Biomoleculares de detección utilizando el sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS)

El objetivo general del siguiente experimento consiste en cuantificar la unión de anticuerpos a antígenos inmovilizados en superficie mediante una plataforma de detección sensible y sin marcadores denominada Iris. Esto se logra primero preparando una matriz de sondas de prueba y control sobre una superficie uniforme de dióxido de silicio funcionalizada químicamente para capturar proteínas diana a partir de una solución. Las sondas inmovilizadas pueden ser anticuerpos o antígenos, ADN o ARN, o cualquier otro tipo de macromolécula compatible con las químicas de superficie funcionalizadas, poliméricas o sane.

La micromatriz preparada se incuba luego con una muestra que contiene las proteínas de interés, lo que permite la unión bajo las condiciones especificadas por el investigador. A continuación, se obtienen imágenes de toda la matriz de sensores a diferentes longitudes de onda de luz. Con el sistema IRIS, las intensidades reflejadas de cada píxel se procesan mediante algoritmos codificados personalizados.

Con el fin de cuantificar la cantidad de biomaterial unido a cada condición de prueba o control, se obtienen resultados posteriores a la incubación que muestran una detección eficaz y una cuantificación absoluta de anticuerpos en una mezcla compleja, basada en mediciones interferométricas sin etiqueta de este sistema. A partir de más de una década de investigación y desarrollo en dispositivos ópticos de interferencia y cavidades de resina, desarrollamos este nuevo método que podría superar muchos de los problemas de confusión que encontramos con nuestros sistemas anteriores de biosensores sin etiqueta. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de recopilación de datos requieren que se sigan procedimientos correctos de normalización y control de calidad. Para garantizar una adquisición de datos precisa y repetible.

Para recubrir simultáneamente sus sustratos de dióxido de silicio con copos autoabsorbidos de NAS dmma, primero prepare la solución polimérica añadiendo 100 miligramos del polímero a cinco mililitros de agua desionizada. Luego añada cinco mililitros de sulfato de amonio al 40 % saturado para obtener una concentración final de sulfato de amonio de 0,92 molar. Sumerja los chips en la solución polimérica durante 30 minutos en un agitador tras la incubación.

Lave minuciosamente los chips con agua desionizada, seque los chips con gas argón o nitrógeno y luego sométalos a horneado a 80 grados Celsius durante 15 minutos. Almacene los chips de sustrato recubiertos con polímero en un ambiente seco, como un desecador al vacío, durante un período de dos a tres meses hasta el procedimiento de impresión de las sondas para diluir cada sonda. Primero, determine el volumen correcto de la solución stock de la sonda y del tampón para alcanzar la concentración final deseada.

Un experimento típico utiliza antígeno o IgG en una concentración de 0,5 miligramos por mililitro en solución salina tamponada con fosfato, en la cantidad calculada de cada solución stock de sonda, añadiéndola a tubos pequeños de extremo redondo que contienen la cantidad deseada de tampón PBS, mezclando las soluciones. A continuación, se pipetea la soluciones de sonda en una placa de 96 pocillos de baja unión a proteínas, que se utilizará como placa fuente para el dispensador. Después, configure los parámetros de impresión para la matriz impresa determinando el número de réplicas de cada condición por cuadrícula.

La distribución en cuadrícula establece el número de cuadrículas replicadas y la ubicación deseada de las gotas en el chip. Coloque el sustrato y la placa de origen en el dispensador y luego verifique los frascos de desecho y de suministro. Inicie la corrida de impresión.

Después de finalizar la aplicación, coloque el sustrato en un ambiente de alta humedad durante la noche para permitir que avance el proceso de inmovilización y desactivación tras la incubación. Lave los sustratos con agitación colocando primero el chip en PBS con tween al 0,1 % durante tres minutos, en tres ocasiones separadas. A continuación, realice tres incubaciones de tres minutos en PBS y luego en agua desionizada.

Si se realiza una medición en seco, seque completamente el chip con gas argón. Desactive los grupos NHS restantes en la superficie del copolímero sumergiendo los chips en una solución de 50 milimolar de etanolamina con el pH ajustado a 7,4 durante 30 minutos mientras están en la placa agitadora. Enjuague completamente la etanolamina utilizando PBS y luego agua desionizada antes de comenzar el procedimiento de incubación.

Prepare una solución con la concentración adecuada de proteína diana en PBS para esta demostración. Se utiliza 500 nanogramos por mililitro de albúmina sérica humana y se incluye un volumen equivalente de tampón sin la proteína diana para la incubación de control negativo. El sistema de iris consta de algunos elementos básicos, como una fuente de iluminación, componentes ópticos para iluminar adecuadamente la matriz de sondas sensoras, una cámara para registrar las intensidades de luz reflejada y una plataforma donde se coloca la muestra para las mediciones.

Comience con un escaneo de espejo de silicio de un chip de silicio limpio y desnudo para normalizar todos los datos recopilados posteriormente antes de realizar el escaneo. Prepare el sistema de iris ajustando los parámetros para el experimento. Esto incluye medir el histograma de intensidades de luz que registra la cámara y establecer el tiempo de exposición para intensidades óptimas.

Después del escaneo de normalización, cargue la matriz de sondas preparada en el sistema iris y realice la configuración como antes, ajuste el enfoque para obtener una imagen correcta de la superficie del sustrato. Asegúrese de que la platina de la muestra esté nivelada inspeccionando los histogramas registrados de las intensidades de luz reflejada. Finalmente, elija un nombre de archivo para guardar los datos.

Inicialice el software para escanear la matriz, lo cual ilumina la superficie a diferentes longitudes de onda varias veces y promedia las imágenes recopiladas. Se determina el punto óptico alto inicial para enseñar, lo que permite un análisis adecuado de los cambios en la masa sobre la superficie después de la incubación tras el escaneo inicial; sumerja el chip en la solución de incubación preparada durante una hora en una placa agitadora. El tiempo de incubación puede variar considerablemente según el nivel de vegetación, la concentración del objetivo que se detecta y las afinidades del par sonda-objetivo.

Después de la incubación, repita el procedimiento de lavado tal como se realizó previamente. Escanee la misma matriz de proteínas utilizando el sistema iris para obtener imágenes posteriores a la incubación y compararlas con las anteriores a la incubación. Este proceso puede repetirse para diferentes pasos de incubación si es necesario.

Por ejemplo, en un formato de ensayo tipo sándwich en el que se utiliza un anticuerpo secundario, ajuste las imágenes obtenidas de cada escaneo de iris mediante software comercialmente disponible para generar una imagen del sondaje que contenga la formación de espesor óptico. Se puede realizar un análisis cualitativo rápido de la unión restando las imágenes posteriores e iniciales a la incubación. La unión aparecerá como un cambio en la intensidad en aquellos puntos donde se observaron cambios de masa.

Para el análisis cuantitativo, determine las densidades de masa de cada punto en comparación con el fondo, promediando la información de espesor óptico para cada píxel dentro de un punto y para un anillo exterior al punto. Luego realice una comparación directa de estas dos áreas mostradas aquí. Como ejemplo, esquema del sustrato de silicio estratificado con iris de dióxido de silicio, con un arreglo representativo de anticuerpos depositado.

Cada conjunto de anticuerpos se deposita por duplicado con especificidad para un epítopo diferente, dirigiéndose a una proteína distinta. Se representan como ejemplo dos virus completos diferentes y una proteína viral. Los anticuerpos de control negativo dependen del ensayo y pueden ser inespecíficos y/o específicos del virus.

Aquí se muestra un ejemplo de resultados cualitativos para la unión de anticuerpos específicos de albúmina sérica humana a una matriz de manchas de HSA y manchas control de IgG de conejo, como se observa aquí. Después de ajustar y determinar el grosor óptico de las imágenes previas y posteriores a la incubación, puede crearse una imagen de diferencia para la matriz de unión con el fin de evaluar rápidamente la unión. Un análisis más riguroso cuantitativo revela que se observó un cambio medio en altura óptica de 2,05 y 0,13 nanómetros para las manchas de HSA y de IgG de conejo, respectivamente, con una concentración de incubación de anti-HSA de 500 nanogramos por mililitro.

Este gráfico de barras representa un ejemplo de los datos cuantitativos que pueden proporcionar las mediciones de iris. En este ejemplo, se presenta la dependencia de la unión de proteínas de la piel con respecto a la concentración de proteína y a la longitud de todos los ligamentos de doble cadena. Este gráfico de barras muestra las mediciones absolutas de altura óptica para las alturas iniciales del prop del ligamento inmovilizado y tras la incubación para la unión.

Concentraciones crecientes de la proteína Fur hasta 5, 100 y 200 nanomolares resultaron en un aumento de la unión a las sondas de ADN. Aquí se muestra la unión del dímero de la proteína Fur por ligamento de ADN de doble cadena. La unión del dímero aumentó significativamente a una concentración de 200 nanomolares de la proteína Fur, lo que sugiere un alto nivel de interacciones no específicas con todos los ligamentos o un mecanismo diferente para la unión de la proteína Fur, como la agregación de múltiples dímeros.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar con sustratos uniformes y limpios que tengan el espesor adecuado de óxido y mantener las muestras limpias manipulándolas cuidadosamente con pinzas. También es fundamental utilizar reactivos que se hayan almacenado adecuadamente y que se sepa que son funcionales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir acciones biomoleculares en un formato sin marcadores mediante la preparación de matrices de sondas funcionales sobre una superficie de dióxido de silicio, así como de la adquisición y análisis de datos utilizando el sensor de imagen de reflectancia interferométrica o iris.