Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

El objetivo general de este procedimiento es determinar la longitud de los telómeros en las células eucariotas utilizando una versión modificada de un procedimiento de análisis de fragmentos de restricción de telómeros, descrito por los doctores Jerry W. Shay, Woodring Wright y sus colegas. Al proporcionar datos sobre la longitud de los telómeros, el procedimiento puede responder preguntas sobre biología celular, medicina conductual, epidemiología y enfermedades infecciosas, sobre los efectos de la edad, el estrés, los tratamientos farmacológicos y las infecciones. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una medición directa en kilobases de la longitud media de los telómeros en una variedad de células.

Las muestras de ADN genómico que se analizarán se extrajeron de las células utilizando un kit comercial de extracción de ADN, como se describe en el protocolo de texto. Realizar la digestión del ADN genómico en un volumen final de 20 a 40 microlitros. Combine lo siguiente en cada tubo de microcentrífuga:tres microgramos de ADN genómico; 10x tampón de digestión de ADN; un microlitro de enzima de restricción Rsa1; un microlitro de enzima de restricción Hinf1; y agua estéril y desionizada hasta el volumen final.

Centrifugar brevemente para asegurarse de que todos los componentes estén en el fondo del tubo. Incubar las digestiones a 37 grados centígrados, durante al menos 16 horas. Comience este procedimiento preparando la solución de agarosa al 0,6% como se describe en el protocolo de texto.

Prepare el sistema de electroforesis en gel para la fundición en gel. Coloque las compuertas de los extremos en la bandeja de fundición de gel. Una vez que la solución de gel de agarosa se haya enfriado a 50 grados centígrados, viértala en la bandeja de fundición de gel, coloque un cono en el gel y deje que el gel se endurezca durante 45 minutos sin tapar a temperatura ambiente.

Retire las compuertas de los extremos de la bandeja de fundición y retire el peine del gel. Llene el sistema de electroforesis en gel, con tampón de electroforesis hasta la línea de llenado, asegurándose de que el gel esté completamente sumergido en el tampón. Cargue los pocillos del gel con las muestras de ADN, dejando un pocillo en blanco entre las muestras.

Agregue 10 microlitros de una escalera de ADN en los pocillos en los extremos opuestos del gel. Ejecute la electroforesis en gel a 150 voltios durante 30 minutos, para mover rápidamente el ADN al gel. Después de 30 minutos, ajuste el voltaje a 57 voltios y deje funcionar durante 18 a 24 horas.

Después de que el gel haya funcionado durante 18 a 24 horas, apague la fuente de electrotroforesis y retire la bandeja de fundición en gel con el gel del tampón de electrotroforesis. Porción de la esquina superior derecha del gel para que sirva de referencia para la orientación del gel. Corta un pedazo de papel de filtro a un tamaño un poco más grande que el gel.

Coloca el papel de filtro encima del gel en una bandeja de fundición y deja que el papel absorba el exceso de solución del gel. Retira con cuidado las burbujas de aire entre el papel de filtro y el gel, usando una pipeta como rodillo para exprimir las burbujas por los lados. Retira el gel de la bandeja de fundición volteando el gel y el papel de filtro para que el papel quede debajo del gel.

Transfiera el gel con el papel de filtro a un secador de gel y cubra el gel con una envoltura de plástico. Elimine todas las burbujas de aire entre la envoltura de plástico y el gel con una pipeta como rodillo. Secar el gel a 50 grados centígrados durante dos horas.

Una vez que el gel se haya secado, retire la envoltura de plástico y transfiera el gel y el papel de filtro a un plato de vidrio que contenga 250 mililitros de agua desionizada. Retire con cuidado el papel de filtro e incube el gel a temperatura ambiente durante 15 minutos. Coloca el gel encima de una malla de nailon de 12 por 12 pulgadas.

Enrolle la malla de nailon y el gel asegurándose de que el gel no esté en contacto consigo mismo. Coloque la malla y el gel en un tubo de hibridación. Combine 100 mililitros de SSC 5x y 12 microlitros de tinción de ácido nucleico fluorescente verde y colóquelo en el tubo de hibridación.

Incubar durante 30 minutos a 42 grados centígrados en un horno de hibridación con rotación. Proteja la solución de la luz. Después de 30 minutos, retire la malla de nailon y el gel del tubo de hibridación.

Abra y colóquelo en un plato de vidrio que contenga 250 mililitros de agua desionizada. Retire suavemente la malla de nailon. Visualice el gel con un generador de imágenes de fósforo con los ajustes indicados.

Prepare la sonda de telómeros radiactivos siguiendo las regulaciones de la instalación para el manejo de radiactividad. En el tubo de microcentrífuga combine lo siguiente:dos microlitros de sonda de telómeros; 2,5 microlitros de tampón de reacción de polinucleótidos quinasas 10x; tres microlitros a ATP marcados en el grupo gamma fosfato con P32; cuatro microlitros de polinucleótido quinasa T4; y agua desionizada, estéril y libre de DNasa hasta un volumen final de 20 microlitros. Centrifuga brevemente el tubo.

Incubar el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora. Centrifugar el tubo brevemente e incubar a 65 grados centígrados durante 20 minutos para detener la reacción. Cargue la solución de sonda radiactiva en una columna de cromatografía G25 preparada y centrifugue durante dos minutos a 700 veces g.

Guarde el filtrado, que contiene la sonda de telómero radiactivo. Coloque el gel en un plato de vidrio que contenga 250 mililitros de solución desnaturalizante e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire la solución desnaturalizante y reemplácela con 250 mililitros de agua desionizada estéril.

Incubar durante 10 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente. Retire el agua desionizada. Reemplace con 250 mililitros de solución neutralizante e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Enrolle el gel en una malla de nailon y colóquelo en el tubo de hibridación. Agregue 20 mililitros de la solución de hibridación e incube en un horno de hibridación a 42 grados centígrados durante 10 minutos con rotación. Después de 10 minutos, retire la solución de hibridación y reemplácela con 20 mililitros de solución de hibridación fresca.

Agregue la totalidad de la sonda de telómeros e incube en un horno de hibridación a 42 grados centígrados con rotación durante la noche. Cuando se complete la hibridación con la sonda de telómeros, retire el gel y la malla del tubo de hibridación y colóquelos en un plato de vidrio, que contenga 250 mililitros de 2x SSC. Desenrolle y retire la malla de nailon del plato.

Coloque el plato de vidrio en un agitador orbital e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire el 2x SSC, reemplácelo con 250 mililitros de 0.1x SSC, más una solución de 0.1% SDS, e incube durante 15 minutos en el agitador orbital a temperatura ambiente. Retire la solución 0.1x SSC más 0.1%SDS.

Reemplace con 250 mililitros de 2x SSC e incube durante otros 15 minutos en el agitador orbital. Retire el gel del 2x SSC y envuelva el gel en una envoltura de plástico. Retire todas las burbujas y bolsas de aire entre el gel y la envoltura de plástico.

Coloque el gel en un casete de exposición con una pantalla de fósforo y exponga la pantalla de fósforo al gel durante la noche. Al día siguiente, utilice un generador de imágenes de fósforo para obtener imágenes de la pantalla de fósforo expuesta. Las imágenes de fósforo se utilizan posteriormente para la cuantificación de la longitud de los telómeros, tal y como se describe en el protocolo de texto.

Se analizaron tres concentraciones de ADN aisladas de una línea celular de fibroblastos de prepucio humano inmortalizada y células mononucleares de sangre periférica humana para determinar la longitud de los telómeros. Esta imagen de fósforo del gel de agerose seco teñido con tinción de ácido nucleico fluorescente verde muestra la ubicación de las bandas de la escalera de ADN en los carriles uno y ocho. La distancia medida desde la parte superior del gel hasta cada patrón de peso molecular se indica con flechas azules.

Después de la hibridación con una sonda de telómeros, las bandas de telómeros aparecen como frotis en cada carril. Se calcularon cuadrículas de 150 casillas para cada carril más un carril de fondo. Se muestran las áreas de análisis seleccionadas para cada conjunto de muestras.

Se seleccionaron carriles de fondo separados marcados como B para cada conjunto de muestras, para garantizar que las intensidades de fondo fueran similares para cada conjunto de muestras. Los cálculos de la longitud media de los telómeros revelaron una mayor longitud media de los telómeros en la línea celular inmortalizada que en las células mononucleares de sangre periférica humana. Estos resultados también demuestran que la cantidad de ADN genómico analizado en cada carril es fundamental para obtener una señal detectable después de la hibridación.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 12 horas repartidas en 2 días y medio, con dos incubaciones nocturnas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar al menos tres microgramos de ADN para cada muestra y medir cada muestra por duplicado. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del envejecimiento exploraran los mecanismos responsables de mantener la longitud de los telómeros en diferentes especies animales, incluidos los humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar directamente la longitud promedio de los telómeros. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de batas de laboratorio y guantes mientras se realiza este procedimiento.