferenciados, con morfología grande y plana y han perdido potencial de replicación, se pueden observar en la cultura. Caracterización de los queratinocitos se puede realizar mediante inmunotinción utilizando anticuerpos contra citoqueratina 14 como se describió previamente 17. Líneas celulares de queratinocitos establecidos también deben ser probados para micoplasma después de 1-3 pasajes utilizando kit disponible comercialmente. </li></ol> 3. Generación de hiPSCs a partir de queratinocitos Uso de vectores episomales <ol><li> Pre-capa una placa de 6 pocillos con0,1% de gelatina (2 ml / pocillo). Permitir gelatina para recubrir por lo menos durante 20 min a TA. </li><li> Para el experimento de reprogramación, el uso de queratinocitos no más tarde de paso 6. disocian queratinocitos en una única suspensión de células con 1 ml de tripsina al 0,25% por pocillo durante 2-5 min a 37 ° C. Inactivar tripsina con 1 ml de medio que contiene suero (por ejemplo, medios de comunicación FBS) y recoger en un tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar las células durante 3 minutos a 200 xg y volver a suspender las células en medio de queratinocitos. Plate 1 × 10 5 -1,5 × 10 5 queratinocitos por pocillo en una placa gelatinizada O / N. </li><li> Al día siguiente (día 0), compruebe la placa para asegurarse de células son 50-60% de confluencia. Nota: Si los queratinocitos son menos de ~ 50% de confluencia que podría no crecer bien después de la transfección. </li><li> En el Día 0, lleve a cabo la transfección de los vectores de reprogramación episomal en los queratinocitos, utilizando una relación de reactivo de transfección 8 l a 2 g de ADN plasmídico total.<ol><li> Tomar 0,5 g para cada uno de los 4 plásmidos (pCXLE-EGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-HSK, pCXLE-Hul) y diluir en 100 l de medio de suero reducido (por ejemplo, OPTI-MEM). Nota: El plásmido pCXLE-eGFP se utiliza para supervisar las eficiencias de transfección en los queratinocitos y no se requiere para la reprogramación éxito. </li><li> Añadir 8 l de reactivo de transfección con el ADN diluido. Mezclar con un movimiento rápido del tubo. Dejar que la mezcla de reacción de ADN para descansar sin perturbaciones a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Reemplace el medio de queratinocitos con medio fresco. </li><li> Añadir con cuidado la mezcla de reacción de ADN para cultivo de queratinocitos e incubar en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2 durante 4 horas. Nota: No se recomienda realizar prolongada transfección O / N en los queratinocitos, ya que presentan una baja supervivencia después de la transfección. </li><li> Después de 4 horas después de la transfección, sustituya el medio de queratinocitos con medio fresco. </li></ol></li><li> En el Día 1 (1 día después de la transinfección), cambiar el medio de queratinocitos y comprobar la eficacia de transfección mediante la estimación del porcentaje de células positivas EGFP bajo un microscopio fluorescente. Por lo general se observa&gt; 60-70% de eficiencia de transfección de queratinocitos primarios que utilizan este protocolo. </li><li> En el Día 2, repita transfección como se describe en el paso 3.5. Dos transfecciones consecutivos típicamente alcanzar&gt; 90% de eficiencia de transfección. Cultivo de queratinocitos suele alcanzar confluencia por el final de la segunda transfección. <ol><li> Preparar un plato de 10 cm de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de alimentación para cada reacción reprogramación. Preparar alimentadores MEF mitóticamente inactivadas como se describió anteriormente 18. </li><li> Pre-coat un plato de 10 cm con 5 ml de 0,1% de gelatina durante al menos 20 min. Placa 4 × 10 6 MEF mitóticamente inactivados por placa de 10 cm en medio FBS. Permitir que las células se asienten y se unen O / N en una incubadora a 37 ° con 5% de CO 2. </li></ol></li><li> El día 3, harconferir los queratinocitos con 0,25% de tripsina como se describe en el paso 3.2 y 3.3. Resuspender los queratinocitos en medio KSR y la placa 90% de los queratinocitos a partir de 1 pocillo de una placa de 6 pocillos en un plato de 10 cm alimentador MEF con medio KSR. </li><li> Desde el Día 4 en adelante, cambiar el medio KSR cada día. <ol><li> Alternativamente después del día 18, reemplace medio de cultivo cada dos días. Nota: Los queratinocitos para no reprogramado dejarán de proliferar, mientras que las colonias hiPSC con límites definidos que se asemejan a las células madre embrionarias humanas (hESCs) surgirán de Día 14-21. </li></ol></li><li> Aislar colonias hiPSC por disección manual desde el día 21 en adelante. Evite colonias hiPSC que están estrechamente agrupados juntos y sólo recogen colonias hiPSC que se separan claramente de los demás. Nota: colonias hiPSC pueden ser recogidos antes, pero la colonia con límites definidos pueden no ser evidentes en momentos anteriores dado el tamaño de las colonias pequeñas. Eficiencia reprogramación pueden variar entre difftambién está influenciada de queratinocitos paciente Erent, y por otros factores tales como el número pasaje o tasa de proliferación de queratinocitos. <ol><li> Para la disección manual de las colonias hiPSC, utilice una aguja 26G para cortar colonias hiPSC bajo un microscopio de disección. Cortar una colonia hiPSC en trozos pequeños alrededor de 300 a 600 micras de longitud. Transfiera las piezas de una colonia hiPSC en una nueva placa de alimentación MEF (2,5 × 10 4 MEF / cm 2) para establecer una línea clonal de hiPSCs. Inicialmente, la cultura de cada línea clonal hiPSC en un pocillo de una placa de 12 o de cultivo de órganos así los platos, a continuación, expanda al 6 de formato de placa también. </li><li> Mantener líneas clonales establecidos de hiPSCs en medio KSR en alimentadores MEF. Una vez que la cultura alcanzar el 70 - 80% de confluencia con colonias hiPSC ~ 1,5 mm de diámetro, hiPSCs de paso utilizando métodos estándar enzimáticos pases (Accutase, dispasa o colagenasa IV) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Caracterizar línea hiPSC establecidos para confirmar la pluripotencia y su capacidad para diferenciarse en células representativas de las tres capas germinales in vitro y / o in vivo 13,19. También, de forma rutinaria prueba establecidos líneas hiPSC para micoplasma utilizando kits comerciales para asegurarse de que están libres de patógenos. Monitorear rutinariamente la estabilidad genómica de líneas hiPSC por cariotipo o el número de copias variación basada en matrices (CNV) análisis. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Generación de hiPSCs específicos del paciente ofrece un enfoque único para el estudio de la patogénesis en los tipos de células enfermas in vitro, y también proporciona una plataforma para la detección de drogas para identificar nuevas moléculas que pueden rescatar a los fenotipos de la enfermedad. Este enfoque de modelado enfermedad utilizando hiPSCs ha dado resultados prometedores para una variedad de enfermedades, incluyendo el síndrome de QT largo, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson y la escl...

El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) ha revolucionado el campo de la medicina regenerativa, proporcionando un método viable para la generación de células madre específicas del paciente 1-3. hiPSCs se han generado con éxito de varios tipos de células somáticas, incluyendo fibroblastos, células hematopoyéticas 4,5 6,7, células epiteliales renales de orina 8 y queratinocitos 9,10. Hasta la fecha, los fibroblastos de piel y células hematopoyéticas representan las fuentes de células más comúnmente utilizados para la generación de CMPI específicos del paciente. Posiblemente, esto se debe al hecho de que las biopsias de piel y la extracción de sangre son procedimientos médicos de rutina y los grandes bancos de datos genéticos de la sangre o de la piel muestras de los pacientes se han establecido en muchos países. En contraste con las células de la sangre y los fibroblastos de la piel que requieren métodos de extracción invasivos, los queratinocitos representan un tipo de célula de fácil acceso para la generación de hiPSC. KeratinocytES son células epiteliales de queratina rica que forman la barrera epidérmica exterior de la piel y también se encuentran en las uñas y el pelo 11. En particular, los queratinocitos se pueden encontrar en la vaina externa de la raíz (ORS) de los folículos pilosos, una capa celular externa que cubría el eje del pelo junto con la vaina radicular interna (IRS) células (12, Figura 1). Como colección de cabello es un procedimiento sencillo que no requiere la asistencia de personal médico, que proporciona una oportunidad para que los pacientes recogen y envían a sus propias muestras de cabello a los laboratorios, lo que facilitaría enormemente la recogida de muestras de los pacientes para la generación hiPSC. Queratinocitos epidérmicos también tienen una mayor eficiencia de reprogramación y la cinética de reprogramación más rápidas en comparación con los fibroblastos, añadiendo a las ventajas de utilizar los queratinocitos como las células de partida para la generación de hiPSC 9,13. Además, hiPSCs también se puede generar usando otras poblaciones de células dentro del folículo piloso,incluyendo las células de la papila dérmica situados en la base del folículo piloso 14,15. Informes anteriores de la generación de IPSC utilizando células derivadas de pelo a menudo utilizan métodos de reprogramación retrovirales o basados ​​en lentivirus 9,14,15. Sin embargo, estos métodos virales introducen integración genómica indeseable de transgenes extraños durante la reprogramación. En comparación, el uso de vectores episomales representa un método de reprogramación factible, no viral para generar CMPI-integración libre 4. Hemos desarrollado previamente un método sencillo, rentable y no viral para reprogramar eficiente de queratinocitos en hiPSCs utilizando vectores episomales 13. Aquí nos proporcionan un protocolo detallado para la generación de hiPSCs de queratinocitos derivados, incluyendo la derivación de los queratinocitos de desplumado pelo, expansión y mantenimiento de los queratinocitos y la posterior reprogramación para generar hiPSCs.

<table><tbody><tr><td>Mezcla de antibióticos:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>La mezcla antibiótica <td>de anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20 ml de 250 ng</td><td>/ml está compuesta por PBS.</td></tr><tr><td>1X Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Reemplazo de suero knockout (KSR) medio:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>El medio KSR se filtra con Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) antes de su uso. El bFGF se añade fresco al medio antes de su uso.</td></tr><tr><td>20% de reemplazo de suero knockout (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 con glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1&times; MEM aminoácido no esencial</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0.5 veces; Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 0,1 mM &beta;-mercaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; bFGF (10 ng/ml, añadido fresco)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>Medio de queratinocito:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; EpiLife con 60&nbsp; y micro; M Invitrogen de calcio</td><td></td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1&times; Suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS)</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS) medio:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>El medio FBS se filtra con Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) antes de su uso.</td></tr><tr><td>10% suero fetal bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0.5x Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0.25% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Matriz extracelular (ECM):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354234</td><td>Aliquot Matrigel stock y tienda en -80&deg; C siguiente fabricante» s instrucciones. La concentración de existencias de Matrigel varía ligeramente de un lote a otro (~9 mg/ml). Recomendamos utilizar 200&micro; l Matrigel para recubrir una placa de 12 pocillos (~ 150 y micro; g/pozo).&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de matriz de recubrimiento&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>Plásmidos:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tenga en cuenta que pCXLE-eGFP solo se utiliza para monitorear la eficiencia de la transfección y no es necesario para la reprogramación.</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina (de piel de cerdo)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Gelatina de composición al 0,1% en agua destilada. Autoclave antes de usar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Medio sérico reducido: OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr>Alimentador <td></td><td></td> de<td>fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)</td><td>MEF puede ser inactivado por tratamiento con mitomicina C o irradiación como se ha descrito anteriormente 16.</td></tr><tr><td>Aguja de 26G</td><td>Terumo NN2613R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos (tratamiento con cultivo de tejidos)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos (tratamiento con cultivo de tejidos)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>plato de 10 cm (tratamiento con cultivo de tejidos)</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 353003 <td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>Uso a 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Uso a 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Anticuerpo TRA-160</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>Uso a 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>anticuerpo OCT4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>Uso a 5 &micro; g/ml</td></tr><tr><td>anticuerpo NANOG</td><td>R& D Systems</td><td>AF1997</td><td>Uso en 10 y micro; g/ml</td></tr><tr><td>Kit de detección MycoAlert</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de células madre integración de libre humanos pluripotentes inducidas usando derivada de pelo queratinocitos

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Los avances recientes en la reprogramación nos permiten convertir las células somáticas en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs). El modelado de enfermedades mediante el uso de hiPSC específicas del paciente permite el estudio del mecanismo subyacente de la patogénesis, proporcionando también una plataforma para el desarrollo de la detección de fármacos in vitro y la terapia génica para mejorar las opciones de tratamiento. El prometedor potencial de las hiPSC para la medicina regenerativa también es evidente por el creciente número de publicaciones (>7000) sobre iPSCs en los últimos años. Varios tipos de células de distintos linajes se han utilizado con éxito para la generación de hiPSC, incluidos los fibroblastos de la piel, las células hematopoyéticas y los queratinocitos epidérmicos. Si bien las biopsias de piel y la extracción de sangre se realizan de forma rutinaria en muchos laboratorios como fuente de células somáticas para la generación de hiPSC, la recolección y posterior derivación de queratinocitos pilosos se utilizan con menos frecuencia. Los queratinocitos derivados del cabello representan un enfoque no invasivo para obtener muestras de células de los pacientes. Aquí describimos un método simple y no invasivo para la derivación de queratinocitos a partir de cabello arrancado. También proporcionamos instrucciones para el mantenimiento de los queratinocitos y su posterior reprogramación para generar hiPSC libres de integración utilizando vectores episomales.

El pelo pasa por 3 fases diferentes del ciclo de crecimiento: anágena (fase de crecimiento), catágena (la fase de regresión) y telógeno (la fase de descanso) 20,21. El folículo del pelo anagen contiene múltiples capas de epitelio; estas capas incluyen las sales de rehidratación oral, IRS y el tallo del pelo (Figura 1). Anagen pelo finalmente se somete a la transición a la fase catágena, que se caracteriza por la apoptosis de las sales de rehidratación oral y la terminación de la diferenciació...

Este manuscrito proporciona un procedimiento paso a paso para la derivación y el mantenimiento de queratinocitos humanos a partir de pelo arrancado y la posterior generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) libres de integración por vectores episomales.

Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

El objetivo general de este procedimiento es generar células madre pluripotentes inducidas humanas utilizando queratinocitos derivados de cabello. Esto se logra primero aislado cabellos de un donante. El segundo paso consiste en sembrar los cabellos para facilitar la migración de queratinocitos.A continuación, los queratinocitos se mantienen y amplifican in vitro. El paso final consiste en reprogramar los queratinocitos en células madre pluripotentes inducidas humanas mediante un método de reprogramación episomal. En última instancia, las células IPS humanas pueden aislarse y caracterizarse mediante inmunohistoquímica para demostrar la expresión de marcadores pluripotentes.La ventaja general de este método frente a los métodos existentes, como el retroviral o el lentiviral, es que al utilizar factores episomales, evitamos la inserción de transgenes indeseables en el genoma de las células madre generadas. Comience por descongelar un vial de solución de matriz extracelular sobre hielo durante la noche. A la mañana siguiente, utilice puntas de pipeta previamente enfriadas para añadir 200 microlitros de la solución a 12 mililitros de medio DMEM/F12 frío.Añada un mililitro de la solución diluida de matriz extracelular a cada pocillo de una placa de 12 pocillos e incube la placa durante la noche a 37 °C para recubrir los pocillos con la matriz. A continuación, recolecte cabello humano primario de la cabeza del donante colocando los dedos cerca de la raíz del cabello y extrayéndolo con un movimiento rápido y suave.Verifique que cada pelo recolectado contenga un folículo piloso intacto. Coloque el folículo bajo un microscopio estereoscópico y determine la fase de crecimiento de cada pelo. Recolecte de cinco a diez pelos antigénicos de cada individuo para extraer la queratina helada.La fase antigénica, a diferencia de la fase T, contiene múltiples capas de epitelio. Coloque las muestras de cabello en una placa de Petri que contenga 10 mililitros de una mezcla de antibióticos durante cinco minutos, y luego lávelas en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, sujete el cabello con pinzas estériles y utilice un par de tijeras estériles para cortar el exceso de vástago piloso, dejando un fragmento de cabello con un folículo piloso intacto y aproximadamente de 0,5 a un centímetro de vástago piloso.Transfiera cuidadosamente un fragmento de cabello a cada pocillo de la placa recubierta con matriz extracelular. Utilizando la pinza estéril, añada aproximadamente de 100 a 200 microlitros de suero de reemplazo. Medio gota a gota a cada pocillo que contenga muestras de cabello.Luego, coloque la placa en el incubador y deje que los folículos se adhieran durante la noche a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono al día siguiente. Añada suavemente de 100 a 200 microlitros adicionales de medio con reemplazo sérico, gota a gota, para mantener las muestras de cabello húmedas. Revise las muestras de cabello diariamente para confirmar que los folículos pilosos se hayan adherido correctamente a la placa.Una vez fijado, agregue suavemente 500 microlitros adicionales de medio al pocillo. Cambie el medio cada dos días. Recubra una placa de seis pocillos con colágeno.Utilice un tipo con un pretratamiento, como un kit de matriz de recubrimiento, agregando 680 microlitros del medio de dilución del kit a cada pocillo, seguido de 6,8 microlitros de la solución de matriz de recubrimiento. Agite suavemente la placa para asegurar un recubrimiento uniforme. Permita que la placa recubierta incube durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de sembrar los queratinocitos.Retire la solución de recubrimiento, disocie los queratinocitos en cultivo en una suspensión de células individuales añadiendo 500 microlitros de tripsina al 0,25% por pocillo e incube las placas durante dos a cinco minutos a 37 grados Celsius. Una vez que las células se desprendan de la placa, inactívelice la tripsina con 500 microlitros de medio que contenga suero y recoja las células en un tubo estéril de 15 mililitros. Retire el fragmento de cabello utilizando pinzas esterilizadas, haga un pellet de las células y luego resus.Siéntelas en medio de crecimiento para queratinocitos fresco y plaquee 40.000 queratinocitos en un pozo de la placa recubierta con colágeno en presencia de medio para queratinocitos. Cambie el medio cada día y pasee las células cuando el cultivo alcance aproximadamente un 80 % de confluencia. Recubra una placa de seis pozos con gelatina añadiendo dos mililitros de una solución de gelatina al 0,1 % en cada pozo y permita que la gelatina recubra durante al menos 20 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, disocie los queratinocitos del paso seis o inferior en una suspensión de células individuales añadiendo un mililitro de tripsina al 0,25 % por pozo e incube las células durante dos a cinco minutos.A 37 grados Celsius, inactivar la tripsina con un mililitro de medio que contenga suero y recoger las células en un tubo de 15 mililitros. Pelotar las células y resuspenderlas en medio para queratinocitos. A continuación, sembrar de 100 000 a 150 000 queratinocitos por pocillo en una placa de seis pocillos gelatinizada e incubar durante la noche. Al día siguiente, día cero, revisar la placa para asegurarse de que las células estén entre un 50 y un 60 % confluentes.Realice una transfección de los vectores episomales de reprogramación en los queratinocitos utilizando una proporción de ocho microlitros de reactivo de transfección por dos microgramos de ADN plasmídico total, según se describe en el protocolo de texto adjunto. Al día siguiente, día uno, cambie el medio de los queratinocitos y verifique la eficiencia de transfección estimando el porcentaje de células positivas para la proteína verde fluorescente mediante microscopía de fluorescencia. Se espera una eficiencia de transfección del 60 al 70 % el día dos.Repita la transfección para aumentar la eficiencia de transfección a más del 90 %. A continuación, recubra previamente una placa de 10 centímetros con cinco mililitros de gelatina al 0,1 % durante al menos 20 minutos. Siembre cuatro millones de células alimentadoras inactivadas mitóticamente por placa de 10 centímetros en medio con FBS, como se describe en Conrad et al., y permita que las células se asienten y adhieran durante la noche en un incubador a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono el día tres. Recopile los queratinocitos transfectados como se indicó anteriormente y resuspenda en medio KSR.El 90 % de los queratinocitos de uno de los pocillos en un plato de 10 centímetros preparado con células alimentadoras y cúbralos con KSR. Aislar colonias de células madre pluripotentes inducidas humanas mediante disección manual a partir del día 21. Evite las colonias que estén agrupadas estrechamente y seleccione únicamente aquellas que estén claramente separadas de las demás.Para la disección manual, utilice una aguja de 26 gauge para cortar las colonias en pequeños fragmentos de aproximadamente 300 a 600 micrómetros de longitud bajo un microscopio estereoscópico. Transfiera los fragmentos de una colonia a una nueva placa con fibroblastos embriónicos murinos (MEF) para establecer una línea clonal de células madre pluripotentes inducidas humanas. Una vez que el cultivo alcance una confluencia del 70 al 80 % con colonias de células madre pluripotentes inducidas humanas de aproximadamente 1,5 milímetros de diámetro, pase las células utilizando métodos enzimáticos estándar de disociación, como Accutase, tripsina o colagenasa.Cuatro, según las instrucciones del fabricante. Al seguir este protocolo, se pueden observar brotes celulares tan pronto como tres días después de la fijación del pelo y continuarán proliferando. Los queratinocitos mostrados aquí fueron transferidos a una nueva placa y estas células pueden mantenerse durante múltiples pases.Esta imagen muestra una colonia típica de células madre pluripotentes inducidas humanas derivadas de queratinocitos. Después de 32 días de reprogramación, puede ocurrir algo de diferenciación en el centro de la colonia de células madre pluripotentes inducidas humanas. Una vez seleccionadas manualmente, las células derivadas suelen presentar una alta relación núcleo-citoplasma y un límite de colonia bien definido.Ellos también expresan una serie de marcadores pluripotentes como OCT4, Nanog y TRA-1-60. Después de ver este video, usted debería tener una buena comprensión de cómo extraer queratinocitos del cabello y reprogramarlos en células madre pluripotentes inducidas humanas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Demostramos el protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas humanas con lentivirus mediada por la entrega de los factores humanos Oct4, Sox2, Nanog, y Lin28. Pluripotencia fue confirmada por la morfología y la presencia de células madre embrionarias (ES) de células específicas de los marcadores.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

El siguiente protocolo proporciona instrucciones para la adaptación humana células madre pluripotentes inducidas (iPS) celdas para alimentación libre de la cultura a través del alimentador de Libre completa golpe de gracia suero sustitución medio (KSR-FF). Una vez adaptado, instrucciones para el mantenimiento continuo también se proporcionan.

Alimentador de Libre adaptación, Cultura y pases de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Media

Este protocolo describe el procedimiento detallado para criopreservar las células iPS humanas en el medio de criopreservación golpe de gracia SR y la recuperación de estas células en el golpe de gracia completa alimentador gratis SR (KSR-FF) a medio o en el alimentador medio basado golpe de gracia SR.

Criopreservación y recuperación de células iPS humanas con anulación completa del alimentador de sustitución sin suero medio

En este artículo se presenta un robusto protocolo para el aislamiento y cultivo de células de la cresta neural madre de folículos pilosos humanos.

Aislamiento y cultivo de células troncales de la cresta neural de los folículos del cabello humano

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

derivación robusta de las células inducido por el hombre pluripotentes madre (HIPS) se logró mediante el uso de no-integración de virus Sendai (SeV) vector reprogramación mediada de fibroblastos dérmicos. el mantenimiento de células caderas y la expansión clonal se realizó utilizando condiciones de cultivo libre de xeno y definidos químicamente con laminina humana recombinante 521 (LN-521) de matriz y esencial E8 (E8) Medium.

Integración Derivación Gratuita de Células Madre Pluripotentes Inducidas Humanas Usando Laminin 521 Matrix

Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

Presentamos aquí un protocolo para la diferenciación de células madre humanas pluripotentes inducidas en cada derivado del somite (miotoma sclerotome, dermatoma y syndetome) en condiciones químicamente definidas, que tiene aplicaciones en modelos futuros de la enfermedad y terapias basadas en células en cirugía ortopédica.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Este protocolo describe un método para producir organoides cutáneos que contienen folículos pilosos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos utilizando un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido plano y fisiológicamente relevante para replicar la arquitectura y función de la piel.

Generación de organoides cutáneos planos con cabello derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido

Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas humanas libres de integración usando queratinocitos derivados de pelo. Este método con vectores episomales evita la integración genómica indeseable.

Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

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