Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la capacidad de reparación de la membrana tanto en el animal como en células aisladas. Se recolectan fibras musculares esqueléticas aisladas y se rodean con un medio que contiene el colorante FM 1-43. Luego, se utiliza un láser UV para irradiar y dañar una porción de la membrana celular, lo que permite la entrada del colorante en la célula.

Las células aisladas se transfectan con ADN plasmídico que expresa GFP MG 53, el cual se localizará en la membrana plasmática y el citosol de la célula. A continuación, se inserta la punta de un microelectrodo en la membrana C two C 12 para inducir daño. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la translocación del GFP MG 53 hacia el sitio de lesión.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que se requieren prácticas para dominar las técnicas de penetración con microelectrodos y aislamiento de fibras musculares. Quienes realizarán la demostración serán el Dr. Lin, nuestro director de laboratorio, el Dr. Wazu, investigador postdoctoral, Matt Orange, estudiante de posgrado, y la Dra. Shaza, profesora asistente de investigación en nuestro departamento. Para comenzar, coloque una bandeja o una almohadilla azul de laboratorio debajo de la cinta transportadora para recoger los desechos de los animales durante el experimento.

A continuación, ajuste el ángulo de la superficie de la cinta. Algunas cintas tienen un dispositivo integrado para ajustar la inclinación, mientras que otras requieren elevar la cinta mediante otros métodos. Por lo general, se utiliza una superficie plana o un ángulo entre siete y 15 grados cuesta arriba o cuesta abajo.

Acostumbre a los ratones colocándolos en la cinta sin encender la rejilla eléctrica y con el motor del cinturón en marcha, pero sin movimiento, durante 15 minutos. Tras el periodo de aclimatación, encienda la rejilla eléctrica de motivación. Inicie la cinta con una velocidad inicial de aproximadamente cinco metros por minuto. Aumente la velocidad de uno a dos metros por minuto cada minuto y permita que el animal realice un periodo de calentamiento de cinco minutos.

Repita este período de calentamiento todos los días durante tres a diez días para aumentar la conformidad durante las pruebas. Para realizar un ejercicio agudo de agotamiento, aumente progresivamente la velocidad de la cinta de correr hasta alcanzar una velocidad máxima y observe signos de agotamiento.

Se considera que un animal está agotado cuando pasa más de la mitad del tiempo fuera de la cinta rodante o cinco segundos consecutivos sobre la rejilla. Retire al ratón agotado y registre el tiempo total de carrera. Entrenamiento de resistencia.

Los protocolos de carrera comienzan con el mismo procedimiento de calentamiento. Sin embargo, la velocidad máxima es generalmente más baja y los tiempos de carrera pueden ser bastante largos. Devuelva los ratones a su jaula de origen después de la prueba y limpie la cinta de correr con etanol al 70 %.

Aislar la capa superficial del músculo flexor digitorum brevis del pie para su posterior análisis. Primero, corte la piel de la planta del pie a lo largo de la línea media, teniendo cuidado de no dañar el músculo situado debajo. A continuación, realice cortes horizontales y retire la piel.

Identifique el tendón blanco y plano del músculo FDB unido al hueso calcáneo. Utilice pinzas para separar y luego seccionar el tendón cerca del sitio de inserción. Tire suavemente del tendón hacia arriba mientras corta cualquier tejido conectivo.

Localice dónde los tendones distales se ramifican en los dedos individuales. Corte los tendones en el punto donde se conectan a la capa más profunda del músculo y retire el FDB. Coloque el haz muscular del FDB en un mililitro de solución de colagenasa precalentada a 37 grados Celsius.

Cele la tubo horizontalmente a un agitador orbital de 37 grados Celsius y agite a 200 RPM durante 65 minutos. Una digestión suficiente se indica por una apariencia desmenuzada y un color pálido. Corte el extremo de una punta de pipeta de un mililitro para permitir que el haz digerido pase a través de ella.

Transfiera fácilmente el haz a un tubo de centrífuga que contenga aproximadamente 600 microlitros de Tyro de calcio 2,5. Invierta suavemente el tubo para sacudir las fibras sueltas del haz.

A continuación, corte el extremo de una punta de pipeta de 30 microlitros de manera que su diámetro sea ligeramente menor que el del haz muscular. Utilice esta punta para aspirar el haz dentro de la pipeta y luego empujarlo nuevamente hacia la solución. Repita este proceso hasta que la mayoría de las fibras se hayan disociado del haz.

Mezcle las fibras disociadas girando suavemente el tubo. Retire la cantidad deseada y colóquela en un platillo delta T con fondo de vidrio. Almacene las fibras restantes a cuatro grados Celsius durante aproximadamente seis horas para su uso y estudios adicionales.

Deje reposar el cultivo sin perturbar durante cinco minutos. Esto permite que las fibras se adhieran al fondo de vidrio del cultivo. Coloque el cultivo con fondo de vidrio en un microscopio confocal equipado con un láser UV.

Observe las fibras bajo microscopía de contraste de fases con un aumento mayor a 100 x para verificar la presencia de un patrón de estrías normal y una forma recta similar a una varilla. Añada FM 1 43 o FM 4 64 styro perineum dies a la solución hasta una concentración final de 2,5 micromolar. Oriente la fibra a un ángulo de 45 grados desde la parte superior izquierda del campo de visión hasta la parte inferior derecha para inducir daño.

Irradie un área de cinco por cinco píxeles de la membrana plasmática. Utilizando un láser UV ajustado a la potencia máxima durante cinco segundos, la región irradiada debe dividir la membrana plasmática de manera que la mitad del cuadro de cinco por cinco quede dentro de la fibra, mientras que el resto debe quedar fuera. Capture imágenes de la entrada del colorante en la fibra a intervalos de cinco segundos durante un máximo de cinco minutos. Solo se pueden irradiar tres fibras por placa, ya que eventualmente el colorante fluorescente será endocitado por la fibra y complicará cualquier análisis de datos.

Después de utilizar tres fibras, debe prepararse un nuevo recipiente. Mediante software de análisis, calcule el cambio en la intensidad de fluorescencia en un área de aproximadamente 200 micrones cuadrados para comparar entre fibras. Para cada cuadro, realice el siguiente cálculo: delta F dividido por F cero, donde F cero es la fluorescencia media de la región de interés en el primer cuadro capturado y delta F es el cambio en la fluorescencia en cada cuadro subsiguiente.

Utilice métodos estándar para transfectar células con ADN plasmídico que expresa GFP MG 53. Luego prepare las micropipetas. Coloque una capilar de Pyrex en una micropipeta.

Tire y aspire según el programa preestablecido. Sujete la micropipeta a un manipulador micrométrico de tres ejes. Se elimina el medio del recipiente delta T y se sustituye por tampón Tyrode con calcio 2,5 milimolar.

Coloque el cultivo que contiene las células transfectadas sobre un microscopio confocal de barrido láser equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40 x 1.3 NA. Induzca daño agudo en células vivas insertando la micropipeta en la membrana celular y luego retrayendo rápidamente la micropipeta fuera de la célula. Recolecte imágenes consecutivas de células vivas a intervalos de 1,54 segundos por cuadro para la alteración de la membrana inducida por troponina.

PERFU 0.005% troponina a una velocidad de aproximadamente un mililitro por minuto directamente por encima de la célula que se está visualizando. La cinta de correr puede utilizarse para medir una reducción en la capacidad de correr. Los ratones knockout de MG 53 mostrados aquí presentan una capacidad de correr reducida debido al daño del músculo esquelético.

El grado de daño causado por el láser UV depende de la capacidad de reparación de la membrana de la fibra observada. Aquí se muestra una fibra antes de la lesión en un ratón normal. Esta imagen fue capturada 200 segundos después y muestra una lesión leve.

Una fibra muscular derivada de ratones knockout de MG 53 con capacidad de reparación de membrana comprometida mostrará una entrada de colorante más significativa tras la lesión. A continuación se muestra un ejemplo de un tubo miotubular C2C12 no dañado, transfectado con GFP-MG 53. La flecha en esta imagen señala hacia vesículas que contienen GFP-MG 53 y que se desplazan hacia los sitios de daño.

En este ejemplo, se utilizó esaponina para dañar la membrana plasmática. Observe la translocación de GFP MG 53 del citosol a la membrana celular tras la lesión. Al realizar este procedimiento, es importante recordar aislar fibras musculares adecuadas con membranas sarcolemáticas lisas y patrones de estriación definidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la capacidad de reparación de la membrana del músculo y del cultivo, las células.