Southern Blotting para detectar recombinaciones homólogas en el genoma de células madre embrionarias de ratón

La transferencia de Southern implica la identificación de secuencias específicas de ADN de una mezcla compleja de ADN a través de la detección basada en sondas.

Para identificar eventos de recombinación homóloga o HR en células madre embrionarias de ratón con Southern blot, obtenga ADN genómico de las células. Incubar con una enzima de restricción para digerir el ADN en fragmentos más pequeños.

Carga el ADN en un gel de agarosa. Realice electroforesis para la separación de fragmentos basada en el tamaño.

Trate el gel con una solución ácida para eliminar las bases de purina, aflojando el ADN bicatenario, dsDNA. Agregue una solución desnaturalizante alcalina. El pH alto interrumpe los enlaces de hidrógeno, desnaturalizando el dsDNA suelto en ADN monocatenario, ssDNA. Incubar con una solución neutralizante para neutralizar el pH del gel.

Ensamble el sistema de transferencia con papel secante, una membrana de nailon y gel apilado encima de la membrana. Realice la transferencia. El ssDNA se transfiere del gel a la membrana a través de la acción capilar descendente.

Irradiar la membrana con rayos ultravioleta, reticulando e inmovilizando el ADN. Coloque la membrana en un tubo que contenga una solución de hibridación. Incubar con rotación, recubriendo la membrana y evitando la unión inespecífica de la sonda.

Finalmente, incubar la membrana con el tampón de hibridación que contiene sondas monocatenarias marcadas radiactivamente. Las sondas se unen a regiones específicas de ADN a través de la complementariedad de secuencias.

Lave la membrana, retirando las sondas sueltas. Exponga la membrana a los rayos X. Las bandas distintivas en la membrana distinguen las regiones de ADN que contienen eventos HR de las regiones de control.