Name: Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprende el ensayo de bolsillo corneal en ratón para estudiar angiogénesis usando FGF básico. Este modelo reproduce el crecimiento de vasos sanguíneos desde los vasos limbales hacia el pellet implantado.

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Nuestra investigación es apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, el Instituto Nacional del Ojo.

Todos los equipos y los reactivos utilizados son estériles. El protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión (ACUC) en el NEI / NIH (protocolo de estudio en animales NEI-553), y se realizó de acuerdo a las directrices del NIH y los reglamentos. 1. La producción de la angiogénesis que contiene el factor de pellets En esta parte, las pastillas que contienen el factor angiogénico de interés están preparados. <ol><li> Hacer el 10% (w / v) sucralfato con PBS. Almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Hacer el 12% (w / v) de poli-HEMA con etanol absoluto. Almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Hacer 1 mg / l solución de bFGF. Tienda de -80 ° C. </li><li> Para hacer 50 bolitas, mezclar 5 l de poli-HEMA, 1μl de sucralfato y 4 l de solución madre bFGF, vórtice a fondo. </li><li> Coloque un trozo de parafina limpia en una placa Petri, se exponen a la luz ultravioleta durante 15 minutos en una campana de cultivo de tejidos. Caída de 0,2 l de la mezcla de solución en la parafina de una pastilla. Por lo tanto, 10 l de la mezcla de solución debe producir 50 pastillas. Deje que las pastillas seco a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Los gránulos secos se pueden almacenar en 4 ° C durante varios días, o -80 º C durante varios meses. </li><li> Al uso, palanca y recoger las bolitas con la punta de un par de pinzas. Tenga mucho cuidado de no romper o hacer que la primavera de distancia. </li></ol> 2. Realización de la córnea del ratón ensayo de bolsillo En esta parte, vamos a demostrar cómo hacer un bolsillo en la córnea del ratón, y cómo insertar una pastilla en el bolsillo. El factor angiogénico contenidas en el sedimento se dará a conocer poco a poco a los alrededores de la córnea (Fig. 1). En esta demostración, el uso de 8 semanas hembras C57/Bl6 ratones. <ol><li> El ratón está profundamente anestesiados de forma sistemática con la mezcla de ketamina (75 mg / kg) y xilazina (5 miligramos por kilogramo, la inyección ip). Esto evitará que el ratón en un estado de anestesia durante 30-60 min. Anestesia tópica (0,5% proparacaína HCl) se aplica a la córnea. Después de 5 minutos, fijar un ojo con un microscopio de disección. </li><li> Un corte muy suave se hace en el centro de la córnea 1,2 -1,4 mm del limbo corneal (como se ilustra en la Figura 1) con un cuchillo de von Graefe cataratas. Tenga mucho cuidado de no cortar a través de la córnea. </li><li> Un bolsillo se hace bajo la capa del epitelio de la córnea horizontal insertando el cuchillo en el centro de la córnea y la ampliación del cuchillo hacia el cuidado del limbo (Fig. 1). El tamaño de la bolsa tiene que ser lo suficientemente grande para dar cabida a uno de los factores angiogénicos que contienen pellets. Tenga mucho cuidado de no perforar a través de la córnea. </li><li> Introduzca una pastilla con un par de pinzas en el bolsillo poco a poco. Trate de hacer que la pastilla lo más plana posible. </li><li> Después de la implantación de la pastilla, un ungüento oftálmico antibiótico tópico se aplica en los ojos. Los instrumentos se limpian con algodón con alcohol al 70% entre los animales. </li><li> Mueve el ratón a un lugar caliente y seco y el monitor, hasta que es capaz de mantener una postura erguida y luego devolverlo a su jaula. Los analgésicos sistémicos (por ejemplo, la buprenorfina, 2 mg / kg, la inyección ip) y una pomada tópica con antibióticos (por ejemplo, gentamicina) se dan dos veces al día durante 2 días después de la cirugía y el ratón es de cerca de 3 días. Se espera que la curación completa dentro de las primeras 48 horas después de la cirugía. El ojo con el bolsillo se examina con un alcance con lámpara de hendidura biomicro entre los días 4-10 después de la implantación de pellets. </li></ol> 3. Los resultados representativos <ol><li> Siete días después de la implantación de pellets, el ratón se anestesia sistémica y tópica como se describe en 2.1. </li><li> Observar los vasos sanguíneos en la córnea inducidos por el factor angiogénico bajo un microscopio de disección. En la córnea tratados con vehículo, no el crecimiento de los vasos sanguíneos se puede observar (Fig. 2A, tratadas con vehículo córnea). En la córnea tratados con bFGF, la angiogénesis robusta se puede ver (Fig. 2B). El crecimiento de vasos sanguíneos pueden ser evaluados utilizando la longitud máxima de los vasos sanguíneos (de los vasos normales del limbo a la parte superior de los nuevos vasos), y las áreas de vaso sanguíneo total (Fig. 2B, delineado con una línea discontinua de color rojo en el bFGF tratados con la córnea). Otros métodos de cuantificación también se han descrito 2,5. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Una córnea. Normales con tinción H &amp; E. No existe en los vasos sanguíneos de una córnea normal. B. Hacer un bolsillo debajo de la capa del epitelio de la córnea. C. Insertar una bolita en el bolsillo. D. El factor angiogénico se libera de la pastilla, y forman nuevos vasos sanguíneos de los vasos límbicos normal. <img src="/files/ftp_upload/3077/3077fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Resultado Representante cinco días después de implantación de la pastilla. A. Córnea con una pastilla que contiene el único vehículo. No hay sangre nueva formación de vasos en la córnea. Sólo los vasos preexistentes limbal normales son visibles. B. Córnea con una pastilla que contiene bFGF. Robusta nuevos vasos sanguíneos (punto-alineados) creció desde el pre-existentes vasos límbicos normal.

<ol><li>Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiogenic+activity+and+hypoxia+induction+of+heterodimers+of+placenta+growth+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor.</a> The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).</li>
<li>Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+micropocket+angiogenesis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea micropocket angiogenesis assay.</a> Nature. 2, 2545-2550 (2007).</li>
<li>Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+cornea+as+a+transplantation+site+for+live+imaging+of+engineered+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+is+dispensable+for+blood+vessel+growth+but+critical+for+their+survival%2C+and+VEGF-B+targeting+inhibits+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).</li>
<li>Tong, S., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+angiogenesis+to+basic+fibroblast+growth+factor+in+rat+corneal+pocket+assay%3A+I.+Experimental+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations.</a> Microvascular research. 75, 10-15 (2008).</li>
<li>Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+mouse+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the mouse cornea.</a> Science. 205, 1416-1418 (1979).</li>
<li>Ziche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+assay+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Corneal assay for angiogenesis.</a> Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).</li>
<li>Ziche, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+pocket+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The corneal pocket assay.</a> Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La córnea del ratón de bolsillo modelo de ensayo fue descrito por primera vez en 1979 por Muthukkaruppan VR y Auerbach R 6. Protocolos detallados han sido publicados por diferentes laboratorios 2,3,7,8. Nuestro laboratorio ha modificado y utilizado este método en nuestros estudios durante muchos años 4. La córnea del ratón ensayo de bolsillo es un modelo relativamente simple, con una gran reproducibilidad. Otra ventaja de este modelo es que ya que la córnea normalmente no tiene vasos san...

<table border="1"><tbody><tr><th> Equipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> PZMIV-BS </td></tr><tr><td> Von Graefe cuchillo de cataratas (1.5x25mm hoja, plano) </td><td> Ambler quirúrgica </td><td> 3401E </td></tr><tr><td> Dumont # 5 fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-50 </td></tr><tr><td> Con lámpara de hendidura </td><td> Zeiss </td><td> 30 SL-M </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Equipos <table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Empresa </th><th> Catálogo # </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos) </td><td> Peprotech INC </td><td> 100-18B </td><td></td></tr><tr><td> Sucralfato (sacarosa octasulfate-complejo de aluminio) </td><td> Sigma </td><td> S0652 </td><td> 10% en PBS </td></tr><tr><td> poli-HEMA (poli (2-hidroxietil metacrilato)) </td><td> Sigma </td><td> P3932 </td><td> 12% de etanol </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos y materiales

un modelo de ratón de la prueba de bolsillo para el estudio de la angiogénesis de córnea

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

Una córnea normal es clara de los tejidos vasculares. Sin embargo, los vasos sanguíneos pueden ser inducidas a crecer y sobrevivir en la córnea cuando potentes factores angiogénicos son administrados 1. Esta singularidad ha hecho el ensayo de bolsillo córnea uno de los modelos más utilizados para los estudios de la angiogénesis. La córnea compone de múltiples capas de células. Por tanto, es posible incluir una pastilla que contiene el factor angiogénico de interés en la córnea para investigar su efecto angiogénico 2,3. Aquí, le ofrecemos una demostración paso a paso de cómo (I) producir el factor angiogénico que contienen gránulos (II) incorporar la pastilla en la córnea (III) analizar la angiogénesis inducida por el factor angiogénico de interés. Ya que el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) es conocido como uno de los factores angiogénicos más potentes 4, aquí se utiliza para inducir la angiogénesis en la córnea.

La córnea es la única que carece de los tejidos vasculares. Sin embargo, el fuerte crecimiento de los vasos sanguíneos y la supervivencia puede ser inducida en la córnea por potentes factores angiogénicos. Por lo tanto, la córnea puede dar con nosotros en una herramienta valiosa para los estudios de angiogénesis. Este protocolo muestra cómo realizar el modelo de ratón de ensayo de córnea bolsillo y la forma de evaluar la angiogénesis inducida por factores angiogénicos utilizando este modelo.

Un modelo de ratón de la Prueba de bolsillo para el Estudio de la angiogénesis de córnea

Una córnea normal está libre de tejidos vasculares. Sin embargo, se puede inducir el crecimiento y la supervivencia de vasos sanguíneos en la córnea cuando se presentan factores angiogénicos potentes...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el modelo de ensayo de bolsillo en la córnea de ratón para evaluar el efecto angiogénico del FGF básico. Esto se logra creando un bolsillo en la córnea de ratón e insertando un gránulo de FGF básico en dicho bolsillo. El FGF básico se libera entonces desde el gránulo e induce el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de los vasos limbares.En última instancia, este protocolo puede producir un crecimiento robusto de nuevos vasos sanguíneos a partir de los vasos limbares hacia la pastilla de FGF básico. Hola, soy Shuan del laboratorio del Dr. Shiley en el Instituto Nacional INIH. La principal ventaja de este modelo es que se trata de un modelo relativamente sencillo con alta reproducibilidad.Otra ventaja es que, dado que la córnea normal carece de vasos sanguíneos, el fondo es muy prolongado. Ahora ya tenemos la idea general del modelo. Les mostraré paso a paso cómo inducir la enfermedad de la populación corneal.Así que comencemos. Para prepararse para este procedimiento, prepare las siguientes soluciones: sal al 10% peso por volumen y PBS al 12% peso por volumen, poli-HEMA y etanol, y FGF básico a un gramo por microlitro. El FGF básico debe almacenarse a menos 80 grados Celsius, pero las otras dos soluciones pueden almacenarse a temperatura ambiente.Para preparar 50 gránulos de factores angiogénicos, combine cinco microlitros de solución de poli hema, un microlitro de solución sate y cuatro microlitros de solución de FGF básico en un tubo PCR de 200 microlitros, luego vortex. La mezcla completamente. Ahora coloque una sección de parfum en una placa de Petri y expulse gotas de 0,2 microlitros de la mezcla sobre el parfum.Cada gota se secará formando un pelet. Deje secar los pelets a temperatura ambiente durante una o dos horas. Los pelets secos pueden almacenarse a cuatro grados Celsius durante varios días, o a menos 80 grados Celsius durante varios meses.Para utilizar los pellets, retírelos del param con un par de pinzas, teniendo extremo cuidado de no romperlos ni hacer que salten. Después de anestesiar un ratón con una mezcla de ketamina y xilacina, use una pipeta para aplicar 50 microlitros de clorhidrato de propano al 0,5 % sobre la córnea. Espere cinco minutos y luego coloque al ratón bajo un microscopio estereoscópico de forma que un ojo quede directamente bajo el objetivo.Con un bisturí estéril von grave para cataratas, realice un corte muy suave en el centro de la córnea, aproximadamente entre 1,2 y 1,4 milímetros del limbo corneal. Tenga extremo cuidado de no cortar completamente la córnea. Ahora, introduzca horizontalmente el bisturí en la incisión y extiéndalo cuidadosamente para crear un bolsillo debajo de la capa epitelial de la córnea.Haga el bolsillo lo suficientemente grande como para acomodar una pastilla de FGF básico. Una vez más, tenga extremo cuidado para evitar perforar la córnea. Coloque la pastilla sobre la córnea y dóblela dos veces.Usando pinzas, inserte lentamente el pellet en el bolsillo y luego alíselo lo más posible con las pinzas para finalizar el procedimiento; utilice un aplicador con punta oftálmica para cubrir completamente el ojo. Aplique una pomada oftálmica antibiótica tópica y traslade al ratón a un área cálida y seca. Cuando el ratón sea capaz de mantener una postura erguida, devuélvalo a su jaula de origen dos veces al día mientras se recupera.Aplique analgésicos sistémicos como buprenorfina y pomada antibiótica tópica en el ojo entre cuatro y 10 días después de la implantación del pellet, anestesie al ratón y examine el ojo. Bajo lámpara de hendidura y microscopio biológico, se observaron vasos sanguíneos en la córnea inducidos por el factor angiogénico mediante un microscopio estereoscópico y una córnea tratada únicamente con vehículo. No se observó crecimiento de vasos sanguíneos en una córnea tratada con FGF básico, evidencia de angiogénesis.El crecimiento de nuevos vasos sanguíneos fue robusto. El crecimiento de los vasos sanguíneos se evaluó midiendo su longitud máxima entre los vasos limbares normales y la parte superior de los nuevos vasos. Asimismo, también se midió el área total de los vasos sanguíneos.Usted ve, este es un procedimiento relativamente sencillo. Una vez dominado, puede realizarse en cinco minutos por ojo. Durante este procedimiento, se debe tener especial cuidado, especialmente al intentar crear el bolsillo y al insertar la almohadilla en el bolsillo.El cuchillo debe manipularse con precisión para que no perfore la córnea. Así que gracias por su atención. Buena suerte.

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