Name: Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprende a medir la longitud de telómeros en células eucariotas mediante análisis de fragmentos de restricción modificado con hibridación in situ. Este protocolo cuantitativo utiliza sondas radiomarcadas para evaluar directamente el envejecimiento celular en biología molecular.

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Los autores reconocen el apoyo de la Universidad de Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncología instalación compartida que es apoyado en parte por el premio P30CA047904.

<ol><li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="https://utsouthwestern.influuent.utsystem.edu/en/publications/analysis-of-telomeres-and-telomerase">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).</li>
<li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+Restriction+Fragment+%28TRF%29+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+Telomerase%3A+The+Means+to+the+End+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li>
<li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Discovery%3A+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li>
<li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Ends%3A+Just+the+Beginning+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li>
<li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%2C+Aging%2C+and+Plants%3A+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li>
<li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres-Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li>
<li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64(2016).</li>
<li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).</li>
<li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li>
<li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere-Associated+Aging+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , Epub ahead of print 1568-1637 (2016).</li>
<li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li>
<li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Telomere+Biology%3A+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging%2C+Disease+Risks%2C+and+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li>
<li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length%3A+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li>
<li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TECHNICAL+ADVANCES%3A+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li>
<li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li>
<li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+telomere+sequences+in+birds%3A+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li>
<li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+%28flow+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li>
<li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+in+epidemiology%3A+a+biomarker+of+aging%2C+age-related+disease%2C+both%2C+or+neither%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li>
<li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Después de la electroforesis, el frotis de ADN genómico es superior a 800 pb. Esto puede ocurrir si las enzimas de restricción son defectuosas o si se necesitan enzimas adicionales (como se ha descrito anteriormente). Una segunda explicación posible es que la proteína todavía está unida al ADN. Cuando se determina la concentración de ADN por espectrofotómetro, la relación 260/280 debe ser de alrededor de 1,8. Si esta proporción es &lt;1,5, hay contaminación de proteínas que puede interferir con la digestión con enzimas ...

Los telómeros, situados en los extremos de los cromosomas, son repeticiones nucleotídicas de la secuencia TTAGGG (en los cromosomas humanos) que juegan un papel crítico en la protección de la información genética celular 3 , 4 , 5 . Los telómeros tienen varios miles de pares de bases de longitud y sirven para proteger la integridad del resto del cromosoma durante la replicación del ADN. La replicación de los cromosomas no es perfecta, resultando en que los extremos del cromosoma no estén completamente copiados. Esta ineficiencia en la replicación se denomina el &quot;problema de replicación final&quot; y resulta en la pérdida de algunas de las repeticiones telomere durante cada ronda de replicación [ 6 , 7] . Telomere longitud puede ser restaurada después de la división celular por la telomerasa, una enzima que sustituye a las secuencias de telómeros perdidos 8 , 9 . La telomerasa, sin embargo, no esActivado en la mayoría de las células somáticas humanas y como resultado, con el tiempo, los telómeros se acortan, dando lugar eventualmente a la senescencia celular [ 10] . Debido al acortamiento de telómeros, los telómeros se consideran un biomarcador del envejecimiento y el riesgo de enfermedades relacionadas con la edad 11 , 12 . Además, la longitud de los telómeros puede verse afectada por factores genéticos, ambientales y de estilo de vida y otros estímulos como el estrés oxidativo, lo que indica que la longitud de telómeros puede desempeñar un papel como biomarcador en estudios toxicológicos, epidemiológicos y de comportamiento 13 , 14 , 15 . Este artículo demuestra una técnica para medir longitud de telómeros utilizando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado (TRF) adaptado de Mender y Shay 2 y Kimura et al. 16 , y similar a Herbert, Shay y WrigHt 1 y Haussmann y Mauck 17 . Tradicionalmente, el análisis de TRF implica un procedimiento de transferencia de Southern. Southern blots se consideran el &quot;estándar de oro&quot; para estudiar la longitud telómero y se utilizan activamente para examinar la longitud de los telómeros leucocitarios en estudios de epidemiología [ 18] . Este análisis de TRF utiliza ADN genómico digerido que deja atrás las repeticiones teloméricas. Los fragmentos de ADN se separan después por electroforesis en gel, se desnaturalizan y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa. Las secuencias de los telómeros se hibridan con una sonda de oligonucleótidos de telómeros. En lugar de transferir los telómeros separados a una membrana, otras técnicas de TRF utilizan técnicas de hibridación en gel con y sin desnaturalización del ADN. La inclusión de la desnaturalización es importante cuando se considera la detección de telómeros intersticiales, que han sido reportados en algunas especies [ 19] . Los procedimientos que carecen de pasos desnaturalizantes sólo detectanE simple hundido ADN sobresale en telómeros terminales y no se vinculará a las secuencias de telómeros intersticiales [ 18] . Además del análisis de la TRF, existen varias otras técnicas para medir la longitud del telómero, cada una de las cuales tiene sus propias ventajas y desventajas. La técnica Flow-FISH puede medir la longitud media de telómeros de células individuales de un tipo celular distinto mediante citometría de flujo 16 , 20 . Mientras que puede etiquetar con precisión los telómeros con sondas muy específicas y reducir el error humano a través de la automatización, Flow-FISH es caro, menos eficiente y requiere muestras frescas y un técnico altamente cualificado, limitando su capacidad para estudios epidemiológicos 16 . Además, este método no tiene en cuenta los posibles cambios en el número de cromosomas en la población celular. Otra técnica, qPCR, es ampliamente aceptada como un medio para medir la longitud de los telómeros para estudios epidemiológicos <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 debido a su alto rendimiento, bajo costo y el requisito de pequeñas cantidades de ADN en comparación con otros métodos. Sin embargo, qPCR sólo puede medir el contenido medio de telómeros de ADN en relación con un único gen de copia y es, por lo tanto, una estimación indirecta de la longitud promedio telómero. También produce un alto coeficiente de varianza en los estudios de comparación, en comparación con Southern blots, lo que conduce a la precisión cuestionable [ 21] . El procedimiento de TRF tiene sus propias deficiencias que limitan su uso para algunos estudios. Las técnicas de TRF requieren una gran cantidad de ADN en comparación con otros métodos (entre 2 y 3 μg por muestra). Esto limita las aplicaciones de la técnica al examen de la longitud de telómeros de las muestras clínicas para las que se puede recoger ADN genómico suficiente y no puede utilizarse en muestras de ADN degradadas. Además, el análisis de la TRF es costoso y requiere mucha mano de obra, requiriendo 4-5 días para obtener resultados. Sin embargo, el TRF produce un bajo coeficiente de varianzaConcediendo su reproducibilidad. Aunque este protocolo es diferente del tradicional Southern blot (utilizando la hibridación en gel in situ), las dos técnicas son fundamentalmente las mismas. La técnica presentada aquí es una combinación de una transferencia de Southern y hibridación en gel; Asociando el paso de desnaturalización del ADN de las transferencias de Southern con la hibridación en gel. Esta combinación tiene el beneficio añadido de una intensidad de señal de sonda mejorada en comparación con la transferencia de Southern y ha proporcionado consistentemente resultados cuantificables dentro de nuestro laboratorio. Además, el uso de sondas radiactivas en lugar de sondas quimioluminiscentes produce una intensidad de señal más alta y permite la visualización y cuantificación con un fosforoimager, haciendo que los análisis de la TRF sean fáciles de usar.

<table><tbody><tr><td>Biologics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1, enzima de restricción</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10,000 U/mL, digestión de ADN&nbsp; Viene con Cutsmart Buffer (tampón de digestión)</td></tr><tr><td>Hinf1, enzima de restricción</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10,000 U/mL, digestión de ADN. Viene con Cutsmart Buffer (tampón de digestión)</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td>grado de electroforesis</td></tr><tr><td>agarosa Optikinase&nbsp;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 Polinucleótido quinasa</td></tr><tr><td>SYBR Tinción de ácido nucleico verde I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber</td></tr><tr><td>Green Escalera de ADN exactGene 24- kB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de hebra C (3'-(G3AT2)4-'5)</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td></td><td>Oligonucleótido de ADN pedido a medida</td></tr><tr><td>Gamma-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>Radioisótopo</td></tr><tr><td>Qiagen Sangre y cultivo celular Mini kit de ADN</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>Kit de extracción de ADN</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 columna</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-5325-01</td><td>Para la purificación de la sonda de oligonucleótidos readioactivos</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td> polímero <td>sintético no iónico</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo/Software</fuerte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis en gel Owl A5 (20 cm x 25 cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td></td></tr> Sistema de <tr><td>electroforesis en gel Horizon 11.4 (11 cm x 14 cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>Electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Malla de nylon, 50, 12" x 12"</td><td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>Pantallas de fósforo de almacenamiento GE</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Pantalla de fósforo Casete de exposición</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de hibridación Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-20Q Tubos</td><td></td></tr><tr><td>cilíndricos de hibridación</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>The Belly Dancer agitador orbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z768499-1EA</td><td>Agitador orbital</td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>ABI</td><td></td><td>Para la obtención de imágenes de geles y pantallas de fósforo</td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 6</td><td>GraphPad</td><td>versión 6.05</td><td>Programa de gráficos</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>Programa de hojas de cálculo</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Espectrofotómetro</td> <td>Nanodrp 2000</td></tr></tbody></table>

análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Existen varias técnicas diferentes para medir la longitud de los telómeros, cada una con sus propias ventajas y desventajas. El enfoque tradicional, el análisis de fragmentos de restricción Telomere (TRF), utiliza una técnica de hibridación de ADN mediante la cual las muestras de ADN genómico son digeridas con enzimas de restricción, dejando atrás las repeticiones del telómero y algún ADN sub-telomérico. Éstos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfieren a una membrana de filtro y se hibridan con sondas de oligonucleótidos marcadas con quimioluminiscencia o radioactividad para visualizar fragmentos de restricción de telómeros. Este enfoque, aunque requiere una mayor cantidad de ADN que otras técnicas como la PCR, puede medir la distribución de la longitud de telómeros de una población de células y permite la medición expresada en kilobases absolutas. Este manuscrito demuestra un procedimiento de hibridación de ADN modificado para determinar la longitud de los telómeros. El ADN genómico se digiere primero con enzimas de restricción (que no se cortanTelómeros) y separados por electroforesis en gel de agarosa. El gel se seca entonces y el ADN se desnaturaliza y se hibrida in situ a una sonda oligonucleotídica radiomarcada. Esta hibridación in situ evita la pérdida de ADN del telómero y mejora la intensidad de la señal. Después de la hibridación, se forman imágenes de los geles utilizando pantallas de fósforo y se cuantifica la longitud del telómero utilizando un programa de representación gráfica. Este procedimiento fue desarrollado por los laboratorios de los Dres. Woodring Wright y Jerry Shay en la Universidad de Texas Southwestern 1 , 2 . A continuación se presenta una descripción detallada de este procedimiento, con algunas modificaciones.

Se analizaron tres concentraciones de ADN (1, 2 y 3 μg) aisladas de la línea celular BJ-hTERT (fibroblastos de prepucio humano inmortalizado con telomerasa) 22 y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas para determinar la longitud de los telómeros. La Tabla 1 muestra las asignaciones de carriles para cada muestra de ADN. La Figura 1 muestra una tinción fluorescente de ácido nucleico del gel. Los patr...

En este artículo, se discute un protocolo detallado para cuantificar la longitud de los telómeros usando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado que proporciona una medición directa rápida y eficiente de la longitud de los telómeros. Esta técnica puede aplicarse a una variedad de fuentes celulares de ADN para cuantificar la longitud de los telómeros.

Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar la longitud de los telómeros en células eucariotas utilizando una versión modificada del análisis de fragmentos de restricción de telómeros, descrito por los doctores Jerry W. Shay, Woodring Wright y colegas. Al proporcionar datos sobre la longitud de los telómeros, el procedimiento puede responder preguntas en biología celular, medicina conductual, epidemiología y enfermedades infecciosas, acerca de los efectos de la edad, el estrés, los tratamientos farmacológicos y las infecciones. La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una medición directa en kilobases de la longitud promedio de los telómeros en una variedad de células.Las muestras de ADN genómico que se analizarán se extrajeron de células utilizando un kit comercial de extracción de ADN, tal como se describe en el protocolo del texto. Realice la digestión del ADN genómico en un volumen final de 20 a 40 microlitros. Combine lo siguiente en cada tubo de microcentrífuga: tres microgramos de ADN genómico; tampón de digestión de ADN 10x; un microlitro de enzima de restricción Rsa1; un microlitro de enzima de restricción Hinf1; y agua estéril desionizada hasta alcanzar el volumen final.Centrifugar brevemente para asegurar que todos los componentes estén en el fondo del tubo. Incubar las digestiones a 37 grados Celsius durante al menos 16 horas. Comience este procedimiento preparando una solución de agarosa al 0,6 % como se describe en el protocolo del texto.Prepare el sistema de electroforesis en gel para la elaboración del gel. Coloque las compuertas de extremo en la bandeja de moldeo del gel. Una vez que la solución de agarosa haya enfriado a 50 grados Celsius, viértala en la bandeja de moldeo, coloque un peine en el gel y deje que el gel se endurezca durante 45 minutos sin tapar a temperatura ambiente.Retire las compuertas extremas de la bandeja de moldeo y retire el peine del gel. Llene el sistema de electroforesis con tampón de electroforesis hasta la línea de llenado, asegurándose de que el gel quede completamente sumergido en el tampón. Cargue las pocillos del gel con las muestras de ADN, dejando un pocillo vacío entre cada muestra.Agregue 10 microlitros de un marcador de ADN en los pocillos en los extremos opuestos del gel. Realice la electroforesis en gel a 150 voltios durante 30 minutos, para mover rápidamente el ADN hacia el gel. Después de 30 minutos, ajuste el voltaje a 57 voltios y corra durante 18 a 24 horas.Después de que el gel haya corrido durante 18 a 24 horas, apague la fuente de electroforesis y retire la bandeja de moldeo del gel junto con el gel del tampón de electroforesis. Corte la esquina superior derecha del gel para servir como referencia de la orientación del gel. Corte un trozo de papel de filtro a un tamaño ligeramente mayor que el del gel.Coloque el papel de filtro encima del gel en una bandeja de moldeo y permita que el papel absorba la solución en exceso del gel. Retire cuidadosamente las burbujas de aire entre el papel de filtro y el gel, utilizando una pipeta como rodillo para expulsar las burbujas por los lados. Saque el gel de la bandeja de moldeo volteando el gel y el papel de filtro de manera que el papel quede debajo del gel.Transfiera el gel con el papel de filtro a un secador de geles y cúbralo con una envoltura de plástico. Elimine todas las burbujas de aire entre la envoltura de plástico y el gel utilizando una pipeta como rodillo. Seque el gel a 50 grados Celsius durante dos horas.Una vez que el gel haya secado, retire el envoltorio de plástico y transfiera el gel y el papel filtro a un recipiente de vidrio que contenga 250 mililitros de agua desionizada. Retire cuidadosamente el papel filtro e incube el gel a temperatura ambiente durante 15 minutos. Coloque el gel encima de una malla de nailon de 12 por 12 pulgadas.Enrolle la malla de nailon y el gel juntos asegurándose de que el gel no esté en contacto consigo mismo. Coloque la malla y el gel en un tubo de hibridación. Combine 100 mililitros de SSC 5x y 12 microlitros de colorante verde fluorescente para ácidos nucleicos, y coloque la mezcla en el tubo de hibridación.Incubar durante 30 minutos a 42 grados Celsius en un horno de hibridación con rotación. Proteger la solución de la luz. Después de 30 minutos, retirar la malla de nailon y el gel del tubo de hibridación.Desenrolle y coloque sobre una superficie plana en un recipiente de vidrio que contenga 250 mililitros de agua desionizada. Retire cuidadosamente la malla de nailon. Imagen el gel utilizando un fosfoimagen con los ajustes indicados.Prepare la sonda radiactiva de telómero siguiendo las regulaciones del laboratorio para el manejo de material radiactivo. En un tubo de microcentrifugado combine lo siguiente: dos microlitros de sonda de telómero; 2,5 microlitros de tampón de reacción 10x de polinucleótido cinasa; tres microlitros de ATP marcado en el grupo fosfato gamma con P32; cuatro microlitros de polinucleótido cinasa T4; y agua estéril, libre de DNasa y desionizada hasta un volumen final de 20 microlitros. Centrifugue brevemente el tubo.Incube el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante una hora. Centrifugue brevemente el tubo e incube a 65 grados Celsius durante 20 minutos para detener la reacción. Cargue la solución del sonda radiactiva en una columna de cromatografía G25 preparada y centrifugue durante dos minutos a 700 veces g.Guarde el filtrado, que contiene la sonda radiactiva de telómero. Coloque el gel en un recipiente de vidrio que contenga 250 mililitros de Solución Desnaturalizante e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire la Solución Desnaturalizante y sustitúyala con 250 mililitros de agua estéril desionizada.Incubar durante 10 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente. Eliminar el agua desionizada. Reemplazar con 250 mililitros de solución de neutralización e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.Enrolle el gel en una malla de nailon y colóquelo en el tubo de hibridación. Añada 20 mililitros de la solución de hibridación e incube en un horno de hibridación a 42 grados Celsius durante 10 minutos con rotación. Después de 10 minutos, retire la solución de hibridación y sustitúyala por 20 mililitros de solución de hibridación fresca.Agregue la totalidad de la sonda telomérica e incube en un horno de hibridación a 42 grados Celsius con rotación durante la noche. Cuando finalice la hibridación con la sonda telomérica, retire el gel y la malla del tubo de hibridación y colóquelos en un recipiente de vidrio que contenga 250 mililitros de SSC 2x. Desenrolle y retire la malla de nailon del recipiente.Coloque el recipiente de vidrio sobre un agitador orbital e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Retire el SSC 2x, sustitúyalo con 250 mililitros de solución de SSC 0,1x más SDS al 0,1 %, e incube durante 15 minutos en el agitador orbital a temperatura ambiente. Retire la solución de SSC 0,1x más SDS al 0,1 %.Sustituya con 250 mililitros de SSC 2x e incube otros 15 minutos en el agitador orbital. Retire el gel del SSC 2x y envuélvalo con papel de plástico. Elimine todas las burbujas y bolsas de aire entre el gel y el papel de plástico.Coloque el gel en una cassette de exposición con una pantalla de fósforo y exponga la pantalla de fósforo al gel durante la noche. Al día siguiente, utilice un revelador de fósforos para obtener una imagen de la pantalla de fósforo expuesta. Las imágenes de fósforo se utilizan posteriormente para la cuantificación de la longitud de los telómeros, como se describe en el protocolo escrito.Se analizaron tres concentraciones de ADN aislado de una línea celular inmortalizada de fibroblastos de prepucio humano y de células mononucleares de sangre periférica humana para determinar la longitud de los telómeros. Esta imagen de fósforo de un gel de agarosa seco, teñido con un colorante fluorescente verde para ácidos nucleicos, muestra la ubicación de las bandas de la escalera de ADN en las carreras uno y ocho. La distancia medida desde la parte superior del gel hasta cada patrón de peso molecular se indica mediante flechas azules.Tras la hibridización con una sonda de telómero, las bandas de telómeros aparecen como manchas difusas en cada carril. Se calcularon cuadrículas de 150 cajas para cada carril, más un carril de fondo. Se muestran las áreas seleccionadas para el análisis de cada conjunto de muestras.Se seleccionaron carriles de fondo marcados como B separados para cada conjunto de muestras, para asegurar que las intensidades de fondo fueran similares para cada conjunto de muestras. Los cálculos de la longitud media de los telómeros revelaron una longitud media de telómeros mayor en la línea celular inmortalizada que en las células mononucleares de sangre periférica humana. Estos resultados también demuestran que la cantidad de ADN genómico analizada en cada carril es fundamental para obtener una señal detectable tras la hibridación.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 12 horas distribuidas a lo largo de 2 1/2 días, con dos incubaciones nocturnas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar al menos tres microgramos de ADN para cada muestra y medir cada muestra por duplicado. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del envejecimiento exploraran los mecanismos responsables del mantenimiento de la longitud de los telómeros en diferentes especies animales, incluidos los seres humanos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar directamente la longitud promedio de los telómeros. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar bata de laboratorio y guantes durante la realización de este procedimiento.

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