La interferencia de ARN en las garrapatas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la técnica de interferencia de ARN en garrapatas por inyección. Esto se logra sintetizando primero el ARN bicatenario del gen o genes de interés. Luego, el ARN se inyecta en las garrapatas, después de lo cual se mantienen en una cámara de humedad durante 24 horas.

Después de este período de retención, se permite que las garrapatas se alimenten de un animal, como una oveja finalmente garrapata. Se determinan los parámetros de alimentación, como el peso, la muda y la posición de los óvulos, y la expresión del gen o genes objetivo de interés mediante R-T-P-C-R en tiempo real. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran el efecto del silenciamiento de genes específicos en la biología de las garrapatas mediante la evaluación de los parámetros biológicos de las garrapatas y la expresión génica mediante R-T-P-C-R en tiempo real.

Nuestro grupo trabaja con garrapatas tratando de caracterizar eventos moleculares en la interfaz patógeno de garrapatas para utilizar esta información básica para desarrollar métodos para el control de la infestación de garrapatas y la transmisión de patógenos a humanos y animales. El ARN de interferencia se ha convertido en una herramienta esencial en esta investigación porque es el único método disponible para la manipulación genética de las garrapatas. Se desconoce la función de muchos genes de garrapatas.

La interferencia de ARN nos permite definir el papel de los genes y la expresión génica de las garrapatas en muchos aspectos de la biología de las garrapatas, incluido el apareamiento, la reproducción, la alimentación, la digestión, la función de las glándulas salivales y la competencia de los vectores de garrapatas para la transmisión de patógenos. El equipo de interferencia de ARN de garrapatas de nuestro laboratorio, el Dr. Ed Lewin, estudiante de posgrado y Busby y yo, demostraremos el procedimiento. Para generar ARN bicatenario, primero sintetizar cebadores de oligonucleótidos que contengan siete secuencias promotoras para la transcripción in vitro de ARN.

Por ejemplo, el centro de la derma vari lesina. Utilice los cebadores de oligonucleótidos D ocho, A, T 75 y D ocho, DVT 73 que se muestran aquí. Amplifique el gen objetivo por R-T-P-C-R utilizando 10 picomoles de cada cebador de oligonucleótidos y de uno a 10 nanogramos de ARN total de garrapata.

A continuación, purifique el producto PCR. A continuación, utilice ocho microlitros o aproximadamente 100 nanogramos para sintetizar ARN bicatenario. Para preparar primero las garrapatas para la inyección, lave las garrapatas en la siguiente serie de soluciones, agua del grifo con peróxido de hidrógeno al 3%, agua destilada al 70% y dos lavados finales con agua destilada.

Realice cada lavado en un tubo de centrífuga desechable de 50 mililitros agitando. A continuación, decantar la solución a través de una criba de alambre de malla fina. Bloquee las garrapatas para secarlas con toallas de papel, luego alícuota las garrapatas en grupos de 20 a 50 según el experimento.

Coloque cada grupo en un vaso de plástico de 1.25 onzas con una tapa hermética y etiquete cada vaso con el grupo experimental. A continuación, reúna un equipo de ARNi formado por tres personas que llevarán a cabo el proceso de inyección. La primera persona coloca cada garrapata en una cinta adhesiva doble adherida a una hoja de cera dental roja de tres por seis pulgadas.

La segunda persona inyecta las garrapatas y la tercera las monitorea después de la inyección, respira dióxido de carbono en las garrapatas para activarlas, y cuenta y transfiere las garrapatas vivas a tazas etiquetadas con el número de grupo experimental. Todos los miembros del equipo deben usar guantes desechables Para comenzar el proceso de inyección de garrapatas, capture una garrapata con pinzas finas dumont y colóquela con el lado ventral hacia arriba sobre cinta adhesiva doble adherida a la hoja de cera dental roja Coloque las garrapatas en grupos de cinco. Coloque una pequeña tira de cinta adhesiva sobre las partes de la boca de las cinco garrapatas.

Para restringirlos aún más, deje la mayor parte del cuerpo expuesto para que el inyector de garrapatas pueda observar el proceso de inyección. Para inyectar la garrapata, perfore un orificio en el cuadrante inferior derecho de la superficie ventral del exoesqueleto con una jeringa de insulina monoeyección equipada con una aguja de media pulgada de calibre 29. A continuación, inyecte inmediatamente las garrapatas con 0,2 a 0,5 microlitros de solución de ARN bicatenario utilizando una jeringa Hamilton hecha a medida y una aguja de una pulgada de calibre 33 con una punta biselada de 45 grados, coloque la aguja bien en la cavidad de la garrapata para asegurar la colocación y retención del ARN bicatenario.

A pesar de que se libera líquido después de la inyección, la colocación profunda de la aguja para la inyección asegurará que se deposite suficiente ARN bicatenario en la cavidad de la garrapata para causar el silenciamiento génico, se debe tener cuidado de no sobreentrar. Inyecte las garrapatas, lo que causará la pérdida de hemolinfa y la muerte de la garrapata. Inmediatamente después de inyectar las garrapatas, recójalas de la cinta adhesiva doble con las pinzas finas y colóquelas en un recipiente de plástico de recuperación.

Las garrapatas permanecerán brevemente inactivas después de la inyección, pero pronto comenzarán a arrastrarse por el plato. Activa las garrapatas respirando dióxido de carbono sobre ellas. Una vez que las garrapatas estén arrastrándose y activas, la herida de la inyección sanará rápidamente y lo más probable es que sobrevivan.

Cuente las garrapatas en cada grupo experimental y coloque cada grupo en un vaso de plástico etiquetado con una tapa bien ajustada. Reemplace las garrapatas que mueran en el grupo actual antes de inyectar el siguiente grupo experimental. Limpie la jeringa Hamilton antes de inyectar el siguiente grupo experimental llenando y luego expulsando la jeringa con peróxido de hidrógeno fresco al 3%.

15 veces seguidas de 15 lavados con agua estéril. Tenga cuidado de no doblar el émbolo de la jeringa Hamilton, de lo contrario, el émbolo no se moverá suavemente y no responderá al tacto suave requerido para la inyección de garrapatas. Después de la inyección, coloque las garrapatas en una cámara con un recipiente lleno de agua y sulfato de potasio, lo que mantiene una alta humedad y las mantiene durante un día.

A continuación, coloque las garrapatas individuales en las celdas de alimentación de garrapatas pegadas a una oveja y permítales alimentarse con un número igual de garrapatas macho o hembra no inyectadas, del sexo que no se inyectó. Recoja y agite las garrapatas hembras de la celda de alimentación después de que completen la alimentación durante aproximadamente 10 días o cuando las hembras de control hayan caído, el huésped incubará cada grupo de garrapatas en la cámara de humedad hasta que se complete la posición de los huevos. Evalúe la posición de los óvulos por grupo pesando la masa de huevos producida por todas las garrapatas de un grupo para evaluar el fenotipo de la garrapata después de alimentarse.

Determine el número de garrapatas que sobrevivieron y calcule el peso de la garrapata, así como la posición de los óvulos y la fertilidad de los óvulos. Dependiendo del gen objetivo y de los objetivos del estudio, se pueden realizar otros análisis para confirmar el silenciamiento génico por R-T-P-C-R. Después de alimentarse, diseccione las glándulas salivales y los intestinos de las garrapatas individuales de los grupos inyectados de control e inyectados de ARN bicatenario, y luego extraiga el ARN total de las muestras de tejido individuales.

Analice las transcripciones de genes diana en tejidos individuales mediante R-T-P-C-R en tiempo real y normalice los niveles de ARN frente al ARN ribosómico de tick 16 s. Usando el método de la norma génica, ejecute curvas de disociación al final de la reacción para asegurarse de que solo se forme un amplicón y que los amplicones se desnaturalicen constantemente en el mismo rango de temperatura para cada muestra, compare los valores normalizados de CT para los niveles de ARNm entre el control inyectado y el bicatenario. Garrapatas inyectadas con ARN mediante la prueba T del estudiante.

El protocolo descrito aquí se ha utilizado en nuestro laboratorio para el ARNi en muchas especies diferentes de garrapatas exot. La cantidad de ARN bicatenario inyectado en las garrapatas varía con el tamaño de la garrapata. Las especies de garrapatas más grandes pueden acomodar un volumen mayor.

Las referencias se pueden encontrar en la parte escrita adjunta del protocolo. Si el protocolo se realiza correctamente, se debe obtener menos del 5% de mortalidad del procedimiento de inyección después de 24 horas. Aquí se muestra un fenotipo típico después de la eliminación de genes en garrapatas, donde se inyectó un panel de garrapatas con grupos de ARN bicatenario que se utilizaron para detectar antígenos protectores de garrapatas.

En las garrapatas que se examinan por microscopía óptica, se puede observar degeneración celular en los tejidos de las garrapatas. Los cambios fenotípicos también pueden ir acompañados de pérdida de la función. Por ejemplo, el ARN de SUBIN da como resultado machos estériles que no pueden aparearse con éxito con las hembras debido a la interferencia del ARN y las garrapatas.

Se pueden utilizar otros métodos para determinar el impacto del silenciamiento génico en la expresión de genes y proteínas y en la biología de las garrapatas, incluyendo R-T-P-C-R en tiempo real, microscopía electrónica de luz o confocal. Genómica o proteómica. La interferencia de ARN también se puede realizar en cultivos de células de garrapata y proporciona un método in vitro para el estudio de las interacciones entre patógenos de células de garrapata.