Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

El objetivo general del siguiente experimento es generar células madre pluripotentes inducidas libres de integración a partir de una pequeña cantidad de sangre periférica. Esto se logra mediante el cultivo de células mononucleares aisladas de sangre periférica en factores de crecimiento definidos para producir una población progenitora de eritrocitos que es muy sensible a la reprogramación. Como segundo paso, los plásmidos episomales no integradores portadores de genes de reprogramación se introducen en los eritroblastos por afección del núcleo para iniciar el proceso de reprogramación.

A continuación, las células afectadas por el núcleo se colocan en una capa de fibroblastos embrionarios de ratón irradiados para permitir una reprogramación continua y finalmente exitosa. Las colonias de células madre pluripotentes inducidas reprogramadas pueden identificarse en función de sus características morfológicas, la actividad de la fosfatasa alcalina, la inmunoquímica positiva para los marcadores de pluripotencia y la expresión de genes de pluripotencia endógenos. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la reprogramación basada en virus, es que este protocolo garantiza la generación constante de IPSC sin integración.

Un técnico en el laboratorio Comience diluyendo la sangre periférica en una proporción de uno a uno en DPBS. Luego, en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 15 mililitros, coloque cuidadosamente siete mililitros de sangre diluida en tres mililitros de agua ambiente. Después de separar la muestra durante 30 minutos a 400 GS y temperatura ambiente, el pbmc se habrá asentado en la capa de interfaz blanca turbia entre el plasma y el paquete fial alto.

Con una pipeta de transferencia estéril, transfiera los P BMC a un tubo cónico de 15 mililitros y aumente el volumen hasta 10 mililitros con DPBS nuevos. Luego, después de contar las células, transfiera dos veces 10 a las seis BMC P a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las células restantes, congele las células granuladas a una concentración de dos veces 10 a seis pbmc por mililitro en suero bovino fetal al 90% con 10% de dimetilsulfóxido. Luego, después de hacer girar las BMC de P que se reservaron, suspendemos el pellet en dos mililitros de medio de expansión recién preparado y los colocamos en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos e incubamos las células en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con una atmósfera de 5% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 90% de nitrógeno.

Luego, en el día tres y seis, reemplace el medio recolectando las células del pocillo. Lavar el pocillo con dos mililitros de QBSF 60 para recoger las células restantes, peletizar las células por centrifugación y luego resus suspender el pellet en dos mililitros de medio de expansión fresco. A continuación, regrese las células a la misma placa de 12 pocillos y continúe la incubación En el noveno día, pipetee los plásmidos de reprogramación en un tubo estéril de Einor de 1,5 mililitros como se indica en la tabla.

A continuación, mezcle la solución de afección del núcleo con los suplementos suministrados por el fabricante y transfiera la mezcla a un tubo DPH invertido estéril de 1,5 mililitros. A continuación, dispense dos mililitros de medio de expansión en un pocillo de una nueva placa de 12 pocillos y equilibre el medio en la incubadora humidificada a 37 grados centígrados hasta que las células estén listas. Recoja las células, lave bien el cultivo celular como se acaba de demostrar y lave las células en cinco mililitros de DPBS.

A continuación, resus, suspender el pellet celular en 100 microlitros de solución de afección Nucle más suplemento teniendo cuidado de evitar la generación de burbujas y transferir la suspensión celular al tubo que contiene el plásmido de reprogramación. Mezcle las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo una vez y transfiera toda la solución al fondo de una cápsula de afección del núcleo. A continuación, coloque el vete en la máquina de afección Nucle y ejecute el programa T 0 1 9.

A continuación, añada 100 microlitros del medio de expansión EQUILIBRADO a la veta de afección del núcleo, y recoja inmediatamente toda la muestra evitando cualquier residuo blanco de células muertas flotantes y deposítela en el pocillo del medio precalentado. A continuación, vuelva a colocar las células en la incubadora humidificada el día 10 u 11. Cubra cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos con gelatina con un mililitro de gelatina al 0,1% en HBSS, y luego coloque la placa en la incubadora humidificada o al menos cinco minutos durante la incubación transfiera un vial de descongelación, dos veces 10 a los seis ratones irradiados de 3000 grados centígrados, embrionarios, fibroblastos o mes a 10 mililitros de medios de metanfetamina precalentados, y luego centrifugar las células mientras las células giran hacia abajo.

Aspire la solución de gelatina de la placa de seis pocillos y luego vuelva a suspender el mes en 12 mililitros de medio de metanfetamina fresco. Dispense inmediatamente dos mililitros de OFM en cada pocillo de la gelatina recubierta. Seis. Poje la placa y vuelva a colocarla en la incubadora humidificada hasta el día 12.

El día 12, recoja las células afectadas por el núcleo del pocillo en un tubo cónico de 15 mililitros, lavando el pocillo según se demuestre que recolecta las células restantes. Después de girar las celdas, suspendemos el pellet en 12 mililitros de medio de reprogramación recién preparado y dispensamos dos mililitros de celdas en cada pocillo de celdas alimentadoras. A continuación, en la placa de seis pocillos, centrifugar la placa durante 30 minutos a 75 GS y temperatura ambiente, y luego vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada, cambiando el medio cada dos días durante una o dos semanas.

Una vez que aparecen las colonias de células pluripotentes inducibles, comience a alimentar las células con un medio de células madre embrionarias humanas recién preparado que contenga inhibidores de la histona desacetilasa tres días después de la afección del núcleo y antes de la colocación de la placa en las células afectadas del núcleo en la metanfetamina inducible. La eficiencia de una afección nuclear de NU exitosa debe estimarse mediante microscopía de fluorescencia Para EGFP, por ejemplo, aquí se muestra un experimento típico de afección de núcleos con aproximadamente el 5 al 10% de la población total de células que expresan EGFP colonias de células madre pluripotentes inducibles reprogramadas comenzarán a aparecer aproximadamente dos semanas después de la afección nuclear de NU. Las colonias son generalmente circulares con bordes bien definidos y pueden identificarse por su morfología característica de células madre embrionarias humanas, incluyendo células pequeñas y compactas con una alta proporción nuclear-citoplasmática y nucléolos visibles de las líneas representativas que han sido completamente caracterizadas.

Todos los resultados positivos para la actividad de la fosfatasa alcalina expresan los marcadores de pluripotencia estándar y reactivan los genes de pluripotencia endógenos una vez dominados. Esta técnica puede generar consistentemente IPSC libre de integración en cuatro semanas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar estudios de diferenciación para responder preguntas sobre cualquier tipo de tejido.