Name: Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende el método Ice-Cap para aislar tejido radicular de plántulas de Arabidopsis thaliana y tomate en placas de 96 pocillos. Esta técnica permite extraer ADN para genotipado de alto rendimiento.

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Este trabajo fue financiado por una beca de la National Science Foundation (número de concesión MCB-0447750).

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
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<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
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<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
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<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de capa de hielo que aquí se presenta permite a un científico para recoger muestras de tejidos de cientos o incluso miles de plantas individuales en un solo día y eficiente extracción de ADN genómico de las muestras para su uso en reacciones de genotipado. Al dar un científico de la capacidad de determinar el genotipo de miles de plántulas en un período corto de tiempo, el método de capa de hielo tiene el potencial de facilitar una serie de experimentos genéticos que de otro modo no sería práctico para llevar a cabo. Varios ejemplos se proporcionan a continuación. <ol><li> Mapeo genético. A escala fina elaboración de mapas genéticos se puede acelerar si el investigador es capaz de identificar los eventos de recombinación dentro de un intervalo específico a lo largo del cromosoma 3. Si este intervalo implica una distancia genética muy corto, entonces los eventos de recombinación será relativamente poco frecuente en la población de mapeo segregar. Por esta razón, puede ser necesario a miles de pantalla de las plantas individuales para encontrar el re deseadocombinant personas. Este proceso puede ser acelerado en gran medida a través del uso de la capa de hielo. Incluso en la era del genoma de toda la re-secuenciación, todavía es necesario demostrar directamente que una mutación es directamente responsable de un fenotipo de interés. En estos casos, será necesario separar la mutación de interés lejos de otras mutaciones estrechamente vinculada con el fin de demostrar una mutación candidato es realmente causal. En estas situaciones, capa de hielo podría proporcionar un método eficaz para romper la vinculación entre un par de mutaciones estrechamente vinculados. </li><li> Multi-mutantes. Se ha vuelto común para los investigadores que estudian la Arabidopsis para combinar los alelos mutantes de varios loci distintos en una sola persona con el fin de superar la redundancia funcional 4-6. Como ejemplo, considere un caso en el que se desea combinar los alelos mutantes de cuatro lugares diferentes en una sola planta a través del cruce genético. Para este proyecto, será necesario generar unn individuo que es heterocigoto en estos cuatro lugares, como parte del programa de cruce. Cuando esta semilla cuádruple heterocigoto conjuntos, el homocigoto cuádruple se espera que estén presentes en una proporción de uno de cada 256 en la población resultantes de la progenie. La detección de esta persona rara por los métodos tradicionales sería muy laborioso. En comparación, el uso de hielo-Cap para este proyecto proporcionaría el científico con una estrategia eficiente para la identificación de los homocigotos cuádruple raro en una sola generación. </li><li> iTILLING. Nuestro laboratorio ha descrito recientemente un nuevo enfoque para la detección de la presencia de mutaciones inducidas en los genes de interés en Arabidopsis 7. Este método es una variación de una técnica establecida llamada labranza que se utiliza para encontrar mutaciones en las poblaciones ordenada de los individuos tratados con un mutágeno químico 80-10. Hemos llamado a nuestro método iTILLING porque es una versión individualizada de labranza que permite una individual científico para lograr algo que tradicionalmente ha requerido un equipo de investigación grande para completar. Capa de hielo que forma parte integrante del método iTILLING 7, tal como se describe a continuación. </li></ol> La idea detrás de iTILLING es para producir una población efímera mutante, lo que contrasta con la población mutante resistente creado para los proyectos tradicionales de labranza. Para iTILLING, las semillas de una población M2 granel se siembran en 50 de 100 bloques de hielo Cap, y se extrae el ADN utilizando el método de capa de hielo. Plántulas de Arabidopsis se colocan a 4 ° C, mientras que la detección de mutaciones se realizó mediante el ADN capa de hielo preparaciones. Plántulas de tomate se almacenan a 12 ° C.. Una vez que las plántulas portadoras de mutaciones deseadas han sido identificados, que se recuperan de las placas de capa de hielo-y trasladados a tierra. iTILLING no está destinada a proporcionar a una población mutante de larga duración para una comunidad de investigación a la pantalla. En cambio, iTILLING proporciona una estrategia mediante la cualuno de los científicos pueden detectar una población de encargo mutante para las mutaciones en un puñado de genes rápida, eficiente ya un costo relativamente bajo. Hemos encontrado capa de hielo de ser un método eficaz para el crecimiento y el genotipo de Arabidopsis, tomate y arroz. Esperamos que otras especies de plantas también deben ser susceptibles de capa de hielo. Una limitación en la variedad de especies que pueden ser atendidas por capa de hielo del tamaño de las semillas. Sólo las plantas con semillas pequeñas como para caber en los pocillos de una placa de 96 y será compatible con la capa de hielo en su configuración actual.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, Nueva Jersey </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Máquina para sacudir las placas de raíz para la extracción de ADN </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sellador </td><td> ABgene EE.UU. </td><td> AB-0384 </td><td> Manual de sellado al calor de la máquina utilizada para las placas de raíz antes de la ruptura del tejido </td></tr><tr><td> Centrífuga equipada con soportes de microplacas balanceo </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Cualquier centrífuga con soportes de microplacas balanceo sería adecuado </td></tr><tr><td> Microrrelleno microplacas Dispensador </td><td> BioTek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Dispensador de líquido automatizado para microplacas de relleno </td></tr><tr><td> Bialetti marca17x11 cm Hoja comercial para galletas </td><td> Objetivo de los grandes almacenes </td><td> www.bialetti.com </td><td> Esta hoja de cookie en cuestión tiene la profundidad ideal para la capa de hielo </td></tr><tr><td> Por encargo del estante de metal </td><td> Hardware Store </td><td></td><td> Véase el texto para una descripción completa </td></tr><tr><td> 33 litros de plástico caja de almacenamiento </td><td> Objetivo de los grandes almacenes </td><td> Sterilite Marca </td><td> Para fuente de hielo-Cap. Caja de plástico suficientemente grande para contener la hoja de 17x11 pulgadas galletas </td></tr><tr><td> 30 galones por hora bomba de la fuente </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Pequeña bomba sumergible fuente disponible en las tiendas de jardinería </td></tr><tr><td> Manguera para bomba de la fuente </td><td> Cualquier empresa de suministro de laboratorio </td><td></td><td> Manguera compatible con la bomba de la fuente </td></tr><tr><td> Abrazadera de plástico </td><td> Hardware Store </td><td></td><td> Pinza para sostener la manguera para galletashoja </td></tr><tr><td> Claro tapas de plástico de fondo Falcon Microtest plana placas de 96 pocillos de poliestireno </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Claro tapas de plástico para cubrir Hielo-Placas de plántulas </td></tr><tr><td> 3M microporos cinta quirúrgica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch bolas de diámetro de acero inoxidable </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034 a 006-1K </td><td> Se utiliza para interrumpir el tejido de la raíz después de la cosecha </td></tr><tr><td> 3 bandas elásticas pulgadas del cabello </td><td> Tienda de comestibles </td><td></td><td> Se utiliza para fijar disco de la raíz de plántulas Plate </td></tr><tr><td> 4 pinchos de madera diámetro mm </td><td> Tienda de comestibles </td><td></td><td> Estas brochetas se utilizan normalmente para preparar brochetas </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marca de 1 ml, sin placas de filtro frita </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> Placas de 96 pocillos de plántulas con agujeros en el fondo. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Bueno Tall-Chimenea PCR Plate </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> Placas de 96 pocillos de raíz </td></tr><tr><td> Agar - cultivo de células de prueba </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Morpholinoethanesulfonic ácido (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige y Skoog (MS) mezcla de sal basal </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Easy Peel calor de sellado de aluminio </td><td> ABgene EE.UU. </td><td> AB-0745 </td><td> El calor la lámina de sellado para el sellado de las placas de raíz antes de la ruptura del tejido </td></tr><tr><td> Marca de pato extra de cinta de embalaje ancho, 3.00 &quot;x 54.6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Artículo no. 21242139 </td><td> Cinta adhesivapara microplacas de sellado que contiene extractos de ADN para el almacenamiento </td></tr><tr><td> Sellado de rodillos </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Herramienta de mano móvil para presionar precinto adhesivo en microplacas </td></tr><tr><td> De 96 pozos térmicos de metales bloque </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Se utiliza para congelar las placas de la raíz para la cosecha del tejido </td></tr><tr><td> Papel de filtro Whatman </td><td> Whatman International </td><td> 1002 090 </td><td> Se utiliza para esterilizar la superficie de las semillas </td></tr><tr><td> Desechables con una pipeta Pasteur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13 a 678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;desechables pipeta Pasteur utilizados para la transferencia de semillas a las plántulas Plate </td></tr><tr><td> Pyrex plato para hornear (20 cm x 30 cm) </td><td> Objetivo de los grandes almacenes </td><td></td><td> Se utiliza para construir un hielo seco / etanol baño. </td></tr></tbody></table>

capa de hielo: un método para el cultivo arabidopsis y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Cada vez es más común para los científicos de plantas para desarrollar proyectos que requieren el genotipado de un gran número de plantas. El primer paso en cualquier proyecto de genotipado es recoger una muestra de tejido de cada planta individual. El enfoque tradicional para esta tarea es una muestra de las plantas-en-un-tiempo. Si se desea cientos genotipo o de miles de personas, sin embargo, con esta estrategia da como resultado un importante cuello de botella en la tubería de genotipado. El método de capa de hielo que se describe aquí, proporciona una solución de alto rendimiento para este reto al permitir que un científico para recoger tejidos de varios miles de plántulas en un solo día 1,2. Este nivel de rendimiento es posible gracias al hecho de que el tejido se extrae de plantas de 96 a-un-tiempo, en lugar de uno-a-un-tiempo. El método de capa de hielo ofrece una plataforma integrada para la realización de crecimiento de las plántulas, la cosecha de tejidos, y la extracción de ADN. La base de la capa de hielo es el crecimiento de seedliNGS en un par apilado de placas de 96 pocillos. Los pozos de la placa superior contiene los enchufes de los medios de cultivo de agar en el que las plántulas individuales germinar. Las raíces crecen hacia abajo a través de los medios de agar, la salida de la placa superior a través de un agujero, y pasar a una placa inferior que contiene agua. Para la cosecha de tejidos para la extracción de ADN, el agua en la placa inferior que contiene tejido de la raíz se congela rápidamente, mientras que las plantas de semillero en la placa superior permanecer a temperatura ambiente. La placa superior es entonces despegar de la placa inferior, dando una placa con 96 muestras de raíces de tejido congelado en el hielo y una placa con 96 plantas viables. La técnica es llamada &quot;capa de hielo&quot;, ya que utiliza el hielo para capturar el tejido de la raíz. La placa de 96 pocillos que contienen las semillas se puede envueltas en papel y transferida a baja temperatura. Este proceso se suspende un mayor crecimiento de las plántulas, pero no afecta su viabilidad. Una vez que el análisis del genotipo se ha completado, las plantas con el genotipo deseado puede ser transferido de la p-96, asía finales de suelo para la propagación. Hemos demostrado la utilidad del método de capa de hielo con Arabidopsis thaliana, tomate y semillas de arroz. Esperamos que el método debería ser aplicable también a otras especies de plantas con semillas pequeñas como para caber en los pocillos de placas de 96 pocillos.

El método de capa de hielo permite cultivar plantas en placas de 96 pocillos y no destructiva del tejido de la cosecha de raíz de cada planta. ADN extraído de este tejido de la raíz puede ser utilizado para las reacciones de genotipado. Hemos encontrado que la capa de hielo que funciona bien para<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomate y semillas de arroz.

Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado

Se ha vuelto común que los científicos especializados en plantas desarrollen proyectos que requieran el genotipado de un gran número de plantas. El primer paso en cualquier genotipado...

El objetivo general de este experimento consiste en aislar muestras de tejido radicular de plántulas cultivadas en placas de 96 pocillos para la extracción de ADN y la genotipificación. Esto se logra primero germinando las plántulas en placas especiales de 96 pocillos que contienen un medio de crecimiento de agar y presentan orificios en el fondo de cada pocillo. El segundo paso consiste en apilar la placa de plántulas encima de una placa estándar de 96 pocillos llena de agua.Una vez que las raíces han crecido hacia abajo e ingresado a la placa inferior de 96 pocillos, las placas apiladas se colocan en un bloque congelador para congelar el agua en la placa inferior. El paso final consiste en separar la placa superior de la placa inferior, quebrando las raíces, las cuales quedan congeladas en la placa inferior. En última instancia, las muestras de tejido radicular resultantes pueden utilizarse para extraer muestras de ADN de cada planta individual para su análisis de genotipo.La principal ventaja del método ice cap en comparación con otros métodos alternativos es que permite aislar ADN de miles de plantas en un solo día. Este nivel de productividad es posible porque, con ice cap, las plantas se procesan de a 96 simultáneamente, en lugar de una por una como en el método tradicional. Algunos ejemplos del uso de ice cap incluyen el tamizado de grandes poblaciones de plantas para identificar recombinantes raros entre genes estrechamente ligados, la generación de plantas que portan un gran número de mutaciones diferentes y localizadas, y la realización de selección asistida por marcadores en especies de cultivo.Básicamente, cualquier experimento que implique costos de genotipado con un gran número de plantas individuales podría beneficiarse potencialmente del recipiente icecap. Originalmente desarrollamos icecap para su uso en el absceso de conejo, pero también hemos tenido éxito al utilizarlo para recolectar tejido de plántulas de arroz y tomate. Esperamos que ice cap también sea eficaz en otras especies, siempre que sus semillas sean lo suficientemente pequeñas como para caber en una placa de 96 pocillos.Primero envuelva las placas de plántulas en papel de aluminio y autóclave al mismo tiempo. Sumerja las tapas plásticas transparentes de las placas de plántulas en etanol al 95 % después de finalizado el ciclo de autoclave, y permita que las placas de plántulas y las tapas se sequen completamente en una cabina de flujo laminar. Una vez que las placas estén completamente secas, aplique cinta adhesiva al fondo de cada placa de plántulas y séllela firmemente utilizando un rodillo.Luego, utilice un dispensador de microplacas microfill o una pipeta multicanal para dispensar 450 microlitros de medio de crecimiento fundido en los pocillos de cada placa de plántulas. Cubra las placas con tapas de plástico y deje que el medio de crecimiento se solidifique a temperatura ambiente. Espolvoree semillas secas sobre papel filtro Watman y cubra completamente cada semilla con etanol al 95 %.Luego, deje que las semillas se sequen completamente al aire. A continuación, transfiera las semillas a las placas de plántulas tocando primero el extremo sellado con llama de una pipeta de vidrio modificada sobre la superficie del medio de agar. Esto humedece la punta de la pipeta y permite que una sola semilla se pueda recoger fácilmente y transferir a la superficie del agar.Una vez que cada pocillo contenga una semilla, cubra cada placa de plántulas con una tapa de plástico transparente y selle con cinta quirúrgica microporo. Envuelva las placas apiladas con papel de aluminio y almacénelas a cuatro grados Celsius durante cuatro días para estratificar las semillas y sincronizar la germinación. Después de cuatro días, coloque las placas de plántulas bajo luz fluorescente a 18 a 20 grados Celsius durante otros cuatro días.Para iniciar la germinación, monte la fuente de cubitos de hielo en un estante de la sala de crecimiento de plantas de modo que la superficie de la fuente reciba iluminación fluorescente directa. Para armarla, primero coloque la estructura de bastidor personalizada dentro de una caja de almacenamiento de plástico y luego coloque una bandeja para galletas encima de esta.Utilice las tuercas de nivelación para ajustar el nivel de la bandeja para galletas. Luego, coloque una bomba sumergible en la caja de almacenamiento y conecte la manguera de salida de la bomba al costado de la bandeja para galletas usando una abrazadera con resorte. A continuación, llene la fuente de hielo con una mezcla de tres partes de agua destilada por una parte de agua del grifo.Se debe agregar agua hasta que la bomba sumergible quede varios centímetros por debajo del nivel del agua. Marque el nivel final del agua en la caja de almacenamiento de plástico utilizando cinta de laboratorio y un marcador. Prepare las placas de raíz añadiendo una bola de acero inoxidable en cada pocillo de una placa de raíz de 96 pocillos.Luego, dispense 340 microlitros de una mezcla de tres partes de agua destilada por una parte de agua del grifo en cada pocillo de la placa de raíces. Retire la película adhesiva de la parte inferior de las placas de plántulas y saque las tapas de plástico transparentes.Coloque cada placa de plántulas en una placa de raíces que contenga una bola de metal y agua, y asegure las placas emparejadas juntas utilizando dos bandas elásticas. Luego, coloque las placas apiladas en la fuente de hielo. Las placas emparejadas deben dejarse en la fuente de hielo durante 10 a 14 días.Durante este tiempo, mantenga el nivel de agua en la fuente de hielo agregando agua destilada según sea necesario. Una vez que la mayoría de las plántulas tengan tejido radicular que haya penetrado las placas de raíces, retire las placas de la fuente de hielo para prepararse para la recolección del tejido radicular. Después de retirar las placas de la fuente de hielo, inserte tres palillos de madera entre los pozos de las placas apiladas de plántulas y raíces.Los palillos elevarán los salientes de las placas de plántulas fuera de los pozos de las placas de raíces. Deje que las placas de tapa de hielo apiladas, con los palillos de madera insertados, permanezcan durante la noche bajo luces. Esta incubación permite una ligera evaporación del líquido en las placas de raíces, lo que facilita los procesos posteriores de congelación y separación de las placas.El día de la recolección del tejido, prepare un baño de congelación. Coloque un bloque térmico metálico de 96 pocillos en un recipiente de Pyrex con una mezcla de hielo seco y etanol al 95%. Deje que el bloque térmico se equilibre a la temperatura durante aproximadamente 20 minutos.Coloque las placas apiladas del casquete de hielo con palillos de madera sobre el bloque térmico enfriado e incube durante cinco minutos. Durante este tiempo, el agua en la placa de raíz se congelará completamente. Retire las placas apiladas del casquete de hielo del baño de congelación y colóquelas sobre la mesa de laboratorio a temperatura ambiente; retire las bandas elásticas y los palillos de madera de las placas apiladas.Presione firmemente la parte superior de la placa de plántulas para quebrar las placas. Luego, separe cuidadosamente la placa de raíces y las placas de plántulas. Deje que el agua en las placas de raíces se descongele a temperatura ambiente.De lo contrario, el descongelamiento puede acelerarse incubando las placas de raíces en un bloque térmico. Establezca una temperatura de 25 grados Celsius mientras las placas de raíces se descongelan. Las placas de plántulas pueden prepararse para su almacenamiento.Para hacer esto, selle la parte inferior de la placa de plántulas con cinta adhesiva. Luego coloque una tapa de plástico transparente encima de la placa de plántulas y sujétela con cinta micropore.Apile las placas de plántulas, envuélvalas con papel de aluminio y coloque las plántulas de arabidopsis a cuatro grados Celsius. Las plántulas pueden almacenarse a estas temperaturas durante varias semanas sin afectar su viabilidad. Asegúrese de que el agua en las placas de raíz haya descongelado completamente.Antes de realizar el procedimiento de extracción de ADN, inspeccione también las placas para determinar si algún pocillo contiene significativamente menos agua que el promedio; agregue agua destilada con pipeta a los pocillos que requieran más agua. A continuación, agregue 25 microlitros de solución de TRISS 500 milimolar y EDTA 50 milimolar a cada pocillo de la placa de raíces. Luego, selle los pocillos de las placas de raíces utilizando una lámina de sellado térmico y una máquina de sellado por calor.Coloque las placas de raíces selladas en la máquina geno grinder con el extremo sellado de las placas hacia abajo. Agite las placas en el geno grinder durante tres minutos y medio a 1.350 movimientos por minuto. Transfiera las placas a una centrífuga con portaplacas para microplacas y centrifugue durante 10 minutos a 3.500 RPM a cuatro grados Celsius para formar un pellet del tejido de raíz pulverizado.Utilizando una pipeta multicanal, transfiera 20 microlitros de sobrenadante de cada pocillo de la placa de raíces a una placa de 96 pocillos nueva que contiene 80 microlitros de agua milli Q en cada pocillo. Este extracto diluido contiene ADN genómico que puede utilizarse directamente en la reacción de PCR de genotipificación según protocolos estándar. Una vez identificado el genotipo de cada plántula, retire las placas de plántulas del almacenamiento en frío y prepare macetas con mezcla de suelo saturada de agua utilizando aire comprimido y una manguera de goma; aplique una presión de aire suave al orificio pequeño del pocillo de la placa de plántulas para hacer que el tapón de agar y la plántula salgan de la placa hacia la mesa de trabajo.Haga un pequeño orificio del tamaño del tapón de agar en el suelo. Luego coloque el tapón de agar en el suelo y compacte el suelo húmedo alrededor del tapón de agar para asegurar la plántula en el suelo. Coloque las plántulas trasplantadas bajo luz a una temperatura de 18 a 22 grados Celsius.Cubra cada maceta con una tapa de plástico durante los primeros dos días tras el trasplante. Posteriormente, retire la tapa y cultive la planta en condiciones de crecimiento estándar. Esta imagen muestra plántulas de Arabidopsis cultivadas en la fuente de tapa de hielo durante dos semanas y listas para la recolección de tejido.Cada uno de los dos pozos contiene una plántula de Arabidopsis. Esta vista lateral de los mismos dos pozos de la placa de raíces muestra las raíces enroscándose alrededor de la superficie interna de los pozos. Uno dominado. Esta técnica puede utilizarse para procesar hasta 40 placas icecap en un día de ocho horas.Esto permite que un científico produzca preparaciones de ADN a partir de más de 3.800 plántulas individuales en un solo día. Al realizar este procedimiento, es importante recordar transferir las placas con las plántulas al recipiente con hielo tan pronto como germinen. Revise las placas diariamente para no perder el momento adecuado para la transferencia. Buena suerte con sus experimentos.

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El ensayo de inundación de plántulas facilita el cribado rápido de las adhesiones de tomate silvestre para la resistencia a la bacteria pseudomonas de las siestas. Este ensayo, utilizado junto con el ensayo de crecimiento bacteriano de plántulas, puede ayudar a caracterizar aún más la resistencia subyacente a la bacteria, y se puede utilizar para examinar las poblaciones de mapeo para determinar la base genética de la resistencia.

Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) ofrece la posibilidad de diseccionar programas de desarrollo con un procesamiento mínimo de órganos y tejidos. El protocolo produce ARN de alta calidad a partir de células dirigidas con una subunidad ribosomal etiquetada con proteína fluorescente verde (GFP). Las herramientas de análisis aguas abajo, como qRT-PCR o RNA-seq, revelan perfiles de expresión específicos del tejido y del tipo de célula.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

Aquí, describimos una herramienta avanzada diseñada para el monitoreo de la biosíntesis de clorofila durante las primeras etapas de la desetiolación de plántulas de Arabidopsis . La novedosa metodología proporciona imágenes no invasivas de fluorescencia de clorofila en tiempo real a alta resolución espacial y temporal.

Ensayo no invasivo para la determinación cinética de la biosíntesis de clorofila durante las primeras etapas de la desetiolación de Arabidopsis

Aprende el método Ice-Cap para aislar tejido radicular de plántulas de Arabidopsis thaliana y tomate en placas de 96 pocillos. Esta técnica permite extraer ADN para genotipado de alto rendimiento.

Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado (Video) | JoVE Journal

Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado

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