Microscopía estática de fuerza atómica para visualizar y caracterizar nucleosomas ensamblados

Los nucleosomas, la unidad básica de repetición de la cromatina eucariota, comprenden giros de ADN envueltos alrededor de un núcleo de proteínas histonas.

Para visualizar nucleosomas ensamblados mediante microscopía de fuerza atómica estática, AFM, comience con una tira delgada de mica, funcionalizada para hacer que la superficie esté cargada positivamente. Corta la tira en cuadrados pequeños. Pipetear una suspensión de nucleosomas ensamblada.

El ADN cargado negativamente en el nucleosoma se une al grupo cargado positivamente de la tira de mica funcionalizada a través de interacciones electrostáticas. Lavar con tampón para evitar el hacinamiento de nucleosomas.

Asegure la tira de mica en un disco de soporte de muestras. Móntelo en la platina del instrumento AFM.

Fije el soporte de la sonda al cabezal óptico del instrumento. El soporte contiene un voladizo AFM premontado con una punta en su vértice.

Alinee el rayo láser en la parte posterior del voladizo para una medición precisa de la deflexión. Coloque la punta en contacto directo con la superficie que contiene nucleosomas.

Durante las imágenes en modo de contacto, a medida que la punta en voladizo escanea la superficie del nucleosoma, surgen fuerzas repulsivas después de las interacciones entre los átomos de la punta y la muestra. Esto hace que el voladizo se doble. El rayo láser se refleja de manera diferente y se dirige al fotodetector sensible a la posición.

El bucle de retroalimentación mantiene una deflexión constante en voladizo mediante el movimiento vertical del escáner durante el escaneo. Esta señal de retroalimentación se utiliza además para generar imágenes topográficas de nucleosomas. El núcleo del nucleosoma aparece como manchas brillantes, con brazos delgados que representan el ADN flanqueante.

Prepare la superficie de mica para imágenes estáticas de AFM. Para hacer esto, primero prepare una solución madre de APS de 50 milimolares en agua desionizada. Almacene 1 mililitro de alícuotas de la solución a 4 grados centígrados, hasta que se necesite.

A partir de la solución madre, prepare una solución APS funcional para la modificación de la mica disolviendo 50 microlitros de la pasta APS de 50 milimolares en 15 mililitros de agua destilada desionizada. Mezcle la solución y luego, llene una cubeta con la solución.

Luego, corte tiras de mica de 1 por 3 centímetros de hojas de mica de alta calidad. Verifique que la pieza encaje cuando se coloque en diagonal en una cubeta. Luego, corte capas de mica hasta que ambos lados estén recién cortados y la pieza sea tan delgada como 0,1 milímetros.

Coloque inmediatamente la pieza de mica en la cubeta llena de APS e incube la mica durante 30 minutos. Transfiera la pieza de mica a una cubeta llena de agua destilada desionizada y déjela en remojo durante 30 segundos. Luego, use argón para secar completamente ambos lados de la tira de mica APS.

Aplique cinta adhesiva de doble cara a varios discos magnéticos y colóquelos a un lado. Luego, corte el sustrato de mica APS en cuadrados de 1 centímetro por 1 centímetro y cúbralos en una placa de Petri limpia. A continuación, prepare tres diluciones de los nucleosomas ensamblados utilizando un tampón filtrado de 0,22 micras que contenga HEPES de 10 milimolares y cloruro de magnesio de 4 milimolares a un pH de 7,5.

Para limitar la pérdida de nucleosomas a la baja concentración final, la dilución debe realizarse de uno en uno, inmediatamente antes de la deposición en la APS-mica.

Deposite de 5 a 10 microlitros de cada muestra de nucleosoma en el centro de una pieza de APS-mica y déjelos incubar durante 2 minutos. Luego, enjuague suavemente la muestra con 2 a 3 mililitros de agua destilada desionizada para eliminar los componentes del tampón y seque la muestra depositada bajo un ligero flujo de argón.

Para comenzar, monte una punta en el soporte de la punta de la configuración de AFM. Luego, monte la primera muestra en la platina AFM, teniendo cuidado de no entrar en contacto con la superficie de la muestra. Coloque el láser sobre el voladizo hasta que su suma esté al máximo y ajuste los valores de deflexión vertical y lateral a cerca de 0. Luego, sintonice la sonda AFM para encontrar su frecuencia de resonancia. Ajuste la amplitud de la unidad y establezca el tamaño de la imagen en 100 por 100 nanómetros. Una vez configurado, haga clic en el botón Participar para comenzar el enfoque.

Cuando se complete el enfoque, optimice gradualmente el punto de ajuste de amplitud hasta que se vea claramente la superficie de la muestra. Luego, aumente el tamaño del escaneo a 1 micra por 1 micra y la resolución a 512 por 512 píxeles. Finalmente, haga clic en el botón Capturar para comenzar la adquisición de imágenes.