Southern Blotting para detectar recombinaciones homólogas en el genoma de células madre embrionarias de ratón

Para cada ADNg, mezcle 30 microlitros de tampón 10X para Dra I, tres microlitros de Dra I y 10 microgramos de ADNg por muestra. Agregue agua hasta que el volumen final sea de 30 microlitros e incube a 37 grados centígrados durante la noche para digerir los ADNg.

Prepare un gel de electroforesis de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Cargue las muestras adquiridas previamente junto con una escalera de 1 Kb en el gel y hágalo funcionar a 30 a 40 voltios durante la noche. Al día siguiente, remoje el gel en una bandeja que contenga una solución de ácido clorhídrico de 0,2 Newton. Use una coctelera para agitar la bandeja suavemente durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Transfiera el gel a una bandeja que contenga una solución desnaturalizante de ADN. Agítalo suavemente durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, transfiera el gel a una bandeja que contenga una solución neutralizante de ADN y agítelo suavemente durante 20 minutos a temperatura ambiente. Usando un sistema de transferencia rápida hacia abajo, transfiera los ADNs del gel a la membrana.

A continuación, ensamble el TurboBlotter y la pila de transferencia como se describe en las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Después de esto, saque la membrana y lávela con citrato de sodio y solución salina 2X durante un minuto. Absorba el líquido con los pañuelos y, a continuación, utilice un reticulante UV para reticular el ADN con la membrana.

Para comenzar a marcar las sondas de ADN con radiactividad, agregue los ADN de la sonda desnaturalizados por calor al tubo que contiene las perlas de etiquetado de ADN listas para usar. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para mezclar y agrega 5 microlitros de trifosfato de desoxicitosina marcado radiactivamente. Incubar a 37 grados centígrados durante quince minutos. Purifique las sondas marcadas mediante el uso de microcolumnas G-50, de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Use un contador de centelleo para medir la radiactividad.

Para comenzar a hibridar las membranas con las sondas marcadas, coloque la membrana en el tubo de hibridación. Agregue la solución de prehibridación mixta. Coloque el tubo en el horno de hibridación y deje que la prehibridación proceda a 42 grados centígrados durante 30 minutos.

Luego, retire el tubo del horno y vierta la solución de prehibridación en un tubo de 50 mililitros. Agregue la sonda desnaturalizada y mezcle suavemente. Agregue la solución de hibridación mezclada en el tubo de hibridación y regrese el tubo al horno de hibridación. Luego, deje que la hibridación proceda durante la noche.

Para retirar las sondas no hibridadas, coloque la membrana en una bandeja que contenga 1x citrato de sodio salino con 0,1% de SDS y agite suavemente a 55 a 60 grados centígrados durante 10 minutos. Después de esto, envuelva la membrana con una envoltura de plástico y fíjela en el casete de exposición. En una habitación oscura, exponga la membrana a 2 hojas de película de rayos X. Revele la película para visualizar los resultados.