Name: La interferencia de ARN en las garrapatas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende la técnica de interferencia de ARN en garrapatas mediante inyección de ARN de doble cadena. Este método permite estudiar la función génica y desarrollar estrategias para controlar enfermedades transmitidas por garrapatas.

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Agradecemos a los miembros de nuestros laboratorios para un debate fructífero y asistencia técnica. Esta presentación en video fue apoyada por el Decano Asociado para la Investigación y el Departamento de Patología Veterinaria, Centro de Ciencias de la Salud Veterinaria, Universidad Estatal de Oklahoma. La investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia e Innovación, España (proyecto BFU2008-01244/BMC), el proyecto intramural del CSIC PA1002451 a JF, Walter R. Sitlington Cátedra de Investigación en Alimentación Animal de KMK, CVHS 2009 RAC subvención, las emisiones otoacústicas Fondos de Salud Animal y el USDA, la Beca Nacional de Investigación Iniciativa de la competencia, N º 2007-04613.

1. Generación de dsRNA. <ol><li> Sintetizar oligonucleótidos que contienen secuencias de promotor T7 para la transcripción in vitro y la síntesis del dsRNA (por ejemplo, para Dermacentor variabilis subolesin uso de oligonucleótidos D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'y D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). </li><li> Amplificación del gen diana por RT-PCR con 10 pmol de cada oligonucleótido y 10.1 ng de ARN total de garrapatas. </li><li> Purificar el producto de PCR. </li><li> Sintetizar dsRNA con 8 l del producto de PCR purificado. </li><li> Cuantificar dsRNA por espectrometría. </li></ol> 2. La inyección de garrapatas con dsRNA. 2.1. Preparación de las garrapatas de la inyección. <ol><li> Primero, lávese las garrapatas en una serie de soluciones por agitación en cada solución en un tubo de centrífuga de 50 ml desechables, decantando la solución a través de una malla de alambre fino en la parte superior del tubo para mantener las garrapatas. La secuencia de las soluciones para las garrapatas de lavado es agua del grifo, 3% de peróxido de hidrógeno, dos lavados de agua destilada, etanol 70% y más de dos lavados con agua destilada. </li><li> Blot-seca las garrapatas en las toallas de papel. </li><li> Contar con las garrapatas en grupos de 20 a 50, dependiendo del experimento, coloque las garrapatas de cada grupo en una taza de 1,25 oz de plástico con tapa bien ajustada y una etiqueta con el número del grupo experimental. </li></ol> 2.2. Marque el equipo de inyección. El equipo de RNAi se compone de tres personas: (1) una persona que las posiciones de cada marca en la cinta adhesiva de doble estampará en una hoja de cera dental rojo, (2) una persona que se inyectaba las garrapatas y (3) una persona que controla las garrapatas después inyección, respira CO 2 en las garrapatas para activarlos y cuenta con las garrapatas que viven en las tazas marcado con el número del grupo experimental. Todos los miembros del equipo deben usar guantes desechables. 2.3. La colocación de las garrapatas de la inyección. <ol><li> Captura de una garrapata con unas pinzas finas Dumont y el lugar que la parte ventral en cinta adhesiva de doble colocada en un 3 "x 6" hoja de cera dental rojo. Las garrapatas están muy posicionados en grupos de 5 garrapatas. </li><li> Coloque una pequeña tira de cinta adhesiva sobre las piezas bucales de los 5 garrapatas a fin de promover las limitan, pero dejando la mayor parte del cuerpo que están expuestas de manera que el proceso de inyección se pueden observar por la garrapata del inyector (Figura 1). </li></ol> 2.4. La inyección de garrapatas. <ol><li> Las garrapatas se inyecta en el cuadrante inferior derecho de la cara ventral del exoesqueleto. </li><li> En primer lugar, perfore un agujero en el exoesqueleto con una jeringa de insulina Monoject equipado con un ½ ", 29 de aguja (Figura 2a). </li><li> Inyectar inmediatamente las garrapatas con 0,2-0,5 l de solución de dsRNA (5 x 10 10 - 5 x 10 11 moléculas por microlitro) con una jeringa a medida Hamilton con 1 pulgada, aguja de calibre 33 con un punto de biselado 45 ° (Figura 2b) . La aguja debe estar en buena posición dentro de la cavidad de verificación para asegurar la colocación y el mantenimiento de la dsRNA. Un poco de líquido es probable que escape de la zona de inyección (figura 2c). Se debe tener cuidado de no inyectar más de las garrapatas, lo que causaría la pérdida de hemolinfa y podría causar la muerte de la garrapata. </li><li> Limpie la jeringa Hamilton después de completar la inyección en cada grupo experimental. antes de usar para otro grupo experimental. Llene la jeringa primero de un vaso que contiene 3% de peróxido de hidrógeno y luego expulsar a un contenedor de residuos, y repita 15 veces. Llene la jeringa de un vaso que contiene agua estéril y luego expulsar a un contenedor de residuos, y repita 15 veces. Tenga cuidado de no doblar el émbolo de la jeringa Hamilton, ya que, si se doblan, el émbolo no se mueve sin problemas y responder a la suave toque necesario para la inyección de las garrapatas. </li></ol> 2.5. El tratamiento de garrapatas después de la inyección. <ol><li> Recoger la garrapata inyecta inmediatamente de la cinta adhesiva de doble con las pinzas finas y colocarlo en un recipiente de recuperación de plástico (de aproximadamente 6 "x 6" y rodeada con cinta adhesiva para evitar la fuga de las garrapatas). Las garrapatas se hará una breve inactivos después de la inyección, pero pronto comienzan a gatear alrededor del plato. </li><li> Respiración de CO 2 a la garrapata inmediatamente después de colocarlos en el recipiente de recuperación para ayudar a activar las garrapatas. Una vez que las garrapatas se están arrastrando y activa, la herida de la inyección se curan rápidamente y van a sobrevivir más probable. </li><li> Contar con las garrapatas de acuerdo con el número en cada grupo experimental y colocarlos en un vaso de plástico etiquetados con una tapa bien ajustada. Las garrapatas de reemplazo debe ser inyectada para reemplazar el que cualquier murió antes de inyectar el grupo experimental que viene. </li></ol> 2.6. Marque la celebración. <ol><li> Coloque la garrapata en una cámara de humedad (12 h luz: 12 h fotoperíodo oscuridad a 22-25 ° C y 95% en relación humidity) y mantener durante 1 día. </li><li> Garrapatas lugar en las células de alimentación de garrapatas, uno por cada grupo experimental, pegado a una oveja y les permite alimentarse con el mismo número de garrapatas no inyectadas hombre o mujer (lo que el sexo no se inyecta). Las hembras de que se alimentan hasta la saciedad, los que se retiran de las ovejas después de 10 días de alimentación o cuando el control de las mujeres han desaparecido de la sede se recogen y se pesó. </li><li> Coloque la garrapata en cajas de cartón, y mantener en la cámara de humedad hasta la finalización de la oviposición. Evaluar la oviposición de ponderación la masa de huevos producidos por todas las garrapatas en el grupo. </li></ol> 2.7. Análisis del fenotipo garrapata después de RNAi. <ol><li> Evaluar el fenotipo de garrapatas después de la alimentación mediante la determinación del número de pasos que sobrevivieron, el peso de garrapatas, la oviposición y la fertilidad del huevo. Sin embargo, otros análisis se puede realizar en función de los genes específicos y objetivos del estudio. </li></ol> 3. Análisis para confirmar el silenciamiento de genes por RT-PCR. <ol><li> Diseccionar las glándulas salivales y las vísceras de las garrapatas individuales de los grupos de control de inyección y dsRNA inyectado después de la alimentación. </li><li> Extraer el ARN total de muestras de tejidos individuales. </li><li> Analizar las transcripciones de genes objetivo en los distintos tejidos en tiempo real de RT-PCR y normalizar los niveles de ARN 16S contra la garrapata rRNA utilizando el método de genNorm (método DDCT implementado por Bio-Rad Edition iQ5 estándar, versión 2.0). </li><li> Ejecutar las curvas de disociación en la final de la reacción para garantizar que sólo un amplicón se forma y que la desnaturalizan los amplificados constantemente en el mismo rango de temperatura para cada muestra. </li><li> Comparar los niveles de ARNm (normalizaron los valores Ct) entre el control y con inyección de dsRNA inyección de garrapatas con el Student `s t-test (P = 0,05). </li></ol> 4. Los resultados representativos: El protocolo se describe en este documento se ha utilizado en nuestro laboratorio de RNAi en muchas especies diferentes de garrapatas ixodid (Tabla 1). La cantidad de dsRNA se inyecta en las garrapatas varía con el tamaño de la garrapata; grandes especies de garrapatas pueden alojar a un mayor volumen. Las garrapatas de control negativo debe ser inyectado con un dsRNA relacionados. DsRNAs varios como subolesin 14-19,22-25,27-32,34 y beta-actina 20,21 podrían ser utilizados como controles positivos. Tenga en cuenta que es importante lavar la jeringa entre los tratamientos para evitar la mezcla de soluciones de dsRNA. Si el protocolo se hace correctamente, menos del 5% de mortalidad se debe obtener de el procedimiento de inyección a las 24 horas. Un fenotipo típico después de caída de genes en las garrapatas se muestra en la Figura 3 con un grupo de garrapatas inyectadas con piscinas de dsRNA con el fin de la pantalla para marcar antígenos protectores. <table border="1"><tbody><tr><td> Especies de garrapatas </td><td> dsRNA inyección </td><td> Referencias </td></tr><tr><td> Ixodes scapularis </td><td> biblioteca de cDNA, subolesin, la actina, nucleotidasa, NF-kB, akirin </td><td> 21, 22, 29, 30 </td></tr><tr><td> Dermacentor variabilis </td><td> subolesin, GST, la ubiquitina, vATPase, selenoproteínas M y W2A, hematopoyéticas células madre / progenitoras de proteínas como la actina del proteasoma subunidad 26S, ferritin1, varisin, akirin </td><td> 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 </td></tr><tr><td> Dermacentor marginatus </td><td> subolesin </td><td> 22 </td></tr><tr><td> Amblyomma americanum </td><td> biblioteca de cDNA, subolesin, akirin </td><td> 17, 22, 30 </td></tr><tr><td> Amblyomma hebraeum </td><td> subolesin, voraxin </td><td> 28 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus sanguineus </td><td> Rs86, subolesin </td><td> 22, 23 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus microplus </td><td> GST, selenoproteína ubiquitina, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1A, proteínas de seda flagelliform, von Willebrand factor </td><td> 16, 18, 25, 27 </td></tr><tr><td> Rhipicephalus annulatus </td><td> subolesin ubiquitina, EF1A, GIII </td><td> 16 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Especies de garrapatas en el que el protocolo de RNAi ha sido utilizado. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Colocación de las garrapatas, lado ventral hacia arriba, en la cinta doble adhesiva adherida a una lámina de cera dental rojo. Las garrapatas son colocados en grupos de 5, después de que una pequeña tira de cinta adhesiva se coloca sobre el aparato bucal con el fin de proteger aún más las garrapatas al tiempo que permite la inyección para observar el cuerpo de la garrapata durante la inyección. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. El procedimiento de inyección incluyen (a) perforar el cuadrante inferior derecho del exoesqueleto marque con una insulina de syringe equipado con una aguja de calibre 29 con el fin de crear un sitio de la inyección, (b) la inyección inmediata de la dsRNA en este sitio con una jeringa Hamilton con una aguja de calibre 33, que (c) muy probablemente se traducirá en alguna fuga de la hemolinfa de garrapatas / líquidos. <img src="/files/ftp_upload/2474/2474fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un panel de seis grupos de garrapatas en el que se utilizó RNAi para la detección de antígenos protectores garrapata Amblyomma americanum en. Los cambios fenotípicos en las garrapatas se pueden ver cuando se compara con el control positivo subolesin ARN de interferencia y el control negativo dsRNA relacionados. En este experimento, el efecto de RNAi en la mortalidad de garrapatas, pesos y la oviposición de cada grupo se analizaron estadísticamente.

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<li>Kocan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transovarial+silencing+of+the+subolesin+gene+in+three-host+ixodid+tick+species+after+injection+of+replete+females+with+subolesin+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA.</a> Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).</li>
<li>de la Fuente, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+tick-pathogen+interface+for+novel+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies.</a> Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).</li>
<li>Kurscheid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+tick+RNAi+pathway+by+comparative+genomics+and+reverse+genetics+screen+of+targets+with+known+loss-of-function+phenotypes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila.</a> BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).</li>
</ol>

Aunque otros métodos han sido descritos por RNAi en pasos de 14, 33, la inyección de dsRNA se describe aquí es el más utilizado en los dos sin alimento (Tabla 1) y se alimentan las garrapatas 16,25,34. ARNi ha demostrado ser una herramienta valiosa para el estudio de la función de marcar los genes, la caracterización de la interfaz de garrapata-patógeno y la detección y caracterización de antígenos de garrapatas de protección 14,35. En particular, el ARNi se ha convertido en la herramienta más valiosa para el análisis funcional de las garrapatas 35. Metodológicamente, el ARNi es probable que evolucionar hacia métodos más eficientes que permitan caída de genes en un gran número de personas. El mecanismo de dsRNA inducida por RNAi en las garrapatas debe ser refinado para contribuir a una mejor comprensión y utilización de este enfoque genético de esta especie 35,36. La extensión de los efectos fuera del objetivo de RNAi en las garrapatas es también una cuestión importante que debe abordarse la cuestión 14,27. Por último, el ARNi es muy probable que hagan contribuciones integral para el estudio de la regulación de genes y marque la biología de sistemas y de la garrapata-patógeno y la interfaz puede tener un impacto en el desarrollo de vacunas para controlar la infestación por garrapatas y la transmisión de enfermedades transmitidas por garrapatas patógenos.

<table><tbody><tr><td>Sistema Access RT-PCR</td><td>Promega</td><td>A1250</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación Purelink PCR</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-02</td><td></td></tr><tr><td>Kit Megascript RNAi</td><td>Ambion</td><td>AM1626M</td><td></td></tr><tr><td>Cera roja para dentista</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72674</td><td></td></tr><tr><td>Vasos plásticos, 1,25 oz y tapas</td><td>Solo Cup Company, Urbana Ill.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Varios</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina</td><td>Monoject</td><td></td><td>Equipada con una &amp;#189;&quot;, aguja de calibre 29</td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>701SN,33/.375&amp;#8221;/45DGR</td><td>Hecho a medida</td></tr><tr><td>TriReagente</td><td>Sigma</td><td>93289</td><td></td></tr><tr><td>Kit iScript One-Step RT-PCR con SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8892</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>Varios</td><td>Consulte &lt;a href=&quot;http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

la interferencia de arn en las garrapatas

RNA Interference in Ticks

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados de los animales salvajes y domésticos y los seres humanos, y se considera que todo el mundo segundo a los mosquitos como vectores de enfermedades humanas 1 y los vectores más importantes que afectan a la industria ganadera a nivel mundial 2. Las garrapatas se clasifican en la subclase Acari, Parasitiformes orden, suborden Ixodida y se distribuyen en todo el mundo desde el Ártico a las regiones tropicales 3. A pesar de los esfuerzos para controlar la infestación por garrapatas, estos ectoparásitos siguen siendo un problema grave para la salud humana y animal 4,5. ARN de interferencia (RNAi) 6 es un ácido nucleico enfoque basado en genética inversa que consiste en la interrupción de la expresión génica con el fin de determinar la función del gen o su efecto sobre una vía metabólica. Pequeños RNAs de interferencia (siRNA) son las moléculas efectoras de la vía de RNAi que se inicia por ARN de doble cadena (dsRNA) y los resultados en una secuencia específica de potentes degradación de los ARNm citoplasmático que contiene la misma secuencia que el gatillo dsRNA 7-9. Post-transcripcional mecanismos de silenciamiento de genes iniciada por dsRNA se han descubierto en todos los eucariotas estudiados hasta ahora, y RNAi se ha desarrollado rápidamente en una variedad de organismos como una herramienta para estudios de genómica funcional y otras aplicaciones 10. RNAi se ha convertido en el más utilizado silenciamiento génico técnica en las garrapatas y otros organismos en distintos criterios para la manipulación genética no están disponibles o no son fiables 5,11. La caracterización genética de las garrapatas se ha limitado hasta la reciente aplicación de RNAi 12,13. En el poco tiempo que el ARNi ha estado disponible, ha demostrado ser una herramienta valiosa para estudiar la función génica garrapata, la caracterización de la interfaz de garrapata-patógeno y la detección y caracterización de antígenos de garrapatas de protección 14. En esto, un método para RNAi a través de la inyección de dsRNA en las garrapatas alimentadas se describe. Es probable que el conocimiento obtenido a partir de este enfoque experimental contribuirá notablemente a la comprensión de los sistemas básicos biológicos y el desarrollo de vacunas para controlar las infestaciones de garrapatas y prevenir la transmisión de patógenos transmitidos por garrapatas 15-19.

Un método de interferencia de ARN (RNAi), mediante la inyección de dsRNA en las garrapatas alimentadas se describe. El ARNi es el más utilizado silenciamiento génico técnica en las garrapatas, donde ha sido el uso de otros métodos de manipulación genética limitada.

La interferencia de ARN en las garrapatas

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados de animales silvestres, domésticos y humanos, y se consideran los segundos vectores más importantes a nivel mundial, después de los mosquitos...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la técnica de interferencia de ARN en garrapatas mediante inyección. Esto se logra primero sintetizando ARN de doble cadena del gen o genes de interés. Luego, el ARN se inyecta en las garrapatas, las cuales se mantienen posteriormente en una cámara de humedad durante 24 horas.Después de este período de mantenimiento, se permite que las garrapatas se alimenten de un animal como una oveja. Se determinan parámetros de alimentación tales como peso, muda y posición de los huevos, así como la expresión del gen o genes diana mediante R-T-P-C-R en tiempo real. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran el efecto del silenciamiento de los genes diana sobre la biología de las garrapatas, mediante la evaluación de parámetros biológicos de las garrapatas y la expresión génica por R-T-P-C-R en tiempo real.Nuestro grupo trabaja con garrapatas, tratando de caracterizar los eventos moleculares en la interfaz garrapata-patógeno para utilizar esta información básica en el desarrollo de métodos para el control de la infestación por garrapatas y la transmisión de patógenos a humanos y animales. La interferencia de ARN ha surgido como una herramienta esencial en esta investigación, ya que es el único método disponible para la manipulación genética de las garrapatas. La función de muchos genes de las garrapatas es desconocida.La interferencia de ARN permite definir el papel de los genes de las garrapatas y la expresión génica en muchos aspectos de la biología de las garrapatas, incluyendo el apareamiento, la reproducción, la alimentación, la digestión, la función de las glándulas salivales y la competencia vectorial de las garrapatas para la transmisión de patógenos. El procedimiento será demostrado por el equipo de interferencia de ARN en garrapatas de nuestro laboratorio, el Dr. Ed Lewin, el estudiante de posgrado Busby y yo mismo. Para generar ARN de doble cadena, primero sintetice cebadores oligonucleotídicos que contengan secuencias promotoras de T siete para la transcripción in vitro de ARN.Por ejemplo, lesión variable del centro dérmico. Utilice los cebadores de oligonucleótidos D ocho A a T 75 y D ocho DVT 73 mostrados aquí. Amplifique el gen diana mediante R-T-P-C-R utilizando 10 picomoles de cada cebador de oligonucleótido y de 1 a 10 nanogramos de ARN total de garrapata.A continuación, purifique el producto de PCR. Luego utilice ocho microlitros o aproximadamente 100 nanogramos para sintetizar ARN de doble cadena. Para preparar las garrapatas para la inyección, primero lave las garrapatas en la siguiente serie de soluciones: agua del grifo, peróxido de hidrógeno al 3%, agua destilada dos veces, etanol al 70% y dos lavados finales con agua destilada.Realice cada lavado en un tubo desechable de centrífuga de 50 mililitros agitando. Luego vierta la solución a través de una malla fina de alambre. Deje secar las garrapatas sobre toallas de papel y, a continuación, divídjalas en alícuotas de grupos de 20 a 50, según el experimento.Coloque cada grupo en un vaso plástico de 1,25 onzas con tapa ajustada y etiquete cada vaso con el grupo experimental. A continuación, forme un equipo de ARNi compuesto por tres personas que llevarán a cabo el proceso de inyección. La primera persona coloca cada garrapata sobre cinta adhesiva doble adherida a una hoja de cera dental roja de tres por seis pulgadas.La segunda persona inyecta las garrapatas y la tercera monitorea las garrapatas después de la inyección, sopla dióxido de carbono sobre ellas para activarlas, cuenta y transfiere las garrapatas vivas a vasos etiquetados con el número del grupo experimental. Todos los miembros del equipo deben usar guantes desechables. Para comenzar el proceso de inyección de garrapatas, capture una garrapata utilizando pinzas finas Dumont y colóquela con el lado ventral hacia arriba sobre cinta adhesiva doble colocada sobre una lámina de cera dental roja. Posicione las garrapatas en grupos de cinco. Coloque una pequeña tira de cinta adhesiva sobre las piezas bucales de las cinco garrapatas.Con el fin de restringirlos aún más, deje expuesta la mayor parte del cuerpo para que el inyector de garrapatas pueda observar el proceso de inyección. Para inyectar la garrapata, perfore un orificio en el cuadrante inferior derecho de la superficie ventral del exoesqueleto utilizando una jeringa de insulina mono-eject con una aguja de 29 gauge y media pulgada. A continuación, inyecte inmediatamente a las garrapatas entre 0,2 y 0,5 microlitros de solución de ARN bicatenario utilizando una jeringa Hamilton modificada y una aguja de 33 gauge de una pulgada con punta biselada de 45 grados; coloque bien la aguja dentro de la cavidad de la garrapata para asegurar la colocación y retención del ARN bicatenario.Aunque se libere líquido tras la inyección, colocar profundamente la aguja durante la inyección garantizará que se deposite suficiente ARN bicatenario en la cavidad de la garrapata para inducir el silenciamiento génico; debe tenerse cuidado de no excederse. Inyecte las garrapatas, ya que esto provocará pérdida de hemolinfa y muerte de la garrapata. Inmediatamente después de inyectarlas, levántelas del adhesivo doble con pinzas finas y colóquelas en un recipiente plástico de recuperación.Las garrapatas permanecerán inactivas brevemente después de la inyección, pero pronto deberían comenzar a moverse por el recipiente. Active las garrapatas soplando dióxido de carbono sobre ellas. Una vez que las garrapatas estén moviéndose y activas, la herida de inyección sanará rápidamente y es muy probable que sobrevivan.Cuente las garrapatas en cada grupo experimental y coloque cada grupo en un vaso plástico etiquetado con una tapa ajustada herméticamente. Reemplace cualquier garrapata que muera en el grupo actual antes de inyectar el siguiente grupo experimental. Limpie la jeringa Hamilton antes de inyectar el siguiente grupo experimental llenando y luego expulsando la jeringa con peróxido de hidrógeno al 3% fresco.15 veces seguido de 15 lavados con agua estéril. Tenga cuidado de no doblar el émbolo de la jeringa Hamilton, de lo contrario el émbolo no se moverá suavemente ni responderá al tacto suave necesario para la inyección en garrapatas. Después de la inyección, coloque las garrapatas en una cámara con un recipiente lleno de agua y sulfato de potasio, lo cual mantiene una alta humedad y las conserva durante un día.A continuación, coloque garrapatas individuales en celdas de alimentación fijadas a un cordero y permita que se alimenten junto con un número igual de garrapatas macho o hembra no inyectadas, según el sexo que no haya sido inyectado. Recolecte y retire las garrapatas hembra de la celda de alimentación tras completar la alimentación, aproximadamente a los 10 días o cuando las hembras control hayan abandonado al hospedador. Incube cada grupo de garrapatas en una cámara de humedad hasta la finalización de la oviposición. Evalúe la oviposición por grupo pesando la masa de huevos producida por todas las garrapatas de un grupo, con el fin de evaluar el fenotipo de las garrapatas tras la alimentación.Determine el número de garrapatas que sobrevivieron y calcule el peso de las garrapatas, así como la posición de los óvulos y la fertilidad de los huevos. Dependiendo del gen objetivo y los objetivos del estudio, se pueden realizar otros análisis para confirmar el silenciamiento génico mediante R-T-P-C-R. Después de la alimentación, diseque las glándulas salivales y los intestinos de garrapatas individuales de los grupos inyectados con control y con ARN bicatenario, y luego extraiga el ARN total de las muestras individuales de tejido.Analice los transcritos del gen diana en tejidos individuales mediante R-T-P-C-R en tiempo real y normalice los niveles de ARN frente al ARN ribosómico 16 s de la garrapata. Utilizando el método gene norm, realice curvas de disociación al final de la reacción para asegurar que se forme un único amplicón y que los amplicones se desnaturalicen consistentemente en el mismo rango de temperatura para cada muestra; compare los valores de CT normalizados para los niveles de ARNm entre las garrapatas inyectadas con control y las inyectadas con ARN bicatenario utilizando la prueba t de Student.El protocolo descrito aquí se ha utilizado en nuestro laboratorio para ARNi en muchas especies diferentes de garrapatas exóticas. La cantidad de ARN bicatenario inyectado en las garrapatas varía según el tamaño de la garrapata. Las especies de garrapatas más grandes pueden alojar un volumen mayor.Las referencias se pueden encontrar en la sección escrita que acompaña el protocolo. Si el protocolo se realiza correctamente, se debería obtener una mortalidad inferior al 5 % tras el procedimiento de inyección después de 24 horas. Aquí se muestra un fenotipo típico tras la inhibición génica en garrapatas, en el que un grupo de garrapatas fue inyectado con mezclas de ARN bicatenario que se utilizaron para tamizar antígenos protectores de garrapatas.En garrapatas examinadas mediante microscopía óptica, puede observarse degeneración celular en los tejidos de las garrapatas. Los cambios fenotípicos también pueden ir acompañados de pérdida de función. Por ejemplo, el ARNi de SUBIN produce machos estériles que no pueden aparearse con éxito con las hembras tras la interferencia del ARN y las garrapatas.Se pueden utilizar otros métodos para determinar el impacto del silenciamiento génico en la expresión génica y proteica y en la biología de las garrapatas, incluyendo R-T-P-C-R en tiempo real, microscopía electrónica de transmisión, microscopía confocal, genómica o proteómica. La interferencia por ARN también se puede realizar en cultivos celulares de garrapatas y proporciona un método in vitro para el estudio de las interacciones entre patógenos y células de garrapatas.

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.

Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas

La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vectores más comúnmente reportados en América del Norte. El agente causante, Borrelia burgdorferi es una bacteria espiroqueta transmitida por garrapatas ixódidas. Transmisión y detección de la infección en modelos animales se optimiza mediante el uso de la alimentación de la señal, que se describe aquí.

La alimentación de las garrapatas de los animales para Transmisión y xenodiagnóstico en Lyme Investigación de Enfermedades

La producción de garrapatas sanos criados en el laboratorio es esencial para los estudios sobre la biología de la señal, y de la señal de patógenos interacciones. Aquí se demuestra un protocolo sencillo para la alimentación de la garrapata inmadura que es rentable y menos estresante para ratones.

La cría<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; La garrapata de patas Negro: La alimentación de los estados inmaduros de ratones

PCR anidada es una técnica sensible, específica y directa que se puede aplicar a garrapata que extractos de ADN para sonda de burgdorferi de Borrelia, el agente causativo de la enfermedad de Lyme. El experimento inicial de PCR utiliza cartillas gene-específicas para generar amplicones de largo, que luego se convierten en plantillas para una posterior reacción usando cebadores internos.

Detectar el Spirochete de la enfermedad de Lyme, Burgdorferi de Borrelia, de garrapatas mediante PCR anidado

Aquí presentamos un protocolo de secuenciación de próxima generación para la secuenciación de rRNA 16S que permite la identificación y caracterización de comunidades microbianas en vectores. Este método implica la extracción de ADN, amplificación y código de barras de muestras mediante PCR, secuenciación en una celda de flujo y bioinformática para que coincida con los datos de la secuencia a la información filogenética.

Caracterización de microbioma marca Next-Generation 16S rRNA Amplicon ordenando

En este estudio, se desarrolló un sistema de alimentación para las etapas ninfa y larval de la garrapata dura utilizando una cápsula unida al ratón de laboratorio. La cápsula de alimentación está hecha de materiales flexibles y permanece firmemente unida al ratón durante al menos una semana y permite un monitoreo cómodo de la alimentación de las garrapatas.

Un modelo basado en cápsulas para la infestación por etapas inmaduras de garrapatas duras en ratones de laboratorio

El presente protocolo describe el aislamiento de microARN de las glándulas salivales de las garrapatas y las vesículas extracelulares purificadas. Este es un procedimiento universal que combina reactivos y suministros de uso común. El método también permite el uso de un pequeño número de garrapatas, lo que resulta en microARN de calidad que se pueden secuenciar fácilmente.

Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

Aquí se presenta un método para alimentar garrapatas con sangre in vitro a través de un sistema de membrana artificial para permitir la congestión parcial o total de una variedad de etapas de la vida de las garrapatas.

Alimentación por membrana artificial contra garrapatas para Ixodes scapularis

En este artículo se presenta la metodología para la exposición de humanos a larvas de Ixodes scapularis para investigación clínica. La técnica es relativamente simple, tolerable por los voluntarios de investigación, y puede ser modificada de acuerdo con las necesidades experimentales. Dicha investigación con seres humanos debe llevarse a cabo bajo protocolos de estudio clínico aprobados por las autoridades reguladoras correspondientes.

Un modelo para la exposición experimental de humanos a larvas de garrapatas Ixodes scapularis

Aquí, presentamos un protocolo para recolectar saliva, hemolinfa, glándulas salivales e intestino medio, después de la disección de una garrapata alimentada individualmente, para estudiar la localización específica del tejido de los patógenos transmitidos por garrapatas para avanzar en la comprensión de la competencia del vector y las interacciones patógeno-microbioma.

Extracción de saliva, hemolinfa, glándulas salivales e intestino medio de garrapatas individuales (Acari: Ixodidae)

Este método describe el desarrollo de un sistema de alimentación sanguínea in vitro para garrapatas que incorpora una cámara impresa en 3D y una membrana de silicona fabricada en laboratorio. El sistema permite la alimentación artificial de garrapatas, facilitando el muestreo en diversas fases de alimentación y utilizando bajos volúmenes de sangre, proporcionando una herramienta invaluable para estudiar garrapatas ixódidas.

Sangre de garrapata alimentándose a través de una membrana artificial en una cámara impresa en 3D en investigación de garrapatas Ixodid

Aprende la técnica de interferencia de ARN en garrapatas mediante inyección de ARN de doble cadena. Este método permite estudiar la función génica y desarrollar estrategias para controlar enfermedades transmitidas por garrapatas.

La interferencia de ARN en las garrapatas

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