Name: La tinción inmunohistoquímica de B7-H1 (PD-L1) en Parafina embebido en diapositivas de tejido pancreático Adenocarcinoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprende la técnica de tinción inmunohistoquímica para evaluar la expresión de B7-H1 (PD-L1) en adenocarcinoma pancreático embebido en parafina. Este método permite visualizar la localización de esta señal inmunosupresora en el microambiente tumoral.

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EB, KMB, HX y contribuir por igual. Este estudio fue apoyado por el NCI SPORE en cánceres gastrointestinales P50 CA062924, CA148964 NIH K23, Fundación Lustgarten, Fundación Viragh, Premio Joven Investigador ASCO, NIH 5T32 CA0090701-28 Training Grant, Sol Goldman cáncer de páncreas Center y la Fundación Nacional de páncreas.

B7-H1/PD-L1, un miembro de la familia B7 de inmuno-reguladoras proteínas de la superficie celular, juega un papel importante en la regulación negativa de respuestas mediadas por células inmunes a través de su interacción con su receptor, muerte programada-1 (PD -1) 1,2. La sobreexpresión de B7-H1 por células tumorales se ha observado en un número de cánceres humanos, incluyendo melanoma, glioblastoma, y ​​los carcinomas de pulmón, mama, colon, ovario y células renales, y se ha demostrado que es perjudicial anti-tumorales T- inmunidad de células 3-8. Recientemente, B7-H1 expresión por los tejidos de adenocarcinoma pancreático se ha identificado como un marcador pronóstico potencial 9,10. Además, el bloqueo de B7-H1 en un modelo de ratón de cáncer de páncreas se ha demostrado que producen una respuesta anti-tumoral 11. Estos datos sugieren la importancia de B7-H1 como una diana terapéutica potencial. Anti-B7-H1 anticuerpos de bloqueo, por lo tanto están probando en ensayos clínicos para el consumo humano múltipletumores sólidos incluyendo el melanoma y los cánceres de pulmón, colon, riñón, estómago y páncreas 12. Con el fin de ser finalmente capaz de identificar a los pacientes que se beneficiarán de B7-H1 focalización terapias, es crítico para investigar la correlación entre la expresión y localización de B7-H1 y la respuesta del paciente al tratamiento con anticuerpos de bloqueo B7-H1. Examinar la expresión de B7-H1 en tejidos pancreáticos humanos adenocarcinoma mediante inmunohistoquímica dará una mejor comprensión de cómo esta molécula de señalización co-inhibidora contribuye a la supresión de la inmunidad antitumoral en el microentorno del tumor. El anticuerpo anti-B7-H1 monoclonal (clon 5H1) desarrollado por Chen y colaboradores se ha demostrado que produce resultados fiables de tinción en secciones criogénicas de múltiples tipos de tejidos neoplásicos humanos 4,8, pero la tinción de portaobjetos incluidos en parafina había sido un reto hasta recientemente 13-18. Hemos desarrollado el staini B7-H1ng protocolo para las diapositivas incrustadas en parafina de los tejidos adenocarcinoma de páncreas. El protocolo de tinción B7-H1 descrito aquí produce tinción consistente membranosa y citoplásmica de B7-H1 con antecedentes. 1. De-parafinization <ol><li> Bake desliza a 55 ° C durante 20 min. </li><li> En una campana química, sumergir los portaobjetos en xileno durante 10 min. </li><li> Sumerja los portaobjetos en xileno fresco durante 10 minutos. </li><li> Sumergir desliza en 100% de etanol durante 5 min. </li><li> Sumergir desliza en etanol fresco 100% durante 5 min. </li><li> Sumergir desliza en 95% de etanol durante 5 min. </li><li> Sumergir desliza en 80% de etanol durante 5 min. </li><li> Sumergir los portaobjetos con agua desionizada durante 5 min. </li></ol> 2. Antígeno recuperación <ol><li> Sumergir los portaobjetos en tampón Tris-EDTA (pH 9,0) y calor en una olla a presión a 125 ° C durante 30 segundos, luego 90 º C durante 10 sec. </li><li> Deje enfriar diapositivas durante 60 minutos. </li><li> Sumerja los portaobjetos en TBST durante 5 min; Repemenos dos veces. </li></ol> 3. La tinción <ol><li> Limpie soluciones alrededor del tejido en las diapositivas. Marcar un círculo alrededor del tejido con un bolígrafo hidrófobo. </li><li> Colocar los portaobjetos en una cámara de humedad y evitar el secado del tejido en la corredera a lo largo de todo el proceso de tinción. Colocar una gota (aproximadamente 200 l o más para cubrir completamente el área de tejido) de bloquear la peroxidasa dentro del círculo hidrófobo sobre el portaobjetos y portaobjetos durante en el bloque peroxidasa durante 5 min. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. </li><li> Coloque una gota de tampón de bloqueo BLOCK ACE en cada diapositiva y se incuba durante 15 min. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. </li><li> Coloque una gota de solución de avidina en cada diapositiva y se incuba durante 15 min. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. </li><li> Coloque una gota de solución de biotina en cada diapositiva y se incuba durante 15 min. </li><li> Enjuague slides con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. </li><li> Incubar los portaobjetos con dilución 1:1.000 de ratón anti-B7-H1 anticuerpo monoclonal (clon 5H1) o una IgG1 de ratón κ control de isotipo en 200 TBST mu l a 4 ° C durante la noche para 22 hr + / - 1 hr. La concentración final de anticuerpo en TBST es 2,57 g / ml. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces. </li><li> Incubar los portaobjetos con una rata conjugado con biotina anti-IgG1 de ratón anticuerpo secundario a una concentración de 1:500 (en 200 l solución 2% de suero de cabra) durante 30 min. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces. </li><li> Coloque una gota de estreptavidina-biotina (debe estar preparado por lo menos 30 min antes de su uso) en cada portaobjetos y se incuba durante 15 min. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces. </li><li> Coloque una gota de reactivo de amplificación (diluido 2:1 con TBST) a cada lado y se incuba durante 4 min. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces. </li><li> Coloque una gota de estreptavidina-HRP en cada portaobjetos y se incuba durante 15 min. </li><li> Enjuagar los portaobjetos con TBST, y echarlo en TBST durante 5 min. Repita dos veces. </li><li> Depositar una gota de 3,3-diaminobencidina (DAB) como sustrato y cromógeno en cada diapositiva y desarrollar el color durante 2 min. </li><li> Inmediatamente después del desarrollo del color, lavar los portaobjetos con ddH 2 O durante 1-2 min. </li><li> Incubar los portaobjetos con una gota de hematoxilina durante 90 segundos. </li><li> Lavar con ddH 2 O durante 1-2 min. </li><li> Lavar con agua corriente y jabón durante 1-2 min. </li><li> Lavar con ddH 2 O durante 1-2 min. </li></ol> 4. Deshidratación y montaje <ol><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 80% durante 3 min. </li><li> Sumergir los portaobjetos en etanol al 95% durante 3 min. </li><li> Sumergir los portaobjetos en 100% de etanol durante 5 min. Repetir. </li><li> Sumergir los portaobjetos en xileno durante 5 min. Repetir. </li><li> Añadir una gota deCytoseal 60 a la corredera y el lugar del cubreobjetos. </li></ol> La Tabla 1 enumera los reactivos utilizados en los procedimientos descritos anteriormente.

<ol><li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+B7s%3A+playing+a+pivotal+role+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity.</a> J. Immunother. 30, 251-260 (2007).</li>
<li>Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1%2C+a+third+member+of+the+B7+family%2C+co-stimulates+T-cell+proliferation+and+interleukin-10+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.</a> Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).</li>
<li>Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+improves+myeloid+dendritic+cell-mediated+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity.</a> Nat. Med. 9, 562-567 (2003).</li>
<li>Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDong%2C+H+%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. 8, 793-800 (2002).</li>
<li>Dong, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+pathway+and+its+role+in+the+evasion+of+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity.</a> J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).</li>
<li>Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+blockade+augments+adoptive+T-cell+immunotherapy+for+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma.</a> Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).</li>
<li>Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+and+PD-1+by+monoclonal+antibodies+potentiates+cancer+therapeutic+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity.</a> Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costimulatory+B7-H1+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+Indicator+of+tumor+aggressiveness+and+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).</li>
<li>Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+up-regulated+expression+in+human+pancreatic+carcinoma+tissue+associates+with+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression.</a> J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).</li>
<li>Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+regulation+of+the+costimulatory+molecule+B7-H1+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer.</a> Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).</li>
<li>Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+B7-H1+or+B7-DC+induces+an+anti-tumor+effect+in+a+mouse+pancreatic+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model.</a> Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).</li>
<li>Wang, S., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+cancer+therapies+targeting+CD137+and+B7-H1%2FPD-1+cosignal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).</li>
<li>Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B7-H1+glycoprotein+blockade%3A+a+novel+strategy+to+enhance+immunotherapy+in+patients+with+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma.</a> Urology. 66, 10-14 (2005).</li>
<li>Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+B7-H1+is+associated+with+poor+prognosis+in+renal+cell+carcinoma+patients+with+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up.</a> Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).</li>
<li>Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+B7-H1+expression+in+clear+cell+carcinoma+of+the+kidney+for+prognostication+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy.</a> Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).</li>
<li>Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-expressed+B7-H1+and+B7-DC+in+relation+to+PD-1%2B+T-cell+infiltration+and+survival+of+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma.</a> Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).</li>
<li>Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+%28B7-H1%29+expression+by+urothelial+carcinoma+of+the+bladder+and+BCG-induced+granulomata%3A+associations+with+localized+stage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression.</a> Cancer. 109, 1499-1505 (2007).</li>
<li>Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).</li>
<li>Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+B7-H1+and+B7-1+expressions+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma.</a> World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).</li>
<li>Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+and+therapeutic+potential+of+the+programmed+death-1+ligand%2Fprogrammed+death-1+pathway+in+human+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer.</a> Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).</li>
<li>Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-h1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La tinción inmunohistoquímica de B7-H1 en criosecciones se ha informado en estudios anteriores para una variedad de cánceres 3,4. Sin embargo, las muestras de tumores clínicas por lo general sólo están disponibles en forma de bloques incluidos en parafina. El anticuerpo monoclonal 5H1 Más recientemente se ha aplicado con éxito a la tinción de tejidos embebidos en parafina de tumores incluyendo carcinoma de células renales, carcinoma cervical, cáncer de vejiga y melanoma 13-18. B7-H1 en la tinción e...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> CSA Sistema </td><td> Dako </td><td> K1500 </td><td> Incluye los siguientes reactivos mencionados en el protocolo: bloque peroxidasa, complejo estreptavidina-biotina, reactivos de amplificación, estreptavidina-HRP y sustrato cromógeno DAB y </td></tr><tr><td> Avidina / biotina Blocking Kit </td><td> Vector </td><td> SP-2001 </td><td></td></tr><tr><td> Bloquear ACE </td><td> Serotec </td><td> BUF029 </td><td></td></tr><tr><td> Biotina anti-ratón IgG1 </td><td> BD </td><td> 553441 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse IgG1 K Control de isotipos </td><td> eBioscience </td><td> 14-4714-85 </td><td></td></tr><tr><td> TBS (Tris-solución salina tamponada), 10X </td><td> Cellgro </td><td> 46-012 CM- </td><td> 10xTBS contiene 80 g / l de NaCl y 24,2 Tirs g / L; Diluido a 1X con ddH2O para lavados; </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1379 </td><td> 1 ml añadido a 1 L de 1X TBS para hacer TBST </td></tr><tr><td> Target Retrieval, 20x </td><td> Celerus Wave </td><td> 014-3000-000 </td><td> Diluido a 1x con ddH 2 O </td></tr><tr><td> 190 Prueba de Alcohol Etílico </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 111000190 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Prueba de alcohol etílico </td><td> PHARMO-Aaper </td><td> 111000200 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno </td><td> VWR </td><td> 95057-827 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Richard Allan Scientific- </td><td> 72804 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Richard Allan Scientific- </td><td> 8310-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td></td></tr><tr><td> Humedad cámara </td><td> Sigma </td><td> H6644 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 1. Reactivos y equipo. </td></tr></tbody></table>

la tinción inmunohistoquímica de b7-h1 (pd-l1) en parafina embebido en diapositivas de tejido pancreático adenocarcinoma

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, un miembro de la familia B7 de inmuno-reguladoras proteínas de la superficie celular, juega un papel importante en la regulación negativa de respuestas mediadas por células inmunes a través de su interacción con su receptor, muerte programada-1 (PD -1) 1,2. La sobreexpresión de B7-H1 por células tumorales se ha observado en un número de cánceres humanos, incluyendo melanoma, glioblastoma, y ​​los carcinomas de pulmón, mama, colon, ovario y células renales, y se ha demostrado que es perjudicial anti-tumorales T- inmunidad de células 3-8. Recientemente, B7-H1 expresión por los tejidos de adenocarcinoma pancreático se ha identificado como un marcador pronóstico potencial 9,10. Además, el bloqueo de B7-H1 en un modelo de ratón de cáncer de páncreas se ha demostrado que producen una respuesta anti-tumoral 11. Estos datos sugieren la importancia de B7-H1 como una diana terapéutica potencial. Anti-B7-H1 anticuerpos de bloqueo, por lo tanto están probando en ensayos clínicos para mulples tumores humanos sólidos, incluyendo el melanoma y los cánceres de pulmón, colon, riñón, estómago y páncreas 12. Con el fin de ser finalmente capaz de identificar a los pacientes que se beneficiarán de B7-H1 focalización terapias, es crítico para investigar la correlación entre la expresión y localización de B7-H1 y la respuesta del paciente al tratamiento con anticuerpos de bloqueo B7-H1. Examinar la expresión de B7-H1 en tejidos pancreáticos humanos adenocarcinoma mediante inmunohistoquímica dará una mejor comprensión de cómo esta molécula de señalización co-inhibidora contribuye a la supresión de la inmunidad antitumoral en el microentorno del tumor. El anticuerpo anti-B7-H1 monoclonal (clon 5H1) desarrollado por Chen y colaboradores se ha demostrado que produce resultados fiables de tinción en secciones criogénicas de múltiples tipos de tejidos neoplásicos humanos 4,8, pero la tinción de portaobjetos incluidos en parafina había sido un reto hasta recientemente 13-18. Tenemos devse fugó el B7-H1 tinción protocolo para las diapositivas incrustadas en parafina de los tejidos adenocarcinoma de páncreas. El protocolo de tinción B7-H1 descrito aquí produce tinción consistente membranosa y citoplásmica de B7-H1 con antecedentes.

Tinción inmunohistoquímica de éxito B7-H1 demostrará la expresión heterogénea de B7-H1 (marrón señales desarrollo del color DAB) en el adenocarcinoma de páncreas. Algunas células de adenocarcinoma pancreático tienen predominantemente membranosa expresión de B7-H1 (Figura 1A) mientras que otras tienen una expresión ya sea predominantemente citoplasmática de B7-H1 o poca expresión de B7-H1 (Figuras 2 y 3). Epitelio del conducto pancreático normal expresa poco B7-H1 (Figura 4).</st...

B7-H1 (PD-L1) y su unión a PD-1 proporcionan una importante inducida por tumor señal inmunosupresora en el microentorno del tumor. Una técnica de tinción inmunohistoquímica para caracterizar la expresión y localización de B7-H1 en el adenocarcinoma pancreático se describe aquí.

La tinción inmunohistoquímica de B7-H1 (PD-L1) en Parafina embebido en diapositivas de tejido pancreático Adenocarcinoma

B7-H1/PD-L1, un miembro de la familia B7 de proteínas de superficie celular reguladoras de la inmunidad, desempeña un papel importante en la regulación negativa de la inmunidad mediada por células...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar técnicas de tinción inmunohistoquímica para evaluar la expresión de B siete H uno PD L uno en cortes de parafina de tejido de adenocarcinoma pancreático humano. Esto se logra primero eliminando la parafina y rehidratando los cortes de tejido seccionado. El segundo paso del procedimiento es la recuperación de antígenos, que implica el uso de una olla a presión para teñir el tejido.Se sigue un procedimiento de tinción con anticuerpos, seguido de pasos de amplificación de señal y desarrollo del color con DAB. Los pasos finales consisten en deshidratar y montar el tejido. Una vez completado.La microscopía y el análisis de imágenes pueden utilizarse para visualizar B siete H uno membranoso y citoplasmático. Este enfoque puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio del carcinoma endocrino pancreático al proporcionarnos una mejor comprensión de cómo B siete uno BTL uno contribuye a la supresión de la inmunidad antitumoral en el microentorno del tumor. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la tinción en secciones criostáticas, es que ha sido optimizada para el uso de secciones de tejido embebido en parafina, que suelen estar más disponibles y son más fáciles de almacenar.La tinción con anticuerpos confiable en portaobjetos no es posible sin eliminar primero la parafina. Por lo tanto, para preparar portaobjetos con tejidos incluidos en parafina, primero hornee los portaobjetos a 55 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, en una campana química, se utiliza una serie de siete baños químicos para eliminar la parafina; primero, sumerja los portaobjetos en xileno durante 10 minutos.A continuación, sumerja los portaobjetos en un segundo baño de xileno fresco durante 10 minutos. En tercer lugar, sumerja los portaobjetos en etanol al 100 % durante cinco minutos. En cuarto lugar, sumerja nuevamente los portaobjetos en etanol fresco al 100 % durante cinco minutos.Quinto, sumerja los portaobjetos en etanol al 95 % durante cinco minutos. Sexto, sumerja los portaobjetos en etanol al 80 % durante cinco minutos. Finalmente, lave los portaobjetos con agua desionizada durante cinco minutos.Una vez eliminado el parafina, es necesario exponer el antígeno. Primero, sumerja los portaobjetos en tampón Tris EDTA. A continuación, caliente los portaobjetos en una olla a presión con un programa de dos pasos.Primero, caliéntelos a 125 grados Celsius durante 30 segundos. Segundo, a 90 grados Celsius durante 10 segundos. Luego, deje las laminillas apartadas para que enfríen a temperatura ambiente.Después de dejar que los portaobjetos se enfríen durante una hora, lávenlos dos veces con TBST, cinco minutos por baño. Ahora se pueden teñir individualmente. Comience por secar mediante absorción la solución de TBST alrededor del tejido y luego marque un círculo alrededor del tejido con un bolígrafo hidrófobo.Durante todo este procedimiento, evite el secado del tejido manteniendo las laminillas en una cámara humidificada. Cuando no estén en baño, coloque una gota de bloqueo de peroxidasa dentro del círculo hidrofóbico sobre la laminilla. Espere cinco minutos y enjuague la peroxidasa con TBST.Luego, sumerja los portaobjetos en TBST durante cinco minutos. Retire los portaobjetos de la solución y sacuda suavemente para eliminar el exceso de TBST. A continuación, coloque una gota de tampón bloqueante CE sobre cada portaobjeto e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.Limpie los portaobjetos con una enjuagada y un baño de cinco minutos en TBST. A continuación, coloque una gota de solución Vidan sobre cada portaobjeto y espere 15 minutos. Retire el AVADON con el mismo enjuague y régimen de baño en TBST.Ahora aplique biotina. Espere cinco minutos y limpie los portaobjetos nuevamente con TBST. A continuación, incube los portaobjetos con una dilución de anticuerpo monoclonal de ratón o con un anticuerpo control.En TBST, dejar que cualquier anticuerpo se conjuge a cuatro grados Celsius durante 22 horas. Al día siguiente, lavar las láminas con TBST tres veces como antes. Cada lavado incluye una enjuagada con A-T-B-S-T y un baño de cinco minutos.Este régimen de triple lavado se repite varias veces sucesivamente durante el lavado del anticuerpo primario. Prepare la solución del complejo STR titina Bio ITIN. Debe prepararse al menos 30 minutos antes de su uso.Ahora incube las laminillas con el anticuerpo secundario de cabra anti-US conjugado con biotina en una solución de suero de cabra durante 30 minutos. Durante esta incubación, siga las instrucciones del kit DACO para preparar la solución de cromógeno de sustrato DAB. La solución puede almacenarse a cuatro grados en la oscuridad durante hasta ocho horas.Después de la incubación, realice el lavado triple con TBST. A continuación, coloque una gota del complejo de eliminación de biotina sobre cada portaobjetos, incube durante 15 minutos y luego lave los portaobjetos tres veces con TBST.A continuación, aplique una gota del reactivo de amplificación sobre cada portaobjetos. Espere cuatro minutos y lave los portaobjetos tres veces con TBST. Después de eliminar el reactivo de amplificación, agregue una gota de estreptavidina HRP a cada portaobjetos e incube durante 15 minutos.Realice otro lavado triple con TBST antes de continuar. Ahora llega el paso más sensible del procedimiento. Añada una gota de sustrato DAB cromógeno con peróxido de hidrógeno al portaobjetos y comience a observar el desarrollo del color, el sustrato DAB.El tiempo de revelado del CROMÓGENO es típicamente de dos minutos, pero habitualmente monitorizamos el proceso bajo un microscopio para asegurar una tinción óptima. Con el fin de tener un fondo mínimo en cada ronda de tinción, incluimos un portaobjetos de un lote previo y un portaobjetos de amígdala como controles positivos. Al finalizar, lave inmediatamente el portaobjetos con agua, no con TBST.Incube el portaobjetos con una gota de hematina durante 90 segundos. Enjuague inmediatamente el portaobjetos con agua destilada desionizada, seguido de agua corriente con jabón y luego más agua DD. Esto completa el procedimiento de tinción.Una vez que todas las laminillas hayan sido teñidas, utilice una serie de etanol para deshidratar las laminillas antes de montarlas. Primero, sumerja las laminillas en etanol al 80 % durante tres minutos. Segundo, sumerja las laminillas en etanol al 95 % durante tres minutos.Para la tercera y cuarta baños, sumerja los portaobjetos en etanol al 100 % durante cinco minutos. Quinto y sexto, sumerja los portaobjetos en xileno durante cinco minutos. Finalmente, agregue una gota por muestra a cada portaobjeto y coloque cuidadosamente una lámina de cobertura.Las láminas ya están listas para microscopía mediante tinción inmunohistoquímica con B siete H uno, que demostró la expresión heterogénea de B siete H uno en adenocarcinoma pancreático. Se observan en color marrón con el desarrollo cromogénico DAB. Algunas células de adenocarcinoma pancreático presentan expresión predominantemente membranosa de B siete H uno, mientras que otras muestran expresión predominantemente citoplasmática de B siete H uno o poca expresión de B siete H uno. El epitelio ductal pancreático normal expresó escasa tinción de B siete H uno. Con un anticuerpo de control de isotipo ratón IgG uno kappa en lugar del anticuerpo anti B siete H uno, se obtuvo muy poca tinción de fondo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en siete horas distribuidas en dos días, con una incubación nocturna de 22 horas si se realiza adecuadamente tras este desarrollo.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran la señalización de B siete H uno PD L uno en otras malignidades.

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