Un ensayo para medir la citotoxicidad inducida químicamente en cortes de pulmón humanos cortados con precisión

Tome una placa de varios pocillos que contenga cortes de pulmón humanos cortados con precisión, que mantienen la microarquitectura pulmonar nativa.

Retire los medios. Agregue concentraciones crecientes de agente de prueba a los pocillos e incube.

Dependiendo de su potencial citotóxico, el agente de prueba altera las membranas celulares, induciendo la muerte celular y reduciendo las células viables dentro de las rodajas.

Después de la incubación, retire el medio. Sumerja las rodajas en un medio que contenga sal de tetrazolio soluble en agua, o WST-1, y un reactivo de acoplamiento de electrones.

incubar. En las células metabólicamente activas, el sistema de transporte de electrones de la membrana plasmática transfiere electrones del NADH intracelular al reactivo de acoplamiento de electrones extracelular, reduciendo el colorante impermeable a las células WST-1 a formazán estable, de color amarillo oscuro y soluble en agua.

Después de la incubación, agite la placa para distribuir uniformemente el formazán y transfiéralo a una placa de pocillos múltiples.

Con un lector de microplacas, mida la absorbancia de formazán, indicativa de la viabilidad del tejido.

Una disminución en la absorbancia de formazán, dependiendo de la concentración del agente de prueba, indica una viabilidad reducida del corte pulmonar, lo que confirma la citotoxicidad del agente de prueba.

Para preparar una mezcla maestra de la solución de trabajo, diluya 25 microlitros del reactivo WST-1 y 225 microlitros de medio para cada pocillo. A continuación, pipetee 250 microlitros de la solución de trabajo de mezcla maestra de WST-1 para cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante una hora. Asegúrese de que los PCLS estén completamente cubiertos por el reactivo WST-1 durante la incubación.

Luego, coloque la placa en un agitador orbital a 200 rpm y agite cuidadosamente durante 30 segundos para asegurar una mezcla completa del reactivo WST-1. Luego, pipetee 100 microlitros del sobrenadante de cada pocillo de la placa de 24 pocillos a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano por duplicado. Mida la absorción de cada pocillo a 450 nanómetros usando un lector de microplacas y reste la absorción a 630 nanómetros de referencia de la de 450 nanómetros.