Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la capacidad de reparación de la membrana tanto en las células animales como en las aisladas. Las fibras aisladas del músculo esquelético se recogen y se rodean con medios que contienen colorante FM 1 43. A continuación, se utiliza un láser UV para irradiar y dañar una parte de la membrana celular para permitir la entrada del tinte en la célula.

Las células aisladas se transfectan con ADN plasmático que expresa GFP MG 53, que se localizará en la membrana plasmática y el citosol de la célula. A continuación, la punta de un microelectrodo se inserta en la membrana C two C 12 para inducir el daño. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la translocación de la GFP MG 53 al sitio de la lesión.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que se requieren prácticas para dominar las técnicas de penetración de microelectrodos y aislamiento de fibras musculares. La demostración del procedimiento estará a cargo del Dr. Lin, nuestro gerente de laboratorio, el Dr. Wazu, un becario postdoctoral Matt Orange, un estudiante graduado, y el Dr. Shaza, profesor asistente de investigación en nuestro departamento. Para empezar, coloque una bandeja o una almohadilla de laboratorio azul debajo de la cinta de correr para recoger los desechos de los animales durante el experimento.

A continuación, establezca el ángulo de la superficie de la cinta de correr. Algunas cintas de correr tienen un aparato integral para ajustar la inclinación, mientras que otras requieren que la cinta de correr se eleve por otros medios. Por lo general, se utiliza una superficie plana o un ángulo entre siete y 15 grados cuesta abajo o cuesta arriba.

Aclimata a los ratones colocándolos en la cinta de correr con la red eléctrica apagada y el motor de transmisión por correa encendido, pero sin moverse durante 15 minutos después del período de aclimatación, encienda la red eléctrica motivacional. Ponga en marcha la cinta de correr con una velocidad inicial de aproximadamente cinco metros por minuto. Con velocidades que aumentan de uno a dos metros por minuto, cada minuto permite al animal un período de calentamiento de cinco minutos.

Repita este período de calentamiento todos los días durante tres a 10 días para aumentar el cumplimiento durante las pruebas. Realizar un ejercicio de agotamiento agudo. Aumente la velocidad de la cinta de correr con el tiempo hasta alcanzar una velocidad máxima y controle los signos de agotamiento.

Se considera que un animal está agotado cuando pasa más de la mitad del tiempo fuera de la cinta de correr o cinco segundos consecutivos en la parrilla. Retire el mouse agotado y registre el tiempo total de ejecución. Entrenamiento de resistencia.

Los protocolos en ejecución comienzan con el mismo procedimiento de preparación. Sin embargo, la velocidad máxima es generalmente más baja y los tiempos de funcionamiento pueden ser bastante largos. Regrese los ratones a su jaula doméstica después de la prueba y limpie la cinta de correr con etanol al 70%.

Aísle la capa superficial del músculo flexor corto de los dedos del pie para su posterior análisis. Primero, corte la piel de la suela en la línea mediana, teniendo cuidado de no dañar el músculo que se encuentra debajo. A continuación, haz cortes horizontales y retira la piel.

Identifique el tendón blanco plano del músculo FDB unido al hueso calcáneo. Use fórceps para separar y luego cortar el tendón cerca del sitio de unión. Tire del tendón hacia arriba suavemente mientras corta cualquier tejido conectivo.

Localice dónde se ramifican los tendones distales en los dedos individuales. Corta los tendones donde se conectan con la capa más profunda del músculo y retira el FDB. Coloque el haz muscular FDB en un mililitro de solución de colagenasa Precalentar a 37 grados centígrados.

Pegue el tubo horizontalmente en un agitador orbital de 37 grados Celsius y agite a 200 RPM durante 65 minutos. La digestión suficiente se caracteriza por una apariencia temerosa y un color pálido. Corta el extremo de la punta de una pipeta de un mililitro para permitir el paso del haz digerido.

Transfiera fácilmente el paquete a un tubo de centrífuga que contiene aproximadamente 600 microlitros de 2.5. Tirotia de calcio. Voltee suavemente el tubo para sacudir las fibras sueltas del paquete.

A continuación, corte el extremo de la punta de una pipeta de 30 microlitros para que el diámetro sea solo ligeramente más pequeño que el haz muscular. Utilice esta punta para introducir el haz en la pipeta y, a continuación, volver a introducirlo en la solución. Repita este proceso hasta que la mayoría de las fibras se disocien del paquete.

Mezcle las fibras disociadas girando suavemente el tubo. Retire la cantidad deseada y colóquela en un plato delta T con fondo de vidrio. Almacene las fibras restantes a cuatro grados centígrados durante aproximadamente seis horas para su uso y estudios adicionales.

Deje reposar el plato sin tocarlo durante cinco minutos. Esto permite que las fibras se adhieran al fondo de vidrio del plato. Coloque el plato con fondo de vidrio en un microscopio confocal equipado con un láser UV.

Observe las fibras bajo microscopía de fase a un aumento superior a 100 x para verificar la presencia de un patrón de estría normal y una forma de varilla recta. Añadir matrices de estirenoperineo FM 1 43 o FM 4 64 a la solución hasta una concentración final de 2,5 micromolares. Oriente la fibra en un ángulo de 45 grados desde la parte superior izquierda del campo de visión hasta la parte inferior derecha para inducir daños.

Irradiar un área de cinco por cinco píxeles de la membrana plasmática. Usando un láser UV configurado a máxima potencia durante cinco segundos, la región irradiada debe dividir la membrana plasmática que es la mitad de la caja de cinco por cinco, debe estar dentro de la fibra, mientras que el resto debe estar fuera de la fibra, capturar imágenes de la entrada del tinte en la fibra a intervalos de cinco segundos cada una durante un máximo de cinco minutos. Solo se pueden irradiar tres fibras por placa, ya que el tinte fluorescente eventualmente se endocitosará en la fibra y complicará cualquier análisis de datos.

Después de usar tres fibras, se debe preparar un plato nuevo. Utilizando un software de análisis, calcule el cambio en la intensidad de la fluorescencia en un área de aproximadamente 200 micras cuadradas para compararlo entre fibras. Debe efectuarse el siguiente cálculo para cada trama delta F dividida por F cero, donde F cero es la fluorescencia media de la región de interés en la primera trama capturada y delta F es el cambio de fluorescencia en cada trama subsiguiente.

Utilice métodos estándar para transfectar células con ADN plasmídico que exprese GFP MG 53. A continuación, prepare las micropipetas. Coloque un capilar Pyrex en una micropipeta.

Tirar y tirar por programa preestablecido. Conecte la micropipeta a un cultivo de micromanipulador de tres ejes. Los medios se retiran de la placa delta T y se reemplazan con tampón tiroso de calcio de 2,5 milimolares.

Coloque la placa que contiene las células transfectadas en un microscopio confocal de barrido láser con un objetivo de inmersión en aceite de 40 x 1,3 NA. Inducir daño agudo de células vivas insertando la micropipeta en la membrana celular y luego retrayendo rápidamente la micropipeta fuera de la célula. Recopile imágenes consecutivas de células vivas en un intervalo de 1,54 segundos por fotograma para la disrupción de membrana inducida por troponina.

PERFU 0,005% de troponina a una tasa de aproximadamente un mililitro por minuto directamente sobre la célula que se está tomando la imagen. La cinta de correr se puede utilizar para medir una reducción en la capacidad de carrera. Los ratones knockout MG 53 que se ven aquí tienen una capacidad de carrera reducida debido al daño del músculo esquelético.

El alcance del daño causado por el láser UV depende de la capacidad de reparación de la membrana de la fibra observada. Aquí hay una fibra antes de la lesión en un ratón normal. Esta imagen fue capturada 200 segundos después y muestra una lesión leve.

Una fibra muscular derivada de los ratones knockout MG 53 con una capacidad de reparación de membrana comprometida mostrará una entrada de tinte más significativa después de la lesión observada. Aquí hay un ejemplo de un tubo GFP MG 53 transfectado C dos C 12 myo intacto. La flecha de esta imagen apunta hacia GFP MG 53 que contiene vesículas que se mueven hacia los sitios de daño.

En este ejemplo, la saponina se utilizó para dañar la membrana plasmática. Obsérvese la translocación de GFP MG 53 del citosol a la membrana celular después de una lesión. Al intentar este procedimiento, es importante recordar aislar las fibras musculares buenas con membranas sarales lisas y patrones de estrías claros.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la capacidad de reparación de la membrana del músculo y el cultivo, las células.