Procesamiento de tejido primario Tumor cerebral para ensayos con células madre y flujo de Ordenación

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las células iniciadoras de tumores cerebrales in vitro. Esto se logra primero disociando mecánica y enzimáticamente los tumores humanos primarios y luego cultivándolos en condiciones de cultivo libre de suero de células madre. La formación de la siguiente esfera se monitorea durante tres a cinco días.

Luego, las esferas tumorales se digieren enzimáticamente nuevamente y sus marcadores de superficie se evalúan mediante citometría de flujo. El paso final es clasificar las celdas deseadas en placas de 96 pocillos o portaobjetos de rejilla PL para una mayor caracterización. En última instancia, la capacidad de autorrenovación y la expresión génica diferencial de la población clasificada se pueden evaluar limitando el análisis de dilución y el R-T-P-C-R de una sola célula.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de tumores a granel, es que aísla prospectivamente las poblaciones de células iniciadoras de tumores cerebrales o células madre cancerosas. Tuvimos la idea de este método por primera vez cuando aplicamos las condiciones de cultivo utilizadas originalmente para las células madre neurales normales a una variedad de tumores cerebrales humanos, y descubrimos que este método de cultivo seleccionado específicamente para poblaciones similares a células madre que demostrarán el procedimiento será el de los estudiantes graduados de investigación postdoctoral asociados de CHITRA AL, bran Van Manen y Sarah Nolte, y nuestra técnica de citometría de flujo Nicole McFarland, todos de nuestro laboratorio Comience agregando 200 microlitros de descongelación a 15 mililitros de líquido cefalorraquídeo cerebral artificial o LCR, y luego coloque el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius. Lleve la solución de cloruro de amonio a temperatura ambiente en este momento también.

Luego, a cinco mililitros de LCR A en un recipiente de muestra de tejido tumoral cerebral, agite el recipiente para enjuagarlo y luego succione el líquido para eliminar los glóbulos rojos. Ahora transfiera el tejido a una placa de Petri estéril de 100 milímetros y use tijeras finas y fórceps para desagregar el tejido hasta obtener una consistencia de suspensión. A continuación, recoja la muestra con una pipeta normal de 10 mililitros y unas pinzas y transfiera los fragmentos de tejido al tubo que contiene el líquido cefalorraquídeo A precalentado.

Con liase, coloque el tubo en un agitador de incubadora a 30 RPM y 37 grados Celsius. Y luego, después de 15 minutos, filtre el lisado de tejido a través de un colador celular de siete micrómetros D en un tubo cónico de 50 mililitros. Gire el filtrado durante cinco minutos a 280 GS a temperatura ambiente.

Luego retire con cuidado el snat y evalúe el tamaño y el color del gránulo resultante. A continuación, vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de PBS y luego agregue una cantidad adecuada de solución de cloruro de amonio según el tamaño del gránulo y la contaminación de los glóbulos rojos. Luego, después de una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente, gire las células después de un segundo lavado en PBS, vuelva a suspender el gránulo en cinco mililitros de medio completo de células madre neurológicas y luego transfiera la suspensión celular a una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros de unión ultrabaja durante los primeros días.

Rellene los cultivos con uno o dos mililitros de medio según sea necesario, cambiando el medio solo cuando el color se vuelva ligeramente amarillo. Comience transfiriendo el cultivo de la esférica tumoral a un tubo cónico de 15 mililitros. Agregue de dos a tres mililitros de PBS estéril para enjuagar bien la placa y luego agregue el lavado al tubo de saliva tumoral.

Después de girar las células, retire el snat y vuelva a suspender el gránulo en uno o dos mililitros de PBS estéril y luego agregue 10 microlitros de liase. Un desafío de esta técnica es mantener la viabilidad de las células madre tumorales sólidas durante el procesamiento. Cualquier manipulación de las células durante el cultivo y la sación requiere un toque suave.

A continuación, incube el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados. Después de tres minutos, retire y evalúe visualmente la suspensión. Si se observan varios grupos, use una punta de pipeta de 1000 microlitros para iterar suavemente el grupo de células.

Ahora lave las células en cinco mililitros de PBS estéril y luego, después de quitar el sobrenadante S, vuelva a suspender el sedimento en 500 a 1000 microlitros de PBS estéril más dos milimolares de EDTA. Finalmente, después de evaluar el número de células y la viabilidad utilizando el azul de Trian, ajuste el recuento de células a 1 millón de células por mililitro en PBS más EDTA. Comience transfiriendo 100 microlitros de la suspensión celular por prueba a tubos de flujo individuales de 12 por 75 milímetros.

Después de agregar los anticuerpos apropiados, incube las muestras en hielo durante 30 minutos, luego lave cualquier anticuerpo no unido en dos mililitros de PBS más EDTA por tubo. Ahora decanta la solución de lavado, seca los tubos y luego vuelve a suspender los gránulos celulares en 300 microlitros más de PBS más EDTA. Luego agregue 10 microlitros del tinte de viabilidad siete A a D a cada tubo.

Después de incubar los tubos durante al menos 15 minutos en hielo, las células están listas para el análisis de citometría de flujo. Después de usar la muestra de control negativo para ajustar los parámetros de dispersión frontal y lateral, dibuje una región alrededor de las celdas de interés similar a la que se muestra en este gráfico superior representativo. Ajuste el voltaje en los detectores de fluorescencia utilizados para colocar las celdas negativas dentro de las primeras dos décadas según sea necesario.

A continuación, use el colorante de viabilidad siete A a d para crear una segunda región para la exclusión de células muertas similar a la región que se muestra en este gráfico superior representativo. A continuación, aplique las puertas de dispersión y de células vivas a todos los gráficos de fluorescencia y utilice los controles de tinción única para restar cualquier superposición espectral. Por último, ejecute los ejemplos.

Comience el ensayo de dilución límite clasificando las células disociadas en dilución variable a una sola célula por pocillo en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos que contiene 200 microlitros de medios NSC que las neuroesferas generalmente se forman durante un período de siete días y la tasa de formación de esferas posterior durante los últimos siete días en cultivo se puede calcular para una sola célula R-T-P-C-R. Después de clasificar las células individuales de las poblaciones de interés en los sitios de reacción de un portaobjetos de cuadrícula amplia, agregue un microlitro de mezcla maestra al centro de cada sitio de reacción y luego cubra inmediatamente cada sitio con cinco microlitros de solución de techo. Luego, usando un ciclador de portaobjetos de amplia velocidad, incube el portaobjetos durante tres ciclos de temperatura.

Después de la transcripción inversa, agregue tres microlitros de agua libre de DN a a cada sitio de reacción. A continuación, transfiera toda la mezcla de cada lugar de reacción a tubos de PCR individuales. Finalmente, para la cuantificación en tiempo real, ejecute las muestras en un ciclador BioRad.

Esta primera figura muestra una resonancia magnética de un paciente representativo con glioblastoma. Las células tumorales disociadas se pueden etiquetar con los marcadores de células madre de la superficie neural, CD 1 33 y CD 15, y analizarse mediante citometría de flujo como se muestra en este diagrama de puntos representativo. Aquí, se muestra el gráfico de amplificación para la reacción representativa de R-T-P-C-R de una sola célula.

Los valores de CT obtenidos de dicho gráfico se pueden utilizar para calcular los niveles de expresión relativos de los genes de interés. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo disociar enzimáticamente y cultivar tejido tumoral cerebral primario para enriquecer las poblaciones de células madre. También sabrá cómo estudiar la capacidad de autorrenovación y la expresión génica diferencial de poblaciones de células madre clasificadas mediante la realización de análisis de dilución limitante o R-T-P-C-R de una sola célula.