Dechorionation de embriones de medaka y trasplante de células para la generación de quimeras

Debido a que el corion duro y blando de embriones, la manipulación de embriones medaka es más complicado que en el pez cebra. Este video muestra paso a paso los procedimientos para la forma de manipular embriones medaka, incluyendo dechorionation, montaje de agarosa para la imagen y el trasplante de células para la producción de quimeras. Estos procedimientos son esenciales para el uso medaka y pez cebra en un laboratorio para sacar el máximo provecho de sus características complementarias para la disección genética de las funciones de genoma de los vertebrados.

El objetivo general de este procedimiento es producir clones en un embrión con el propósito de examinar la autonomía de un gen o proteína de interés. Esto se logra mediante el marcaje de embriones de donantes con Rod Domine dextrano mediante microinyección en la etapa de una célula, como se muestra en el complemento de este video, microinyección de embriones Maka. El segundo paso del procedimiento es desarrollar tanto los embriones de la donante como de la receptora hasta la etapa correcta.

El tercer paso del procedimiento es recubrir tanto los embriones de la donante como los de la receptora. El paso final del procedimiento es trasplantar células de los embriones del donante etiquetados a los embriones del receptor. En última instancia, los resultados se pueden obtener analizando la distribución, proliferación y diferenciación de clones, de células trasplantadas mediante la detección de células trasplantadas por sus trazadores de fluorescencia o linaje.

Hola, soy Sean Brazinski del laboratorio del Dr. Makoto Fki en el Departamento de Biología y Bioquímica de la Universidad de Bath. Yo también soy del laboratorio Zeki. Hoy te mostraremos un procedimiento para el trasplante de células en embriones de peces oscuros.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar con un gen o mutación de interés, que tenga una función autónoma celular o no celular. Así que comencemos. Al recubrir los huevos de maka, utilice soluciones y herramientas estériles para mejorar el éxito de la observación y el cultivo a largo plazo.

Coloque un trozo de papel de lija impermeable de grano P 2000 en la tapa de una placa de Petri no adherente de nueve centímetros. Use una boca ancha para disparar una pipeta de pasta pulida para transferir hasta 10 huevos recién agrupados, limpios y etiquetados de un plato de huevo. Medio a la lija.

Retire el exceso de medio, dejando lo suficiente en el plato para evitar que los huevos se sequen. Use la yema de un dedo enguantado para enrollar suavemente 10 huevos a la vez sobre el papel de lija durante 45 a 60 segundos. Para eliminar los pelos de la superficie exterior y marcar la superficie de Corian, aplique una presión mínima y mantenga la yema del dedo paralela al papel de lija.

Transfiera los huevos al plato original de medio ambiente. Retire el medio, cubra los huevos con una solución de 20 miligramos por mililitro de prono. Tape el plato e incube a 27 grados centígrados durante 60 minutos.

Asegurándose de colocar el plato en ángulo para que los embriones estén lo suficientemente inmersos en la enzima. Con el fin de minimizar la enzima requerida, use una pipeta de transferencia de plástico para recuperar la pronasa para su reutilización y colóquela en hielo. Lavar los huevos cinco veces por embrión en medio para eliminar todo rastro de propensión y evitar que digiera la enzima de incubación.

Agregue suficiente enzima para incubar para cubrir los huevos lavados. Asegúrese de que los huevos permanezcan en una sola capa en el fondo del plato para evitar que se aplasten a medida que el Corian se disuelve. Incubar los huevos a 27 grados centígrados.

Asegurándose de colocar el plato en ángulo para que los embriones estén lo suficientemente inmersos en la enzima. Con el fin de minimizar el progreso de la prueba enzimática requerida bajo un microscopio estereoscópico de disección, aparecerán agujeros similares en la capa interna del Corian antes de que se disuelva por completo. El proceso puede tardar hasta 60 minutos dependiendo de la actividad de la enzima.

Cuando se disuelve una pequeña parte del Corian, succionar inmediatamente el huevo individual con una pipeta para evitar la digestión del embrión por la enzima de incubación. Transfiera a un plato limpio de una vez BSS tocando suavemente la punta de la pipeta a un plato limpio de una vez BSS y dejando que el huevo se extienda para minimizar la transferencia de la enzima de incubación. Use fórceps para extraer el resto del Corian cuando todos los huevos se hayan transferido de la enzima para incubar.

Realice una transferencia final a un nuevo plato de una vez BBSS. Agregue antibióticos si los embriones van a ser llevados a una etapa posterior de desarrollo embrionario Después de la decoración para este procedimiento, comience a recubrir los embriones de la etapa 12 1,5 horas antes del trasplante. Utilice una punta de pipeta para añadir una pequeña cantidad de metilcelulosa al 3 % en el centro de un microscopio de cavidades.

Deslízalo en una placa de Petri de nueve centímetros. Extienda el líquido finamente sobre la superficie de la depresión. Secar la metilcelulosa durante dos minutos.

Llene la depresión del portaobjetos con 350 microlitros de BSS estéril una vez bajo un microscopio de disección. Utilice una pipeta de vidrio pulido al fuego de boca ancha para transferir un donante y hasta cuatro embriones receptores al portaobjetos. Use un lazo de cabello para orientar los embriones de modo que la dermis del blaster quede hacia arriba.

Apoye los embriones uno contra el otro para estabilizarlos si es necesario. Inserte suavemente una microaguja en el blaster del donante. Derm. Absorbe lentamente de 10 a 20 células.

Ahora inserte suavemente la aguja en el área relevante del embrión receptor, blaster derm expulsa lentamente las células donantes. No moleste el límite del saco del violonchelo. Llene cuidadosamente la placa de Petri con aproximadamente 30 mililitros de BSS estéril una vez para sumergir los embriones y aflojar los embriones de la metilcelulosa.

Vierta contra el costado del plato para no interrumpir los embriones. Agregue 100 microlitros de penicilina estreptomicina en el plato para una concentración aproximada de 0.3%Cubra el plato. Observe los embriones periódicamente según sea necesario.

Para estudios de imagen más largos, como lapso de tiempo y observaciones detalladas, incruste embriones vivos recubiertos en aros, anestesia los embriones vivos para evitar el movimiento agregando un anestésico apropiado para la etapa al medio que contiene los embriones se derrite aproximadamente un mililitro de 3%El punto de fusión bajo surgió en una vez BSS y manténgalo a 37 grados Celsius. Si es necesario, agregue una cantidad adecuada de anestésico a los aros para evitar espasmos trabajando rápidamente para evitar la solidificación, use una pipeta de pasta de boca ancha para llenar la tapa. Depresión de un tubo de micro centrífuga con aros.

Utilice una pipeta de boca ancha para mover un embrión recubierto y anestesiado hacia el interior del capuchón. Transfiera la menor cantidad de medio posible con el embrión. Actualice inmediatamente los aros y el embrión y colóquelos en una placa de Petri con fondo de vidrio de 3,5 centímetros.

Transfiera el plato a un plato de 14 centímetros lleno un tercio del camino con una mezcla de hielo y agua. Sostenga el plato más pequeño firmemente contra el fondo del plato más grande bajo un microscopio estereoscópico de disección. Use un lazo para el cabello para orientar rápidamente el embrión como se desee.

Mantenga el embrión quieto hasta que el agro se solidifique. Ahora se puede obtener una imagen del embrión. La imagen A muestra un embrión donante y un embrión receptor inmediatamente después del trasplante.

El embrión donado se muestra a la derecha con una derm de yeso completamente marcada de rojo. El embrión receptor se muestra a la izquierda y se identifica fácilmente por la pequeña masa de glóbulos rojos trasplantados visible en la dermis del blaster: la imagen B muestra dos embriones receptores aproximadamente siete horas después del trasplante. Observe que las células trasplantadas han migrado desde el sitio del trasplante y ahora están dispersas por todo el blaster.

La imagen dérmica C muestra el embrión de la receptora en la etapa 29. Nótese la pigmentación en el ojo y la presencia de mefor en la región del tronco y el cerebro. Se puede ver que las células marcadas con bastón dominé están colonizando muchas de las estructuras embrionarias, lo que indica la producción exitosa de una quimera.

Acabamos de mostrarte cómo comer embriones de pez meca y llevar a cabo el trasplante de células en una etapa embrionaria temprana. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trasplantar las células del donante en el área correcta del receptor blasteado. Esto permitirá que las células de su donante se diferencien en el tipo de célula correcto.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.