Name: Dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprende la dechorionación de embriones de medaka y el trasplante de células para generar quimeras. Este método permite estudiar la autonomía celular de genes en desarrollo vertebrado.

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Este trabajo es apoyado por una beca de la MRC al señor FS.

1. Desarrollo de los embriones <ol><li> Cuando se establecen, los huevos están agrupados por filamentos de fijación en el corion. Para permitir que los embriones se desarrollan normalmente, es necesario separar los huevos. Maraña y cortar los filamentos apego mediante la celebración de los filamentos de unión con dos pinzas. </li><li> Vez deshecho el clúster, los huevos se separan de las heces y las algas y la transfieren a un medio de embriones frescos, con una densidad máxima de 40 huevos por placa de Petri de 6 cm. </li><li> Embriones medaka desarrollo algo más lento que el pez cebra a 27 ° C. El tiempo de incubación es diferente entre las dos especies; embriones medaka escotilla del corion en 7 días y de inmediato empezar a nadar y comer, mientras que embriones de pez cebra se incuban en 2 días, pero empezar a nadar y comer en 5-6 días. Desarrollo de medaka se clasifican de acuerdo a cuatro puesta en escena de Iwamatsu. </li><li> El desarrollo de los embriones medaka puede ser convenientemente ajustada a los planes experimentales mediante la selección de la temperatura adecuada. Desarrollo de los embriones medaka se puede detener a 4 ° C en el desarrollo temprano. Después de la etapa 24, cuando empieza a corazón latiendo, el desarrollo puede ser frenado con una temperatura mínima de 18 ° C. </li><li> El momento de aparición de órganos / tejidos es ligeramente diferente en medaka comparación con el pez cebra, es decir, en somitogenesis medaka se produce después del inicio del desarrollo del cerebro, mientras que en el pez cebra somitegenesis precede el desarrollo del cerebro. </li></ol> 2. Extracción del corion El corion de medaka se compone de dos capas de protección con una capa dura interna y una superficie exterior suave. Por lo tanto, un tratamiento de la proteasa en dos pasos empleando la enzima pronasa y la eclosión es necesario eliminar esta corion. Una vez dechorionated, los embriones deben mantenerse en 1X BSS. Semi-estériles condiciones mejorarán el éxito del cultivo de embriones dechorionated, especialmente a partir de períodos de observación son necesarios. Estos incluyen el uso de soluciones estériles (por ejemplo, esterilizados 1X BSS con antibióticos) y herramientas esterilizadas con etanol al 70% seguido de un enjuague con 1X BSS. Como dechorionated embriones medaka son más suaves y más frágiles que los embriones de pez cebra dechorionated, cuidado se debe tomar para asegurarse de que no entren en contacto con el aire o burbujas en la pipeta, ya que esto provocaría un colapso inmediato. Para asegurar un mínimo daño a los embriones, una pipeta de calor de boca ancha de vidrio pulido con una bomba de pipeta se debe utilizar para la transferencia de embriones y un lazo del pelo deben ser utilizados para orientar los embriones para la observación. No adherente placas de Petri se deben utilizar para evitar que los embriones se adhieran a las superficies. <ol><li> Antes de dechorionation se debe comprobar que los huevos han sido lo suficientemente separados y limpiados. </li><li> Dado que tanto pronasa y enzimas proteasas para incubar, deben mantenerse en hielo y minimizar la exposición de los embriones de estas enzimas. </li><li> La transferencia de los huevos de papel de lija (P2000 tamaño de grano, resistente al agua) colocado en la tapa de una caja de Petri de 9 cm. Retire el exceso de medio, sino garantizar un volumen suficiente como para evitar que restos de secado de los embriones. </li><li> Suavemente gire en torno a los embriones de 45 a 60 segundos para eliminar algunos de los pelos y la superficie externa ligeramente marcas en la superficie del corion (Figura 1). La transferencia de embriones back to original placa de Petri y examinar. Cuando los embriones que rueda sobre el papel de lija usar el dedo índice, aplicando una presión mínima y manteniendo los dedos en paralelo a la superficie de papel de lija. No ruede más de 5.7 embriones a la vez. Esta precaución reducirá al mínimo el riesgo de aplastamiento de los embriones por debajo de la otra. </li><li> Vuelva a colocar medio huevo en un plato con pronasa 20mg/ml y los embriones se incuban durante 40-60 minutos a 27 ° C. Asegúrese de que los embriones son suficientemente cubierto por una tapa pronasa y está presente en el plato. Pronasa no utilizada debe ser mantenido en hielo durante este paso para evitar la auto-digestión y se puede reutilizar hasta que la actividad se pierde (aproximadamente 1-2 semanas). </li><li> Recuperar para su reutilización y pronasa embriones lavar 5 veces en medio de embriones para eliminar los restos de pronasa, ya que esto inactivar la enzima para incubar añadió. </li><li> Quitar medio de embriones y embriones de la cubierta con la enzima de la eclosión, garantizando los embriones se siente como una monocapa en el plato. Si los huevos se sientan encima de uno al otro en el plato, los de abajo serán aplastados como el corion se disuelve. Mantenga las enzimas utilizadas para incubar en hielo. </li><li> Incubar los embriones a los 27 ° C y después de 15 minutos compruebe periódicamente el avance de la eclosión usando un microscopio estereoscópico. Se verá que una serie de cráter lunar-como los agujeros comienzan a aparecer en la capa interna del corion, que pronto se disuelve después de este salir de la suave capa externa del corion quitar fácilmente manually. Todo el proceso de incubación puede tomar 15-60 minutos. </li><li> Tan pronto como los embriones salen del corion, la transferencia de embriones a una placa de Petri que contiene 1X BSS. Asegúrese de no transferir la enzima para incubar a la BSS 1X tocando la punta de la pipeta sobre la superficie de la BSS permite que los embriones a rodar con cuidado. </li><li> Una vez que todos los embriones son transferidos de la enzima de la eclosión, hacer una transferencia definitiva a otro plato fresco de 1X BSS. Esto asegura que los embriones no están expuestos a los restos de la enzima de la eclosión, ya que podría dañar los embriones expuestos. Una vez en el plato final, los embriones siguen poseyendo la capa externa del corion puede ser liberado manualmente utilizando unas pinzas esterilizadas micro-bajo el microscopio estereoscópico. Si los embriones deben ser desarrollados dechorionation siguiente, a la penicilina / estreptomicina, debe añadirse a la SEV para prevenir el crecimiento bacteriano. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Comparación de los embriones durante el enrollado y desenrollado dechorionation. Observe cómo los embriones rodó en el panel B carecen de los pelos se ve en los embriones desenrolla en el panel A. 3. Montaje de embriones dechorionated Incorporación de agarosa es útil para períodos más largos de la imagen (por ejemplo, time-lapse de imágenes) de embriones vivos, así como de las observaciones detalladas de embriones fijo. Durante la gastrulación y organogénesis temprana (etapa 14 a la etapa 28), los embriones medaka exhiben ondas rítmicas de los movimientos de contracción a través de la peridermis, una capa de tejido que cubre tanto el desarrollo del embrión y la yema de huevo 5. Los embriones son tratados con 3,5 mm 1-heptanol de detener los movimientos de contracción 6. Para detener el movimiento de embriones después de la etapa 28 (64hpf), los embriones son anestesiados mediante la adición de gotas de tricaína mesilato (TMS) antes de la incrustación. TMS también se agrega a la agarosa (añadir una cantidad mínima, esta dosis debe ser optimizado, de aproximadamente una dilución de 1:25). <ol><li> Descongelar una cantidad pequeña de baja temperatura de gelificación del 3% de agarosa (en 1X BSS) por calentamiento a 37 º C y mantener a esta temperatura. </li><li> Los siguientes pasos deben llevarse a cabo con rapidez para garantizar que la agarosa no se solidifique antes de orientar el embrión. Mediante una transferencia de vidrio de boca ancha pipeta de agarosa fundida suficiente para llenar la tapa de la depresión de un tubo de Eppendorf. </li><li> La transferencia de un embrión dechorionated a la depresión tapa minimizar llevar más de BSS con el embrión. Inmediatamente la absorción de la agarosa y el embrión de la depresión de la tapa y la transferencia a una cámara de cultivo placa de Petri. Una placa de Petri de 3,5 cm con una ventana de cristal en la parte inferior se utiliza. Para obtener imágenes mediante un microscopio invertido, los embriones son orientados hacia abajo, el cuerpo y se coloca cerca de la cubierta de vidrio. Para obtener imágenes con un microscopio vertical, el espesor de agarosa se reduce al mínimo. </li><li> La transferencia de la placa de Petri de 3,5 cm de diámetro en una placa de Petri que contiene 14 cm de hielo y agua (lleno de agua a la profundidad de aproximadamente 1 / 3 del total de plato grande). Mientras mantiene la cámara firmemente en la parte inferior de la placa de Petri 14 cm, utilice un bucle de cabello suavemente para orientar el embrión como se desee en la agarosa fundida y retener el embrión hasta que la agarosa solidifica suavemente subiendo y bajando el plato más pequeño a su posición original en el agua helada. </li></ol> 4. El trasplante de células de embriones medaka El objetivo de este procedimiento es determinar si el gen de interés actúa en células de manera autónoma (dentro de una célula) o no de células de forma autónoma (entre las células). Las células del donante puede ser etiquetada con un tinte trazador como rodamina dextrano antes del trasplante (como se describe en 'La microinyección de embriones de medaka "el protocolo que acompaña Jove) o una cepa transgénica con la expresión de GFP se puede utilizar, permitiendo una evaluación del trasplante. Una combinación de ambas técnicas de etiquetado a menudo es útil para superar la auto-fluorescencia que se pueden encontrar. Para los estudios de lapso de tiempo después del trasplante, la expresión de GFP es particularmente útil. Use una pipeta de vidrio de boca ancha con una bomba de pipeta a través de este procedimiento y esterilizar todas las herramientas (incluyendo diapositivas) de antemano con EtOH al 70% seguido por un enjuague con agua estéril BSS 1X. Receptor embriones se desarrollan normalmente en torno a la 12 ª etapa, ya que permite la discriminación de los polos ventral y dorsal al llevar a cabo el trasplante. <ol><li> Comenzará dechorionating embriones 1,5 horas antes del trasplante y aparatos de inyección de configuración durante la incubación enzimática. </li><li> Colocar un portaobjetos de microscopio cavidad en un diámetro de 9 cm de placa de Petri. </li> Agregue una pequeña cantidad del 3% de metilcelulosa en el centro de la diapositiva cavidad con una punta de pipeta estériles y diluirse. <li> Metilcelulosa en seco durante unos 1-2 minutos. </li><li> Agregar 350μl de BSS estéril 1X para llenar la depresión de diapositivas. </li><li> La transferencia de un embrión donante y un máximo de cuatro embriones receptores a la diapositiva utilizando una pipeta de vidrio. </li><li> Embriones orientarse mediante un bucle de cabello por lo que el blastodermo del embrión es hacia arriba. Los embriones se pueden inclinó unos contra otros para aumentar la estabilidad adicional. </li><li> Inserte suavemente la micro-aguja en blastodermo donantes y poco a poco la absorción de 10-20 células. </li><li> Suavemente inserte la aguja en el área requerida de blastodermo receptores embrión y expulsar a las células lentamente. Gran cuidado se debe tomar cuando se inserta en las células del blastodermo beneficiarias a fin de no interrumpir las células de la yema de los límites del saco, ya que puede provocar la muerte del embrión. </li><li> Vierta esterilizados 1X BSS en la placa de Petri. Vierta cuidadosamente la BSS en el plato lo más cerca posible del lado de la antena como sea posible a fin de no interrumpir los embriones. Nunca vierta el BSS directamente sobre los embriones y añadir suficiente BSS de forma que la diapositiva y los embriones se encuentran inmersos. </li><li> Agregar 100μl de penicilina / estreptomicina al plato y la tapa. Con cuidado, llevar la cápsula a una incubadora de 27 ° C para permitir el desarrollo normal. </li><li> Los embriones pueden ser observadas periódicamente como se desee. Cuando se utiliza para llevar a cabo el trasplante de ganancia de función y / o experimentos fenotipo de rescate, algunos de los cambios morfológicos observados podrían deberse a los efectos del trasplante. Así, los trasplantes múltiples son necesarios. Después de 2-3 días, melanóforos debe estar presente en el saco vitelino, cabeza, ojos y tronco. Si está presente en los embriones trasplantados luego un éxito quimera ha sido probablemente producida (Figura 3). </li></ol> Si es necesario, el genotipo del embrión donante (s) por la transferencia de PCR de tubo (s) con 25μl de 20mg/ml proteinasa K. Se incuba a 55 ° C durante 4 horas seguido de 10 minutos a 94 ° C y llevar a cabo la PCR. 5. Los resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Posición Ejemplo de un embrión de agarosa embebidos. Anterior se muestra a la derecha y la vista es dorsal. Grupo B: las células endoteliales se puede ver a ambos lados del cuerpo del embrión y se etiquetan con las buenas prácticas agrarias impulsadas por el promotor fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imágenes de los embriones después del trasplante. La imagen A muestra un embrión de donante y el receptor inmediato post-trasplante. El embrión donante es de la derecha con un blastodermo completamente rojo (flecha). El embrión destinatario se muestra a la izquierda y se identifica fácilmente por la pequeña masa de rojo las células trasplantadas visible en el blastodermo (cabeza de flecha). La imagen B muestra dos embriones receptores de aproximadamente 7 horas post-trasplante (se incuba a 27 ° C). Observe que las células trasplantadas migraron desde el sitio del trasplante y ahora están dispersos por todo el blastodermo (flechas). La imagen C muestra un embrión receptor en st.29 (aproximadamente 74hpf). Tenga en cuenta la pigmentación en los ojos y la presencia de melanóforos en la región del tronco y el cerebro (flechas). Las células rodamina-etiquetados puede ser visto como la colonización muchas de las estructuras embrionarias que indica el éxito de la producción de una quimera.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
<li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li>
<li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Sci%22%5BJournal%5D)">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li>
<li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

En este video se muestra cómo dechorionate y llevar a cabo transplanataion celular en embriones medaka. Esta es una poderosa técnica para producir embriones quiméricos para el estudio de la función de genes / proteínas durante el desarrollo, así como para aclarar la autonomía de los genes / proteínas en cuestión. Medaka son un sistema de vertebrados modelo útil para esta técnica debido a los mapas de destino bien establecido y sus préstamos a la transparencia y en vivo imágenes en tiempo real. El trasplante puede ser combinado con microinyección (como se describe en &#39;La microinyección de embriones medaka &quot;el protocolo que acompaña Jove) para que el comportamiento de las células trasplantadas se pueden observar fácilmente.

<table><tbody><tr><td>Medio para embriones</td><td>Reactivo</td><td>Elaborado en el laboratorio</td><td>N/A</td><td>200 ml de solución stock 50X, 1 ml de azul de metileno al 1 % en H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 litros de agua RO (solución stock 50X: NaCl 14,7 g, KCl 0,6 g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4 g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0 g/1 litro de agua RO).</td></tr><tr><td>Pinzas de disección microscópica</td><td>Herramientas</td><td>55 INOX A.DUMONT&amp;FILS</td><td>N/A</td><td>Puntas finas y muy afiladas para la eliminación de la corión.</td></tr><tr><td>Papel de lija impermeable fino - grano p2000</td><td>Herramientas</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td>N/A</td><td>Grano muy fino para rodar y limpiar embriones con corión.</td></tr><tr><td>Metilcelulosa al 3 %</td><td>Reactivo</td><td>Sigma</td><td>M 0512</td><td>Alta viscosidad para mantener los embriones en su lugar durante el trasplante.</td></tr><tr><td>BSS 1X</td><td>Reactivo</td><td>Elaborado en el laboratorio</td><td>N/A</td><td>20XBSS: 130 g de NaCl, 8 g de KCl, 4 g de MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 4 g de CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O y 10 mg de rojo de fenol en 1 L de agua MilliQ y autoclavar; 500 mM de Hepes en agua MilliQ autoclavada. Añadir 25 ml de 20XBSS y 15 ml de Hepes 500 mM pH 7,0, completar hasta 500 ml y filtrar esterilizar antes de usar.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Se añade al BSS al incubar embriones descorionados.</td></tr><tr><td>Pronasa</td><td>Reactivo</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>Para descorionación.</td></tr><tr><td>Enzima de eclosión</td><td>Reactivo</td><td>Elaborado en el laboratorio</td><td>N/A</td><td>Para descorionación.</td></tr><tr><td>Mesilato de tricaina (TMS)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>400 mg de tricaina en 97,9 ml de agua destilada y 2,1 ml de Tris 1 M, ajustar el pH a 7; 4,2 ml de esta solución en 100 ml de agua de acuario limpia.</td></tr><tr><td>Agarosa con temperatura de gelificación ultra baja al 3 %</td><td>Reactivo</td><td>Sigma</td><td>A-2576</td><td>Tipo IX-A. Se utiliza durante la inclusión de embriones para su observación.</td></tr><tr><td>Cámara de cultivo en placa de Petri</td><td>Herramienta</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>11-004-008</td><td>Placa de vidrio Iwaki de 35 mm con ventana de 12 mm. Se utiliza durante la inclusión de embriones para su observación.</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Equipo</td><td>Narishige</td><td>N/A</td><td>Modelo MN151. Para la extracción e inserción de células durante el trasplante.</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio borosilicatado</td><td>Herramienta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10T</td><td>Para la fabricación de agujas de trasplante.</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Equipo</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-97</td><td>Para la fabricación de agujas de trasplante.</td></tr></tbody></table>

dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka es una pequeña puesta de huevos de peces de agua dulce que permite a los análisis genéticos y embriológicos y es uno de los tres organismos modelo vertebrado en el que todo el genoma impulsado fenotipo mutante pantallas se llevaron a cabo 1. Divergencia de superposición de funciones de los genes relacionados entre medaka y pez cebra permite la identificación de los fenotipos de la novela que no son identificables en una sola especie 2, por lo tanto medaka y pez cebra son complementarios para la disección genética de las funciones genoma de los vertebrados. Manipulación de embriones medaka, como dechorionation, los embriones de montaje de imagen y el trasplante de células, son procedimientos claves para trabajar en ambos medaka y pez cebra en un laboratorio. El trasplante de células examina la autonomía de las mutaciones de células medaka. Las quimeras son generados mediante el trasplante de células marcadas a partir de embriones de donantes en los embriones receptores sin etiquetar. Las células del donante se pueden transplantar a zonas específicas de los embriones receptores basados ​​en el destino mapas 3 de modo que los clones de las células trasplantadas se pueden integrar en el tejido de interés durante el desarrollo. Debido a que el corion duro y blando de embriones, la manipulación de embriones medaka es más complicado que en el pez cebra. En este vídeo, se muestran los procedimientos detallados para manipular embriones medaka.

Debido a que el corion duro y blando de embriones, la manipulación de embriones medaka es más complicado que en el pez cebra. Este video muestra paso a paso los procedimientos para la forma de manipular embriones medaka, incluyendo dechorionation, montaje de agarosa para la imagen y el trasplante de células para la producción de quimeras. Estos procedimientos son esenciales para el uso medaka y pez cebra en un laboratorio para sacar el máximo provecho de sus características complementarias para la disección genética de las funciones de genoma de los vertebrados.

Dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras

El medaka es un pequeño pez de agua dulce ovíparo que permite realizar análisis tanto genéticos como embriológicos y es uno de los tres organismos modelo vertebrados en ...

El objetivo general de este procedimiento es producir clones en un embrión con el fin de examinar la autonomía de un gen o proteína de interés. Esto se logra etiquetando embriones donadores con dextrano Rod Domine mediante microinyección en la etapa de una sola célula, como se muestra en el video complementario a este, microinyección de embriones Maka. El segundo paso del procedimiento consiste en desarrollar tanto los embriones donadores como los receptores hasta la etapa adecuada.El tercer paso del procedimiento consiste en recubrir los embriones del donador y del receptor. El paso final del procedimiento es trasplantar células de los embriones donadores marcados a los embriones receptores. En última instancia, se pueden obtener resultados analizando la distribución, proliferación y diferenciación de los clones de células trasplantadas mediante la detección de dichas células por su fluorescencia o por trazadores de linaje.Hola, soy Sean Brazinski del laboratorio del Dr. Makoto Fki en el Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidad de Bath. También soy del laboratorio Zeki. Hoy les mostraremos un procedimiento para el trasplante de células en embriones de peces oscuros.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar si un gen o mutación de interés tiene una función autónoma o no autónoma respecto a la célula. Comencemos. Al recubrir los huevos de maka, utilice soluciones y herramientas estériles para mejorar el éxito de la observación y el cultivo a largo plazo.Coloque un trozo de papel de lija impermeable de grano P 2000 en la tapa de una placa de Petri no adherente de nueve centímetros de diámetro. Utilice una pipeta de pasta con boca ancha y pulida al fuego para transferir hasta 10 huevos recién desagrupados, limpios y etiquetados desde un plato con medio de huevo hasta el papel de lija.Retire el medio en exceso, dejando solo lo suficiente en el recipiente para que los huevos no se sequen. Utilice la yema del dedo con guante para rodar suavemente 10 huevos a la vez sobre el papel de lija durante 45 a 60 segundos. Para eliminar los pelos de la superficie externa y rayar la superficie de Corian, aplique una presión mínima y mantenga la yema del dedo paralela al papel de lija.Transfiera los huevos al recipiente original con medio. Retire el medio, cubra los huevos con una solución de 20 miligramos por mililitro de prone. Tape el recipiente y incube a 27 grados Celsius durante 60 minutos.Asegúrese de colocar el plato en un ángulo para que los embriones queden suficientemente sumergidos en la enzima. Para minimizar la cantidad de enzima necesaria, utilice una pipeta de transferencia de plástico para recuperar la pronasa para su reutilización y colóquela en hielo. Lave los huevos cinco veces con medio de embrión para eliminar todos los rastros de pronasa y evitar que digiera la enzima de eclosión.Añada suficiente enzima de eclosión para cubrir los huevos lavados. Asegúrese de que los huevos permanezcan en una sola capa en el fondo del recipiente para evitar aplastamientos mientras el Corian se disuelve. Incube los huevos a 27 grados Celsius.Asegurándose de colocar el plato en un ángulo para que los embriones queden suficientemente sumergidos en la enzima. Con el fin de minimizar la cantidad de enzima necesaria, verifique el progreso bajo un microscopio estereoscópico de disección; aparecerán orificios similares en la capa interna del Corion antes de que esta se disuelva completamente. El proceso puede tardar hasta 60 minutos, dependiendo de la actividad de la enzima.Cuando se disuelve una pequeña parte del corion, aspire inmediatamente el huevo individual con una pipeta para evitar la digestión del embrión por la enzima de eclosión. Transfiera a un recipiente limpio con BSS al uno por ciento tocando suavemente la punta de la pipeta a un recipiente limpio con BSS al uno por ciento y permitiendo que el huevo ruede hacia afuera, para minimizar la transferencia de la enzima de eclosión. Utilice pinzas para eliminar el resto del corion una vez que todos los huevos hayan sido transferidos fuera de la enzima de eclosión.Realice una transferencia final a un nuevo recipiente con una vez BBSS. Añada antibióticos si los embriones van a llevarse a una etapa posterior del desarrollo embrionario. Tras la decoración para este procedimiento, comience la etapa de desenmascarado en embriones de estadio 12, 1,5 horas antes del trasplante. Utilice la punta de una pipeta para añadir una pequeña cantidad de metilcelulosa al 3 % al centro de un microscopio de cavidad.Deslice en una placa de Petri de nueve centímetros. Extienda el líquido finamente sobre la superficie de la depresión. Seque la metilcelulosa durante dos minutos.Llene la depresión de la placa con 350 microlitros de BSS estéril al uno por ciento bajo un microscopio estereoscópico. Utilice una pipeta de vidrio con boca ancha y pulida al fuego para transferir un embrión donador y hasta cuatro embriones receptores a la placa. Use un lazo de cabello para orientar los embriones de modo que el derma blástico quede orientado hacia arriba.Incline los embriones uno contra otro para mayor estabilidad, si es necesario. Inserte suavemente una micropipeta en el blástula.derm del donante. Aspire lentamente de 10 a 20 células.Ahora inserte suavemente la aguja en el área correspondiente del embrión receptor y expulse lentamente las células donantes. No perturbe el límite del saco corioalantoideo. Llene cuidadosamente la placa de Petri con aproximadamente 30 mililitros de BSS estéril al uno por ciento para sumergir los embriones y soltarlos del metilcelulosa.Vierta por el costado del recipiente para no perturbar los embriones. Añada 100 microlitros de penicilina-estreptomicina al recipiente para obtener una concentración aproximada de 0,3 %. Tape el recipiente. Observe los embriones periódicamente según sea necesario.Para estudios de microscopía prolongados, como el registro temporal y observaciones detalladas, incruste embriones vivos recubiertos en aros y anestesie los embriones vivos para evitar movimientos, añadiendo un anestésico adecuado al medio que contiene los embriones. Derrita aproximadamente un mililitro de agarosa al 3 % con punto de fusión bajo en BSS al uno por ciento y manténgalo a 37 grados Celsius. Si es necesario, añada una cantidad adecuada de anestésico al aros para prevenir espasmos. Trabajando rápidamente para evitar la solidificación, utilice una pipeta Pasteur de boca ancha para llenar la cavidad de un tubo cónico de microcentrífuga con aros.Utilice una pipeta de boca ancha para trasladar un embrión recubierto y anestesiado al aros en la tapa. Transfiera la menor cantidad posible de medio junto con el embrión. Actualice inmediatamente el aros y el embrión, y colóquelos en una placa de Petri de fondo de vidrio de 3,5 centímetros.Transfiera el recipiente a un recipiente de 14 centímetros lleno hasta un tercio con una mezcla de hielo y agua. Sostenga firmemente el recipiente más pequeño contra el fondo del recipiente más grande bajo un microscopio estereoscópico de disección. Utilice un lazo de cabello para orientar rápidamente el embrión como se desee.Mantenga el embrión inmóvil hasta que el agro se solidifique. Ahora se puede obtener una imagen del embrión. La imagen A muestra un embrión donante y uno receptor inmediatamente después del trasplante.El embrión donante se muestra a la derecha con un derma de yeso completamente etiquetado en rojo. El embrión receptor se muestra a la izquierda y se identifica fácilmente por la pequeña masa de células trasplantadas de color rojo visible en la imagen del derma blástico. La imagen B muestra dos embriones receptores aproximadamente siete horas después del trasplante. Obsérvese que las células trasplantadas han migrado desde el sitio de trasplante y ahora están dispersas a través del blastodermo.La imagen dérmica C muestra un embrión receptor en la etapa 29. Obsérvese la pigmentación en el ojo y la presencia de mefor en la región del tronco y del cerebro. Pueden verse las células marcadas en el dominio de la varilla colonizando muchas de las estructuras embrionarias, lo que indica la producción exitosa de una quimera.Acabamos de mostrarle cómo incubar embriones de pez cebra y realizar un trasplante celular en una etapa embrionaria temprana. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trasplantar sus células donantes en el área correcta del blastodermo del receptor. Esto permitirá que sus células donantes se diferencien en el tipo celular adecuado.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Biología

Una guía paso a paso para la generación de embriones de pez cebra quimérico dirigido por el trasplante en la fase de blástula o gástrula.

La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

Pez cebra trasplante de células permite la combinación de la genética y la embriología para generar quimeras tejido específico. Este vídeo demuestra gástrula etapas trasplantes de células que han permitido a nuestro laboratorio para investigar el papel de las poblaciones de astro y señales específicas de orientación durante la formación de la comisura del cerebro anterior.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Demostramos un protocolo para generar embriones quiméricos de pez cebra para vivir el comportamiento de imagen celular durante la embriogénesis.

El trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresa Blastómeros de imágenes en vivo del desarrollo de la retina y el cerebro en embriones de pez cebra quiméricos

Medaka y pez cebra son complementarios para la disección genética de las funciones de genoma de los vertebrados. Este protocolo pone de relieve los puntos clave para el éxito de microinyección en embriones medaka, una técnica importante para el análisis embriológicos y genéticos con medaka y pez cebra en un laboratorio.

Microinyección de embriones de medaka para su uso como un organismo modelo genético

Un enfoque para el análisis de la migración y el destino final de las aves las células de la cresta neural en la codorniz, pollo embriones quiméricos se describe. Este método es una técnica simple y directa para el seguimiento de las células de la cresta neural durante la migración y la diferenciación que son difíciles de distinguir dentro de un embrión de pollo no manipulado.

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Los pequeños peces de laboratorio se han convertido en modelos populares para la investigación ósea sobre los mecanismos subyacentes a los trastornos óseos humanos y para el cribado de fármacos moduladores óseos. En este reporte, describimos un protocolo para evaluar el efecto del alendronato sobre las células óseas en larvas de medaka con lesiones osteoporóticas.

El tratamiento de drogas y<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de osteoblasto-osteoclastos Interacciones en un modelo Medaka pescado osteoporosis

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Aquí presentamos un protocolo para aumentar la producción de quimeras sin el uso de nuevos equipos. Un cambio de orientación simple del embrión para la inyección puede aumentar el número de embriones producidos y potencialmente reducir la línea de tiempo a la transmisión de la línea germinal.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

Este objetivo de este protocolo es producir axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides derivadas del tejido donante mutado Cas9 utilizando técnicas de injerto de tejido embrionario.

Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario

Las manipulaciones embriológicas como la extirpación y el trasplante de células son herramientas importantes para estudiar el desarrollo temprano. Este protocolo describe un dispositivo de trasplante simple y efectivo para realizar estas manipulaciones en embriones de pez cebra.

Un dispositivo de trasplante simple y efectivo para embriones de pez cebra

Aprende la dechorionación de embriones de medaka y el trasplante de células para generar quimeras. Este método permite estudiar la autonomía celular de genes en desarrollo vertebrado.

Dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras

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