Name: Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprende a medir la longitud de telómeros en células eucariotas mediante análisis de fragmentos de restricción modificado con hibridación in situ. Este protocolo cuantitativo utiliza sondas radiomarcadas para evaluar directamente el envejecimiento celular en biología molecular.

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Los autores reconocen el apoyo de la Universidad de Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncología instalación compartida que es apoyado en parte por el premio P30CA047904.

<ol><li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="https://utsouthwestern.influuent.utsystem.edu/en/publications/analysis-of-telomeres-and-telomerase">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).</li>
<li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+Restriction+Fragment+%28TRF%29+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+Telomerase%3A+The+Means+to+the+End+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li>
<li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Discovery%3A+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li>
<li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Ends%3A+Just+the+Beginning+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li>
<li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%2C+Aging%2C+and+Plants%3A+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li>
<li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres-Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li>
<li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64(2016).</li>
<li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).</li>
<li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li>
<li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere-Associated+Aging+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , Epub ahead of print 1568-1637 (2016).</li>
<li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li>
<li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Telomere+Biology%3A+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging%2C+Disease+Risks%2C+and+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li>
<li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length%3A+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li>
<li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TECHNICAL+ADVANCES%3A+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li>
<li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li>
<li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+telomere+sequences+in+birds%3A+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li>
<li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+%28flow+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li>
<li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+in+epidemiology%3A+a+biomarker+of+aging%2C+age-related+disease%2C+both%2C+or+neither%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li>
<li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Después de la electroforesis, el frotis de ADN genómico es superior a 800 pb. Esto puede ocurrir si las enzimas de restricción son defectuosas o si se necesitan enzimas adicionales (como se ha descrito anteriormente). Una segunda explicación posible es que la proteína todavía está unida al ADN. Cuando se determina la concentración de ADN por espectrofotómetro, la relación 260/280 debe ser de alrededor de 1,8. Si esta proporción es &lt;1,5, hay contaminación de proteínas que puede interferir con la digestión con enzimas ...

Los telómeros, situados en los extremos de los cromosomas, son repeticiones nucleotídicas de la secuencia TTAGGG (en los cromosomas humanos) que juegan un papel crítico en la protección de la información genética celular 3 , 4 , 5 . Los telómeros tienen varios miles de pares de bases de longitud y sirven para proteger la integridad del resto del cromosoma durante la replicación del ADN. La replicación de los cromosomas no es perfecta, resultando en que los extremos del cromosoma no estén completamente copiados. Esta ineficiencia en la replicación se denomina el &quot;problema de replicación final&quot; y resulta en la pérdida de algunas de las repeticiones telomere durante cada ronda de replicación [ 6 , 7] . Telomere longitud puede ser restaurada después de la división celular por la telomerasa, una enzima que sustituye a las secuencias de telómeros perdidos 8 , 9 . La telomerasa, sin embargo, no esActivado en la mayoría de las células somáticas humanas y como resultado, con el tiempo, los telómeros se acortan, dando lugar eventualmente a la senescencia celular [ 10] . Debido al acortamiento de telómeros, los telómeros se consideran un biomarcador del envejecimiento y el riesgo de enfermedades relacionadas con la edad 11 , 12 . Además, la longitud de los telómeros puede verse afectada por factores genéticos, ambientales y de estilo de vida y otros estímulos como el estrés oxidativo, lo que indica que la longitud de telómeros puede desempeñar un papel como biomarcador en estudios toxicológicos, epidemiológicos y de comportamiento 13 , 14 , 15 . Este artículo demuestra una técnica para medir longitud de telómeros utilizando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado (TRF) adaptado de Mender y Shay 2 y Kimura et al. 16 , y similar a Herbert, Shay y WrigHt 1 y Haussmann y Mauck 17 . Tradicionalmente, el análisis de TRF implica un procedimiento de transferencia de Southern. Southern blots se consideran el &quot;estándar de oro&quot; para estudiar la longitud telómero y se utilizan activamente para examinar la longitud de los telómeros leucocitarios en estudios de epidemiología [ 18] . Este análisis de TRF utiliza ADN genómico digerido que deja atrás las repeticiones teloméricas. Los fragmentos de ADN se separan después por electroforesis en gel, se desnaturalizan y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa. Las secuencias de los telómeros se hibridan con una sonda de oligonucleótidos de telómeros. En lugar de transferir los telómeros separados a una membrana, otras técnicas de TRF utilizan técnicas de hibridación en gel con y sin desnaturalización del ADN. La inclusión de la desnaturalización es importante cuando se considera la detección de telómeros intersticiales, que han sido reportados en algunas especies [ 19] . Los procedimientos que carecen de pasos desnaturalizantes sólo detectanE simple hundido ADN sobresale en telómeros terminales y no se vinculará a las secuencias de telómeros intersticiales [ 18] . Además del análisis de la TRF, existen varias otras técnicas para medir la longitud del telómero, cada una de las cuales tiene sus propias ventajas y desventajas. La técnica Flow-FISH puede medir la longitud media de telómeros de células individuales de un tipo celular distinto mediante citometría de flujo 16 , 20 . Mientras que puede etiquetar con precisión los telómeros con sondas muy específicas y reducir el error humano a través de la automatización, Flow-FISH es caro, menos eficiente y requiere muestras frescas y un técnico altamente cualificado, limitando su capacidad para estudios epidemiológicos 16 . Además, este método no tiene en cuenta los posibles cambios en el número de cromosomas en la población celular. Otra técnica, qPCR, es ampliamente aceptada como un medio para medir la longitud de los telómeros para estudios epidemiológicos <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 debido a su alto rendimiento, bajo costo y el requisito de pequeñas cantidades de ADN en comparación con otros métodos. Sin embargo, qPCR sólo puede medir el contenido medio de telómeros de ADN en relación con un único gen de copia y es, por lo tanto, una estimación indirecta de la longitud promedio telómero. También produce un alto coeficiente de varianza en los estudios de comparación, en comparación con Southern blots, lo que conduce a la precisión cuestionable [ 21] . El procedimiento de TRF tiene sus propias deficiencias que limitan su uso para algunos estudios. Las técnicas de TRF requieren una gran cantidad de ADN en comparación con otros métodos (entre 2 y 3 μg por muestra). Esto limita las aplicaciones de la técnica al examen de la longitud de telómeros de las muestras clínicas para las que se puede recoger ADN genómico suficiente y no puede utilizarse en muestras de ADN degradadas. Además, el análisis de la TRF es costoso y requiere mucha mano de obra, requiriendo 4-5 días para obtener resultados. Sin embargo, el TRF produce un bajo coeficiente de varianzaConcediendo su reproducibilidad. Aunque este protocolo es diferente del tradicional Southern blot (utilizando la hibridación en gel in situ), las dos técnicas son fundamentalmente las mismas. La técnica presentada aquí es una combinación de una transferencia de Southern y hibridación en gel; Asociando el paso de desnaturalización del ADN de las transferencias de Southern con la hibridación en gel. Esta combinación tiene el beneficio añadido de una intensidad de señal de sonda mejorada en comparación con la transferencia de Southern y ha proporcionado consistentemente resultados cuantificables dentro de nuestro laboratorio. Además, el uso de sondas radiactivas en lugar de sondas quimioluminiscentes produce una intensidad de señal más alta y permite la visualización y cuantificación con un fosforoimager, haciendo que los análisis de la TRF sean fáciles de usar.

<table><tbody><tr><td>Biologics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1, enzima de restricción</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10,000 U/mL, digestión de ADN&nbsp; Viene con Cutsmart Buffer (tampón de digestión)</td></tr><tr><td>Hinf1, enzima de restricción</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10,000 U/mL, digestión de ADN. Viene con Cutsmart Buffer (tampón de digestión)</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td>grado de electroforesis</td></tr><tr><td>agarosa Optikinase&nbsp;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 Polinucleótido quinasa</td></tr><tr><td>SYBR Tinción de ácido nucleico verde I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber</td></tr><tr><td>Green Escalera de ADN exactGene 24- kB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de hebra C (3'-(G3AT2)4-'5)</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td></td><td>Oligonucleótido de ADN pedido a medida</td></tr><tr><td>Gamma-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>Radioisótopo</td></tr><tr><td>Qiagen Sangre y cultivo celular Mini kit de ADN</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>Kit de extracción de ADN</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 columna</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-5325-01</td><td>Para la purificación de la sonda de oligonucleótidos readioactivos</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td> polímero <td>sintético no iónico</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo/Software</fuerte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis en gel Owl A5 (20 cm x 25 cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td></td></tr> Sistema de <tr><td>electroforesis en gel Horizon 11.4 (11 cm x 14 cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>Electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Malla de nylon, 50, 12" x 12"</td><td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>Pantallas de fósforo de almacenamiento GE</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de fósforo Casete de exposición</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de hibridación Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-20Q Tubos</td><td></td></tr><tr><td>cilíndricos de hibridación</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>The Belly Dancer agitador orbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z768499-1EA</td><td>Agitador orbital</td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>ABI</td><td></td><td>Para la obtención de imágenes de geles y pantallas de fósforo</td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 6</td><td>GraphPad</td><td>versión 6.05</td><td>Programa de gráficos</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>Programa de hojas de cálculo</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Espectrofotómetro</td> <td>Nanodrp 2000</td></tr></tbody></table>

análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Existen varias técnicas diferentes para medir la longitud de los telómeros, cada una con sus propias ventajas y desventajas. El enfoque tradicional, el análisis de fragmentos de restricción Telomere (TRF), utiliza una técnica de hibridación de ADN mediante la cual las muestras de ADN genómico son digeridas con enzimas de restricción, dejando atrás las repeticiones del telómero y algún ADN sub-telomérico. Éstos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfieren a una membrana de filtro y se hibridan con sondas de oligonucleótidos marcadas con quimioluminiscencia o radioactividad para visualizar fragmentos de restricción de telómeros. Este enfoque, aunque requiere una mayor cantidad de ADN que otras técnicas como la PCR, puede medir la distribución de la longitud de telómeros de una población de células y permite la medición expresada en kilobases absolutas. Este manuscrito demuestra un procedimiento de hibridación de ADN modificado para determinar la longitud de los telómeros. El ADN genómico se digiere primero con enzimas de restricción (que no se cortanTelómeros) y separados por electroforesis en gel de agarosa. El gel se seca entonces y el ADN se desnaturaliza y se hibrida in situ a una sonda oligonucleotídica radiomarcada. Esta hibridación in situ evita la pérdida de ADN del telómero y mejora la intensidad de la señal. Después de la hibridación, se forman imágenes de los geles utilizando pantallas de fósforo y se cuantifica la longitud del telómero utilizando un programa de representación gráfica. Este procedimiento fue desarrollado por los laboratorios de los Dres. Woodring Wright y Jerry Shay en la Universidad de Texas Southwestern 1 , 2 . A continuación se presenta una descripción detallada de este procedimiento, con algunas modificaciones.

Se analizaron tres concentraciones de ADN (1, 2 y 3 μg) aisladas de la línea celular BJ-hTERT (fibroblastos de prepucio humano inmortalizado con telomerasa) 22 y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas para determinar la longitud de los telómeros. La Tabla 1 muestra las asignaciones de carriles para cada muestra de ADN. La Figura 1 muestra una tinción fluorescente de ácido nucleico del gel. Los patr...

En este artículo, se discute un protocolo detallado para cuantificar la longitud de los telómeros usando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado que proporciona una medición directa rápida y eficiente de la longitud de los telómeros. Esta técnica puede aplicarse a una variedad de fuentes celulares de ADN para cuantificar la longitud de los telómeros.

Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la longitud de los telómeros en células eucariotas utilizando una versión modificada del análisis de fragmentos de restricción de telómeros, descrito por los doctores Jerry W. Shay, Woodring Wright y colegas. Al proporcionar datos sobre la longitud de los telómeros, el procedimiento puede responder preguntas en biología celular, medicina conductual, epidemiología y enfermedades infecciosas, acerca de los efectos de la edad, el estrés, los tratamientos farmacológicos y las infecciones. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una medición directa en kilobases de la longitud promedio de los telómeros en una variedad de células.Las muestras de ADN genómico que se analizarán se extrajeron de células utilizando un kit comercial de extracción de ADN, tal como se describe en el protocolo del texto. Realice la digestión del ADN genómico en un volumen final de 20 a 40 microlitros. Combine lo siguiente en cada tubo de microcentrífuga: tres microgramos de ADN genómico; tampón de digestión de ADN 10x; un microlitro de enzima de restricción Rsa1; un microlitro de enzima de restricción Hinf1; y agua estéril desionizada hasta alcan

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Investigación

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Investigación del cáncer

Los telómeros son esenciales para la estabilidad de los cromosomas y los telómeros G-voladizo estructura es esencial para la telomerasa mediada mantenimiento de los telómeros. Recientemente hemos aprobado dos métodos para la detección de los telómeros G-estructura en...

El examen de los telómeros G-Estructura en voladizo Trypanosoma brucei

Un método preciso, breve, sofisticado y barato se describe que evalúa la longitud del telómero en múltiples tejidos y especies utilizando QRT-PCR. Además, vamos a describir un ensayo sencillo para evaluar la actividad de la telomerasa como una prueba complementaria columna vertebral para la longitud del telómero.

La longitud del telómero y la actividad de la telomerasa, una Yin y Yang de la senescencia celular

Reportamos un procedimiento conciso de hibridación fluorescente in situ (FISH) en la gónada y embriones de Caenorhabditis elegans para observar y cuantificar secuencias repetitivas. Observamos y cuantificamos con éxito dos secuencias repetitivas diferentes, las repeticiones de telómeros y la plantilla de alargamiento alternativo de telómeros (TALT).

La observación y cuantificación de los telómeros y las secuencias repetitivas usando fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH) con sondas de PNA en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Humana de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) sintetiza la DNA telomeric, pero también ARN bicatenario a través de la actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente. Aquí, describimos un análisis recién creado para detectar actividad de ARN polimerasa RNA-dependiente del terc endógena.

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Aquí, presentamos un protocolo para generar clones de células de cáncer que contiene una etiqueta de secuencia de MS2 en un sola subteloméricas. Este enfoque, basándose en el sistema MS2-GFP, permite la visualización de los transcritos endógenos de telomeric repetición que contiene ARN (TERRA) de un telómero solo en las células vivas.

Generación de Clones de células de cáncer para visualizar que contiene la repetición telomérica ARN TERRA de un telómero solo en las células vivas

Aquí, describimos en detalle el protocolo para cuantificar la longitud de los telómeros utilizando la detección quimioluminiscente no radiactiva, con un enfoque en la optimización de varios parámetros de rendimiento del kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG, como cantidades de tampón y concentraciones de sonda.

Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG

Aquí presentamos un protocolo para la medición de la longitud relativa de los telómeros (TL) utilizando el ensayo monocromo multiplex cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (MMqPCR). El ensayo MMqPCR es un método repetible, eficiente y rentable para medir la TL del ADN humano en estudios poblacionales.

Medición de la longitud de los telómeros de PCR cuantitativa multiplex monocromática 

Este protocolo demuestra el uso de pinzas magnéticas de una sola molécula para estudiar las interacciones entre las proteínas teloméricas de unión al ADN (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] y TRF2) y los telómeros largos extraídos de células humanas. Describe los pasos preparatorios para los telómeros y los factores de unión de repetición telomérica, la ejecución de experimentos de una sola molécula y los métodos de recopilación y análisis de datos.

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Pancreatoduodenctomy laparoscópica (LPD) puede ofrecer ventajas sobre pancreatoduodenectomy abierto, incluyendo el postoperatorio movilización temprana, menos retrasaron vaciamiento gástrico y una estancia hospitalaria más corta. Sin embargo, LPD es un desafío técnico y no bien estandarizado, especialmente en relación con la anastomosis pancreática. Describimos una técnica estandarizada para la anastomosis pancreática durante el LPD: modificado Blumgart pancreaticojejunostomy.

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Obtención de ADN genómico de la alta calidad de los tejidos del tumor es un primer paso esencial para el análisis de alteraciones genéticas mediante la siguiente secuencia de generación. En este artículo presentamos un método simple y rápido para enriquecer las células tumorales y obtener ADN intacto del toque de muestras de citología de impresión.

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Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel (Video) | JoVE Journal

Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

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