Name: Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprende a generar células iPS libres de integración a partir de sangre periférica usando plásmidos episomales e inhibidores de HDAC. Este método eficiente minimiza riesgos de mutagénesis para aplicaciones clínicas.

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Los autores desean agradecer a las siguientes subvenciones del NIH para el apoyo a esta investigación: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS), y K12HL0806406 (SKS); y la Fundación JP McCarthy (AR).

Consentimiento informado por escrito, según lo aprobado por las juntas de revisión institucional del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson y los niños &quot;s Hospital of Philadelphia, se obtuvo de los pacientes antes de la recogida de muestras de sangre periférica. Se observaron Todas las directrices institucionales. Todos los experimentos con animales, incluyendo la generación de MEF y formación de teratomas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional. 1. Ficoll separación de PBMC y Expansión de Eritroblastos - Día 0 <ol><li> Diluir la sangre periférica 1: 1 con tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS). En un tubo de poliestireno de fondo redondo de 15 ml, la capa cuidadosamente 7 ml de sangre diluida sobre 3 ml de temperatura ambiente Ficoll-Hypaque. </li><li> Centrifugar la muestra a 400 xg durante 30 min. </li><li> Las PBMCs se han asentado a la interfaz entre el plasma y el Ficoll-Hypaque, visto como una capa blanca turbia. Con una pipeta de transferencia estéril, recoger el PBMCs en uno 15 ml tubo cónico. Llevar el volumen a 10 ml usando DPBS. </li><li> El uso de un hemocitómetro, contar las CMSP. </li><li> Pipetear 2 × 10 6 PBMCs en un tubo cónico de 15 ml separado y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Centrifugar las células restantes y congelar a una concentración de 2 × 10 6 PBMC / ml en suero bovino fetal al 90% (FBS) sulfóxido / 10% de dimetilo (DMSO). </li><li> Preparar Media Expansión: medio libre de suero QBSF-60 (proteger de la luz) + penicilina / estreptomicina (1%) + ácido ascórbico (50 ng / ml) + factor de células madre (SCF, 50 ng / ml) + interleucina 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + eritropoyetina (EPO, 2 U / ml) + insulina como factor de crecimiento 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + dexametasona (1 M; protegerlo de la luz; descongelar una alícuota fresca cada medio cambiar). </li><li> Resuspender 2 × 10 6 PBMC en 2 ml de medio de expansión recién hecho y el lugar en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos y se incuban en un incubador humidificado 37 ° con una atmósfera de 5% O 2, 5% de CO 2, y 90% de N 2. </li><li> En el día 3 y el día 6, sustituir los medios de comunicación. <ol><li> Recoger las células y lavar el pocillo con 2 ml de QBSF-60 para recoger las células restantes. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 300 xg durante 5 min y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de nuevo medio de expansión y devolverlos a la misma placa de 12 pocillos. </li></ol></li></ol> 2. Las células reprogramación por Nucleofection - Día 9 <ol><li> Pipetear los plásmidos de reprogramación en un tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml (Tabla 1). </li><li> Mezclar la solución con nucleofection Suplemento (suministrado por el fabricante) y pipeta en un tubo Eppendorf de 1,5 ml estéril. </li><li> Pipetear 2 ml de Media Expansión en un pocillo de una placa de 12 y colocarla en un humidificado 37 ° C incubadora (5% O 2, 5% de CO 2, y 90% N 2), para el equilibrado antes de añadir las células. </li><li> Recoger elcélulas cultivadas y lavar el pocillo con 2 ml de QBSF-60 para recoger las células restantes. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. </li><li> Lavar las células mediante resuspensión en 5 ml de DPBS y centrifugando a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 100 l de solución de nucleofection + Suplemento, teniendo cuidado de evitar la generación de burbujas. </li><li> Pipetear la suspensión de células en el tubo que contiene los plásmidos reprogramación, pipeta arriba y hacia abajo una vez, y pipetear la muestra en la parte inferior de la cubeta nucleofection. </li><li> Colocar la cubeta en la máquina nucleofection y ejecutar el Programa T-019. </li><li> Transferencia de 100 l de la expansión precalentado mediano (de la placa equilibrante en el Paso 2.3) en la cubeta nucleofection. </li><li> Inmediatamente recoger toda la muestra y el depósito en el pozo de pre-calentado medio de expansión. Evite recoger el blanco, flotando los restos celulares muertos. </li&gt; <li> Colocar la placa en un humidificado 37 ° C incubadora (5% O 2, 5% de CO 2, y 90% N 2) para el crecimiento. </li></ol> 3. Revestimiento células alimentadoras - Día 10 o 11 <ol><li> El día 10, las células alimentadoras placa. <ol><li> Escudo uno de 6 pocillos placa de cultivo de tejidos con gelatina. <ol><li> Pipetear 1 m de 0,1% de gelatina en solución salina tamponada de Hank (HBSS) en cada pocillo de la placa. </li><li> Colocar la placa en un humidificado incubadora a 37ºC durante al menos 5 min. </li><li> Inmediatamente antes de su uso, aspirar la solución de gelatina de la placa. </li></ol></li><li> Descongelar un vial de 2 × 10 6 fibroblastos embrionarios de ratón irradiados a 3000 cGy en 10 ml de precalentado MEF Medios (Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + penicilina / estreptomicina (1%)). </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 12 ml de MEF Medios y pipeta de 2 mlnto cada pocillo de la placa de 6 así revestida con gelatina. Colocar la placa en un humidificado 37 ° C incubadora (5% O 2, 5% de CO 2, y 90% N 2) hasta el día 12. </li></ol></li></ol> 4. Revestimiento células en células alimentadoras y Cambio Medio - Día 12 <ol><li> Recoger las células nucleofected en uno 15 ml tubo cónico y recoger cualquier resto de las células por lavado de las bien con 2 ml de QBSF-60. Centrifugar la muestra a 300 xg durante 5 min. </li><li> Preparar reprogramación Medio: Iscove medio de Dulbecco modificado (IMDM) + FBS (10%) + no animal L-glutamina (1 mM) + no esenciales aminoácidos (NEAA, 1%) + penicilina / estreptomicina (1%) + β mercaptoetanol (0,1 mM) + factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, añaden fresco en la alimentación, 10 ng / ml) + ácido ascórbico (añadido en fresco de alimentación, 50 g / ml). </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 12 ml de Medio de reprogramación. De pipeta 2 ml por pocillo de la suspensión celular enla placa de 6 pocillos de células de alimentación (como se ha preparado en la Sección 3). Centrifugar la placa a 50 xg durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Colocar la placa en un humidificado 37 ° C incubadora (5% O 2, 5% de CO 2, y 90% N 2) para el crecimiento. Cambie la Reprogramación Medio cada dos días hasta que las colonias IPSC comienzan a aparecer (1-2 semanas). </li><li> Preparar hESC Medio: DMEM / F12 1: 1 + Knockout suero sustitución (20%) + penicilina / estreptomicina (1%) + NEAA (1%) + no animal L-glutamina (1 mM) + piruvato de sodio (1%) + bicarbonato de sodio (0,12%) + β-mercaptoetanol (0,1 mM) + bFGF (añadidos fresco en la alimentación, 10 ng / ml) </li><li> Prepare los inhibidores de HDAC: butirato sódico (añadido a la alimentación fresca, 100 M), ácido suberanilohydroxamic (SAHA, añadió fresca en la alimentación, 200 nM). Una vez que aparecen colonias IPSC, comienzan a alimentarse de las células con inhibidores de células madre Mediana + HDAC, el cambio de medio cada día. NOTA: butirato de sodio es una pequeña molécula que se adsorbe a tubos de plástico, tor lo tanto guárdelo en un tubo de vidrio de borosilicato a 4 ° C. </li></ol> 5. Aislamiento de clones IPSC <ol><li> Una vez que las colonias IPSC son lo suficientemente grandes como para ser aislado (20-25 células), ellos recoger con una pipeta P20. </li><li> Preparar los inhibidores de HDAC: butirato de sodio (añadido en fresco de alimentación, 100 mM), SAHA (añadido en fresco de alimentación, 200 nM) </li><li> Coloque las colonias aisladas en iMEFs en platos individuales de 35 mm que contienen inhibidores de la HDAC hESC Medio + + La clonación y recuperación del Suplemento. </li><li> El día después de recoger las colonias, cambie el medio a los inhibidores de células madre Mediana + HDAC. </li><li> Cambie el medio todos los días hasta que las colonias IPSC están listos para los pases. </li><li> Eliminar los inhibidores de HDAC del medio de colonias una vez estabilizan en el paso 2-3. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Para exitosa generación de IPSC cuando se utiliza este protocolo, hay varias advertencias importantes que deben ser considerados. Durante la fase de expansión eritroblasto, el programa de cambio de los medios de comunicación debe ser estrictamente seguida, como desviaciones pueden conducir a la estimulación ineficiente de la población de células progenitoras diana y una menor eficiencia de la generación de IPSC. Es importante hacer nuevo medio de expansión con dexametasona fresca con cada cambio de los medios de comunic...

iPSCs se derivan de tejidos somáticos a través de la expresión ectópica de un conjunto mínimo de genes pluripotencia. Esta técnica se demostró inicialmente por la transducción retroviral de los fibroblastos humanos con Oct4, Sox2, Klf4, y cMYC, que son altamente expresado en el estado pluripotente 1. Estos transitoriamente expresadas &quot;factores de reprogramación&quot; alteran el perfil de expresión génica y epigenética paisaje de la célula diana análoga a las células madre de embriones humanos 2. Una vez creado, iPSCs potencialmente puede diferenciarse en cualquier tipo de tejido para análisis adicionales. Por lo tanto, mantienen la promesa para el uso en la medicina regenerativa, el modelado de la enfermedad, y aplicaciones de terapia génica. Sin embargo, lo que altera el genoma con virus que se integran tiene el potencial de alterar la expresión del gen endógeno, la influencia fenotipo celular, y en última instancia sesgan los resultados científicos. Además, integraciones virales aleatorias pueden conducir a celular e deletéreofectos, incluyendo la posibilidad de la transformación maligna 3 o re-expresión de los transgenes oncogénicos 4. Aplicaciones clínicas futuras requerirán-integración no generación de IPSC. Episomas, que son moléculas de ADN circular cromosómicas adicionales, ofrecen una estrategia para generar, CMPI-integración libre de costo efectivo 5. La combinación de vectores episomales que se muestran en la Tabla 1 expresa la reprogramación factores de Oct4, Sox2, Klf4, MYCL, y LIN28A. El plásmido pCXLE_hOCT3 / 4-F-shp53 también contiene una p53 shRNA para la supresión temporal de TP53 para mejorar la reprogramación celular 6. El vector deficiente pCXWB-EBNA1 replicación promueve la amplificación de factores de reprogramación y el aumento de la eficiencia de reprogramación proporcionando un aumento transitorio en la expresión de EBNA1 7. El plásmido pCXLE_EGFP se puede añadir a la mezcla de nucleofection con el propósito de determining la eficacia de transfección o para aplicaciones de células de clasificación. Con la excepción de p CXWB-EBNA1, los plásmidos episomales utilizados en este protocolo contienen el origen del virus de Epstein-Barr de la replicación viral y el gen EBNA1, que median la replicación y la partición del episoma durante la división de la célula huésped 8. Los episomas se pierden espontáneamente con la expansión sucesiva IPSC 7. Subclonación y caracterización de iPSCs con pérdida vector episomal, que se puede inferir a partir de la pérdida de la expresión de eGFP, pueden conducir a la integración completamente iPSCs gratuitas para futuras aplicaciones clínicas. Inherente al proceso de generación de IPSC es la supresión de genes específicos de linaje y la reactivación de los genes de pluripotencia asociada. Regulación de la expresión del gen se produce en múltiples niveles dentro del núcleo, incluyendo modificaciones en el ADN y la cromatina para permitir que factores de transcripción, elementos de ADN reguladores, y el acceso de la ARN polimerasa para orientargenes. Remodelación del paisaje epigenético de la cromatina a través de modificaciones globales es un componente clave para la re-expresión del programa genético pluripotencia. Una modificación de la cromatina específica que es importante en la regulación de la expresión génica es la acetilación de las histonas en particular los residuos de lisina, que permite el acceso a genes diana a través de disminución de la tensión de la bobina de ADN-histona. Inhibidores de HDAC son pequeñas moléculas que se han demostrado para mejorar IPSC reprogramación y células madre auto-renovación 9,10, probablemente debido al apoyo del estado acetilado 11. El protocolo se describe a continuación, adaptada de una publicación anterior utilizando la integración de los lentivirus 12, proporciona un método paso a paso para la generación de IPSC optimizado a partir de sangre periférica utilizando episomas y los inhibidores de HDAC. Las concentraciones de inhibidor de HDAC utilizados aquí son la mitad de los descritos por Ware, y otros han llevado habitualmente a un aumento de 2 veces en colonias IPSC totalmente reprogramadas más estándar. 9, yprotocolos de reprogramación episomales sin inhibidores de HDAC. Este nivel de reprogramación es a la par con la eficiencia que observamos con métodos de lentivirus. El uso de este protocolo, se han generado de manera eficiente IPSC de individuos como viejos como 87 años de edad.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>Almacene a 4 °C. Caliente a temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Tienda en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Tienda en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>Tienda en -20 &deg; C hasta que sea necesario. Descongelar, alícuota, almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich 154938</td><td></td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>QBSF-60 medio sin suero</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>Almacene en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies 15140122</td><td></td><td>Tienda en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Kit de nucleofactor de línea celular V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Tienda a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Solución de gelatina al 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>Almacenar a 4 & deg; C, licuar en 37 &deg; C Baño de agua antes de usar.</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>Tienda en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Tienda en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Tienda en 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Alícuota, congelación a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>aminoácidos no esenciales (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Tienda en 4 & deg; C, lejos de la luz.</td></tr><tr><td>DMEM/Ham's F12, 1:1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>Tienda a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Alícuota, congelar a -20 °C.</td></tr><tr><td>piruvato de sodio, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio, 7.5%</td><td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>Tienda a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>Hacer un caldo de 10 mg/ml en DPBS, alícuota, congelar a -20 &deg;C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>butirato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>Fabrica 2000x stock (400 mM) en DPBS, alícuota, congelación a -20 &deg;C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Clonación de células hES & Suplemento de Recuperación</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>Tienda en -20 &deg; C hasta que sea necesario. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Matrigel BD calificado por ESC</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td><td>Descongele durante la noche en hielo a 4 & deg; C, alícuota en tubos preenfriados utilizando puntas de pipeta preenfriadas. Almacenar a -20 &deg; C hasta que sea necesario. Descongele a las 4 & grados; C, úselo inmediatamente.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Alícuota, congelación a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>ácido ascórbico, en polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>Prepare un caldo de 5 mg/ml en DPBS, filtro estéril, almacene a 4 & C.</td></tr><tr><td>factor de células madre humanas recombinante (SCF)</td><td>R & D Sistemas</td><td>255-SC-010</td><td>Marca 100 &mu; g/m de existencias en SFEM, alícuota, congelación a -20 &deg;C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>interleucina humana recombinante 3 (IL-3)</td><td>R & D Sistemas</td><td>203-IL-010</td><td>Marca 100 &mu; g/ml de stock en SFEM, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>eritropoyetina (EPO)</td><td>R & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>Hacer 1000 U/ml de caldo en SFEM, alícuota, congelar a -20 &deg;C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>factor de crecimiento similar a la insulina humana recombinante 1 (IGF-1)</td><td>R & D Sistemas</td><td>291-G1-200</td><td>Marca 100 &mu; g/ml de stock en SFEM, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Hacer 1000x stock (100 mM) en DPBS.</td></tr><tr><td>dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Hacer 50x stock (50 &mu; M) en DPBS, filtro estéril, almacenar a 4 & °C.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Fabrica 2.000 veces el stock (400 mM) en DPBS, alícuota, congela a -20 &deg;C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>tubo Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo tisue de 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas desechables de 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas desechables de 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas desechables de 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l puntas de pipeta, puntas de barrera</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>vidrio pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>ayuda para pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

eficiente ips generación celular de sangre usando episomas y hdac inhibidores

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Este manuscrito ilustra un protocolo para la creación de células de manera eficiente a la integración libre inducidos por el hombre madre pluripotentes (iPSCs) a partir de sangre periférica utilizando plásmidos episomales e inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC). Las ventajas de este enfoque incluyen: (1) el uso de una cantidad mínima de sangre periférica como un material de origen; (2) nonintegrating vectores de reprogramación; (3) un método rentable para la generación de vectores iPSCs libres; (4) una sola transfección; y (5) el uso de pequeñas moléculas para facilitar la reprogramación epigenética. Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron a partir de muestras de flebotomía de rutina y después se cultivaron en factores de crecimiento definidas para producir una población de células progenitoras de eritrocitos altamente proliferativa que es notablemente susceptibles de reprogramación. Nonintegrating, plásmidos episomales no transmisibles que expresan Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, y un corto horquilla (sh) ARN p53 son introduced en los eritroblastos derivados través de un único nucleofection. La cotransfección de un episoma que expresa la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) permite una fácil identificación de las células transfectadas. Un plásmido de replicación deficiente separada expresar Epstein-Barr antígeno nuclear 1 (EBNA1) también se añade a la mezcla de reacción para aumentar la expresión de proteínas episomales. Las células transfectadas se sembraron sobre una capa de fibroblastos de embriones de ratón irradiados (iMEFs) para continuar la reprogramación. Tan pronto como colonias IPSC-como aparecen en aproximadamente doce días después de nucleofection, se añaden inhibidores de HDAC al medio para facilitar la remodelación epigenética. Hemos encontrado que la inclusión de los inhibidores de HDAC aumenta habitualmente la generación de colonias IPSC totalmente reprogramadas por 2 veces. Una vez que las colonias IPSC presentan la morfología típica de células madre embrionarias humanas (CMEH), se transfieren suavemente para placas de cultivo individuales recubiertos de tejido IMEF para el continuo crecimiento y expansión.

Tres días después de nucleofection y de las placas, las células nucleofected en iMEFs, la eficiencia de nucleofection exitoso debe ser estimado por microscopía de fluorescencia para eGFP. La Figura 1 muestra un experimento de nucleofection típico con aproximadamente 5-10% de la población total de células que expresan eGFP. Colonias reprogramado IPSC comenzarán a aparecer aproximadamente dos semanas después de nucleofection. Las colonias son generalmente circular con bordes b...

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante una estrategia basada en la reprogramación episoma y los inhibidores de la histona deacetilasa.

Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

El objetivo general del siguiente experimento es generar células madre pluripotentes inducidas libres de integración a partir de una pequeña cantidad de sangre periférica. Esto se logra mediante el cultivo de células mononucleares aisladas de sangre periférica en factores de crecimiento definidos para producir una población progenitora de eritrocitos que es muy sensible a la reprogramación. Como segundo paso, los plásmidos episomales no integradores portadores de genes de reprogramación se introducen en los eritroblastos por afección del núcleo para iniciar el proceso de reprogramación.A continuación, las células afectadas por el núcleo se colocan en una capa de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados para permitir una reprogramación continua y finalmente exitosa. Las colonias de células madre pluripotentes inducidas reprogramadas pueden identificarse en función de sus características morfológicas, la actividad de la fosfatasa alcalina, la inmunoquímica positiva para los marcadores de pluripotencia y la expresión de genes de pluripotencia endógenos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la reprogramación basada en virus, es que este protocolo garantiza la generación constante de IPSC sin integración.Un técnico en el laboratorio Comience diluyendo la sangre periférica en una proporción de uno a uno en DPBS. Luego, en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 15 mililitros, coloque cuidadosamente siete mililitros de sangre diluida en tres mililitros de agua ambiente. Después de separar la muestra durante 30 minutos a 400 GS y temperatura ambiente, el pbmc se habrá asentado en la capa de interfaz blanca turbia entre el plasma y el paquete fial alto.Con una pipeta de transferencia estéril, transfiera los P BMC a un tubo cónico de 15 mililitros y aumente el volumen hasta 10 mililitros con DPBS nuevos. Luego, después de contar las células, transfiera dos veces 10 a las seis BMC P a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las células restantes, congele las células granuladas a una concentración de dos veces 10 a seis pbmc por mililitro en suero bovino fetal al 90% con 10% de dimetilsulfóxido. Luego, después de hacer girar las BMC de P que se reservaron, suspendemos el pellet en dos mililitros de medio de expansión recién preparado y los colocamos en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos e incubamos las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con una atmósfera de 5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 90% de nitrógeno.Luego, en el día tres y seis, reemplace el medio recolectando las células del pocillo. Lavar el pocillo con dos mililitros de QBSF 60 para recoger las células restantes, peletizar las células por centrifugación y luego resus suspender el pellet en dos mililitros de medio de expansión fresco. A continuación, regrese las células a la misma placa de 12 pocillos y continúe la incubación En el noveno día, pipetee los plásmidos de reprogramación en un tubo estéril de Einor de 1,5 mililitros como se indica en la tabla.A continuación, mezcle la solución de afección del núcleo con los suplementos suministrados por el fabricante y transfiera la mezcla a un tubo DPH invertido estéril de 1,5 mililitros. A continuación, dispense dos mililitros de medio de expansión en un pocillo de una nueva placa de 12 pocillos y equilibre el medio en la incubadora humidificada a 37 grados centígrados hasta que las células estén listas. Recoja las células, lave bien el cultivo celular como se acaba de demostrar y lave las células en cinco mililitros de DPBS.A continuación, resus, suspender el pellet celular en 100 microlitros de solución de afección Nucle más suplemento teniendo cuidado de evitar la generación de burbujas y transferir la suspensión celular al tubo que contiene el plásmido de reprogramación. Mezcle las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo una vez y transfiera toda la solución al fondo de una cápsula de afección del núcleo. A continuación, coloque el vete en la máquina de afección Nucle y ejecute el programa T 0 1 9.A continuación, añada 100 microlitros del medio de expansión EQUILIBRADO a la veta de afección del núcleo, y recoja inmediatamente toda la muestra evitando cualquier residuo blanco de células muertas flotantes y deposítela en el pocillo del medio precalentado. A continuación, vuelva a colocar las células en la incubadora humidificada el día 10 u 11. Cubra cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos con gelatina con un mililitro de gelatina al 0,1% en HBSS, y luego coloque la placa en la incubadora humidificada o al menos cinco minutos durante la incubación transfiera un vial de descongelación, dos veces 10 a los seis ratones irradiados de 3000 grados centígrados, embrionarios, fibroblastos o mes a 10 mililitros de medios de metanfetamina precalentados, y luego centrifugar las células mientras las células giran hacia abajo.Aspire la solución de gelatina de la placa de seis pocillos y luego vuelva a suspender el mes en 12 mililitros de medio de metanfetamina fresco. Dispense inmediatamente dos mililitros de OFM en cada pocillo de la gelatina recubierta. Seis. Poje la placa y vuelva a colocarla en la incubadora humidificada hasta el día 12.El día 12, recoja las células afectadas por el núcleo del pocillo en un tubo cónico de 15 mililitros, lavando el pocillo según se demuestre que recolecta las células restantes. Después de girar las celdas, suspendemos el pellet en 12 mililitros de medio de reprogramación recién preparado y dispensamos dos mililitros de celdas en cada pocillo de celdas alimentadoras. A continuación, en la placa de seis pocillos, centrifugar la placa durante 30 minutos a 75 GS y temperatura ambiente, y luego vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada, cambiando el medio cada dos días durante una o dos semanas.Una vez que aparecen las colonias de células pluripotentes inducibles, comience a alimentar las células con un medio de células madre embrionarias humanas recién preparado que contenga inhibidores de la histona desacetilasa tres días después de la afección del núcleo y antes de la colocación de la placa en las células afectadas del núcleo en la metanfetamina inducible. La eficiencia de una afección nuclear de NU exitosa debe estimarse mediante microscopía de fluorescencia Para EGFP, por ejemplo, aquí se muestra un experimento típico de afección de núcleos con aproximadamente el 5 al 10% de la población total de células que expresan EGFP colonias de células madre pluripotentes inducibles reprogramadas comenzarán a aparecer aproximadamente dos semanas después de la afección nuclear de NU. Las colonias son generalmente circulares con bordes bien definidos y pueden identificarse por su morfología característica de células madre embrionarias humanas, incluyendo células pequeñas y compactas con una alta proporción nuclear-citoplasmática y nucléolos visibles de las líneas representativas que han sido completamente caracterizadas.Todos los resultados positivos para la actividad de la fosfatasa alcalina expresan los marcadores de pluripotencia estándar y reactivan los genes de pluripotencia endógenos una vez dominados. Esta técnica puede generar consistentemente IPSC libre de integración en cuatro semanas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar estudios de diferenciación para responder preguntas sobre cualquier tipo de tejido.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Proponemos un protocolo para reprogramar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Al colocar las células sanguíneas transducidas en placas recubiertas de matriz con centrifugación, las iPSC se inducen con éxito a partir de células flotantes. Esta técnica sugiere un protocolo de reprogramación simple y efectivo para células como PBMC y CBMC.

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Este protocolo demuestra la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos dérmicos humanos mediante la expresión forzada de los factores de transcripción GATA2, GFI1B y FOS para generar células hematopoyéticas madre y progenitoras.

Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

La reprogramación celular requiere la introducción de genes clave, que regulan y mantienen el estado celular pluripotente. El protocolo descrito permite la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos dérmicos humanos sin métodos virales/integradores pero utilizando ARN no modificados (NM-RNA) combinados con factores de evasión inmune que reducen los mecanismos de defensa celular.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

El protocolo actual detalla los pasos para solucionar la derivación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de muestras de pacientes que han sido difíciles de reprogramar siguiendo las instrucciones del fabricante. Este protocolo es específico para muestras congeladas de capa buffy, pero también puede aplicarse a la reprogramación de PBMCs purificados.

Reprogramación de líneas de células madre pluripotentes inducidas a partir de muestras congeladas de capa buffy

Aprende a generar células iPS libres de integración a partir de sangre periférica usando plásmidos episomales e inhibidores de HDAC. Este método eficiente minimiza riesgos de mutagénesis para aplicaciones clínicas.

Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

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