Humanos neuroendocrinos líneas de células tumorales como un modelo tridimensional para el estudio de la terapia humana tumor neuroendocrino

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar un método sencillo y fácil para producir esteroides tridimensionales uniformes de tumores neuroendocrinos, y un método simple para procesar la inclusión en HistoGel para estudiar la histología de estos esteroides. Esto se logra recubriendo uniformemente placas de 24 pocillos con aeros, sobre los cuales se siembran células humanas de tumor neuroendocrino en suspensión simple de células. Luego, la placa se incuba durante la noche en un agitador orbital dentro del incubador, a una velocidad inferior a 40 RPM, y posteriormente se transfiere a una estantería estable dentro del incubador.

Los esferoides se formarán al tercer o cuarto día, y su crecimiento e integridad se monitorean mediante microscopía de contraste de fase para estudiar su histología. Los esteroides 3D se incluyen en HistoGel tibio antes del procesamiento rutinario en parafina, y los resultados obtenidos muestran el crecimiento de tumores neuroendocrinos en esteroides 3D basado en imágenes tomadas durante la microscopía de contraste de fase. La histología de los esteroides 3D se analiza mediante tinción con hematoxilina y eosina (H y E) e inmunohistoquímica en cortes de bloques de parafina de los esteroides 3D.

La principal ventaja de esta técnica frente al método existente es que es sencilla, fácil, confiable y rentable. Este método puede facilitar la investigación en el campo del descubrimiento de fármacos al ayudar a identificar rápidamente medicamentos terapéuticos para pacientes con tumores neuroendocrinos. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades al principio, al menos, para cultivar esteroides tridimensionales con forma y tamaño uniformes.

La clave para esto es asegurarse de que sus placas de 24 pocillos estén recubiertas uniformemente con agros y también garantizar que sus suspensiones de células individuales estén bien dispersas y sean precisas. Para comprender la histología de los esteroides 3D, debemos realizar el procesamiento de parénquima y la tinción inmunohistoquímica. La inclusión histológica de los esteroides 3D es el paso clave que será demostrado más adelante hoy. Para preparar el agar al 1 % para el recubrimiento de placas de 24 pocillos, agregue un gramo de aeros a 100 mililitros de agua desionizada en un frasco de 250 a 500 mililitros y esterilice el aeros en autoclave tras la esterilización.

Transfiera el frasco a un baño de agua de 70 grados Celsius durante aproximadamente una hora. Para que el aeros enfríe a 70 grados Celsius, el aeros debe mantenerse estéril en todo momento. En una cabina de seguridad biológica, utilice una pipeta repetidora para dispensar 200 microlitros de aeros en cada pocillo de 2 24.

Placas de fondo plano para este protocolo. Cualquier tipo de placa de 24 pocillos de fondo plano funcionará siempre que las placas puedan ser observadas bajo un microscopio de contraste de fases; gire suavemente el aerosol alrededor del pocillo para lograr una cobertura uniforme. 200 microlitros de aerosol son óptimos para formar una superficie cóncava que permita a los esferoides adoptar formas esféricas consistentes.

Después de aproximadamente 10 minutos, las placas de 24 pocillos recubiertas con aeros están listas para usarse. Las células bon one utilizadas en este experimento son células humanas de tumor neuroendocrino pancreático o células NET, mantenidas en medio D-M-E-M-F 12 con 10 % FBS, en una placa de cultivo tisular estéril, en un incubador húmedo a 37 grados Celsius con 5 % de dióxido de carbono. Cuando las células bon one en monocapa alcanzan un 70 a 80 % de confluencia, se preparan suspensiones de células individuales en una cabina de seguridad biológica.

Retire el medio y lave las células con PBS dos veces; desprenda las células del recipiente añadiendo un mililitro de tripsina y luego incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Compruebe bajo el microscopio que todas las células se hayan desprendido del recipiente y a continuación añada nueve mililitros de medio de crecimiento a la tripsina.

Pipetee las células oculares hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurar una suspensión uniforme de células individuales. Use un filtro celular de 70 micrones para filtrar las células. Después de realizar un recuento celular, recolecte las células filtradas y prepare una suspensión de 5.000 células por mililitro en D-M-E-M-F 12 con medio de crecimiento suplementado con 10% de FBS.

El número de células que se deben sembrar debe determinarse empíricamente según el tamaño de las esferas el día seis. Idealmente, se desea un tamaño de esfera entre 300 y 400 nanómetros de diámetro. Por esta razón, se siembran mil células por 200 microlitros por pocillo.

Para comenzar este procedimiento, superponga 200 microlitros de la suspensión de células individuales sobre cada pocillo recubierto con aeros de las placas de 24 pocillos previamente preparadas y selle las placas de 24 pocillos con cinta adhesiva estéril para prevenir la evaporación. Coloque las placas de 24 pocillos recubiertas con aeros que contienen células bon one sobre un agitador orbital con agitación muy lenta en un incubador húmedo a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono en aire, incube durante la noche y a la mañana siguiente, traslade las placas a una plataforma estable y mantenga las culturas creciendo en el incubador. Cada tres días.

Añada 200 microlitros de medio de crecimiento a cada pocillo de las placas. Para evitar perturbar el phe, toque la punta de la pipeta al costado del pocillo y deje que el medio fluya por la pared hasta el interior del pocillo. Monitoree la formación de OID en las placas de 24 pocillos bajo un microscopio. El tratamiento farmacológico de los esteroides 3D se inicia el día seis del cultivo.

Cuando los esferoides tienen un diámetro de aproximadamente 300 a 400 micrones, esto se considera el día cero para el tratamiento con fármacos el día seis. Cada pocillo de las placas contiene alrededor de 400 microlitros de medio para asegurar que los tratamientos con fármacos tengan una concentración final de uno x en cada pocillo; para cada dosis de tratamiento, prepare el fármaco tres veces más concentrado, diluya la cantidad adecuada del stock del fármaco en cinco mililitros de medio de crecimiento en un tubo cónico de 15 mililitros, lo cual es suficiente para ocho réplicas. Los PHE en cada fila de las placas de 24 pocillos se caracterizan como vehículo y dosis 1, 2, 3, 4 y 5. Hay cuatro réplicas para cada dosis de tratamiento en cada placa de 24 pocillos.

Normalmente, los phe 3D se tratan en al menos 2 placas de 24 pocillos, lo que resulta en al menos ocho réplicas para cada dosis del tratamiento. Antes de añadir el tratamiento a cada pocillo, centrifugar las placas de 24 pocillos para asegurarse de que toda la condensación presente en la cinta del techo caiga dentro del pocillo debido a la característica de flotación del esteroide 3D. El medio en cada pocillo no se elimina después de la centrifugación.

Para evitar la perturbación de la esferoide, agregue cuidadosamente 200 microlitros de cada dosis del tratamiento en los pozos correspondientes a lo largo de la pared de cada uno. Selle herméticamente las placas de 24 pozos con cinta adhesiva y coloque las culturas en un incubador húmedo a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono en aire. Monitoree las culturas tridimensionales con esteroides en cada punto de tiempo elegido tras el tratamiento con fármaco mediante un microscopio de contraste de fase.

Un objetivo de 5x es ideal porque los EFP crecen rápidamente fuera del campo de imagen con un objetivo de 10x. Adquiera imágenes del esteroide en cada pocillo en cada punto de tiempo previo al HistoGel. Los esteroides tridimensionales resultantes se recogen de las placas de 24 pocillos y se fijan en formol al 10%.

Coloque un tubo de HistoGel frío en un vaso lleno de agua. Caliente el vaso en el microondas durante un minuto o hasta que el gel se licúe completamente. Mantenga el tubo en el mismo vaso con agua durante toda la duración del procedimiento.

Utilizando una pipeta plástica desechable, transfiera todo el esteroide a un molde criogénico para biopsia. Deje que el esteroide repose durante un minuto para que se deposite en el fondo del molde criogénico para biopsia.

Intente eliminar el líquido del molde criogénico de biopsia con toallitas Kim. Empuje muy suavemente el esteroide hacia el centro en la parte inferior del molde criogénico de biopsia utilizando un palillo. A continuación, utilice la pipeta de Pasteur para mantener muy suavemente el esteroide en el centro del molde criogénico de biopsia.

Añada una capa delgada de HistoGel calentado al molde criogénico para biopsia. No agregue demasiado HistoGel. Solo lo suficiente para estabilizar los esteroides en el centro.

Deje que el esteroide en HistoGel repose de uno a dos minutos a temperatura ambiente o hasta que el HistoGel se solidifique. Llene el resto del molde criogénico para biopsia con HistoGel calentado y déjelo solidificar a temperatura ambiente durante unos 10 minutos. Justo antes de extraer este bloque de HistoGel de OIDs del molde criogénico para biopsia.

Deje el molde criogénico sobre hielo durante un minuto, luego retire el bloque intacto de HistoGel con esteroide. Envuelva el bloque en un trozo de papel para bioenvoltorio y colóquelo en un casete para tejidos y biopsias. Almacene el casete para tejidos y biopsias en un recipiente con etanol al 70%.

Posteriormente, se realizan procedimientos rutinarios de procesamiento de tejidos para inclusión en parafina cuando se cultivan en placas de 24 pocillos con código aeros. Diferentes líneas celulares de net presentan morfologías distintas, como se observa aquí. La línea celular de net pancreático humano bond one y la línea celular de net pulmonar humano H 7 27 formaron esteroides tridimensionales.

En contraste, qgp uno. Las células pancreáticas humanas forman grandes masas porosas similares a uvas, que no se consideran esteroides. Después de sembrar las células uno en la placa de 24 pocillos recubierta con agros, la formación multicelular de esteroides generalmente ocurre para el tercer o cuarto día, y los esteroides se vuelven más redondeados para el sexto día.

Debido a la limitación de nutrientes y oxígeno, las células en el núcleo denso del esteroide comienzan a morir alrededor del día 10 y, para el día 17, los esteroides empiezan a desintegrarse. Debido al gran tamaño o, en algunos casos, a la expulsión del cordón necrótico, el esteroide normalmente puede crecer hasta alcanzar un diámetro de 1000 micrones.

En este experimento, se eligieron esteroides 3D del día seis como punto inicial para el tratamiento con el inhibidor de la desacetilasa de histonas trikes statin A o TSA. Se ha informado previamente que los inhibidores de la desacetilasa de histonas exhiben efectos antiproliferativos y proto sobre las células netas. Estas imágenes muestran la morfología de los esteroides 3D al inicio del tratamiento y a las 24, 48, 72 y 96 horas posteriores.

V indica el tratamiento con el vehículo, que en este caso es DMSO. D uno a D cinco representan el tratamiento con dosis crecientes de TSA según el tamaño de cada individuo. OID se estimó automáticamente mediante un programa informático personalizado desarrollado en MATLAB.

Se midieron al menos ocho esferas por dosis de tratamiento con TSA en cada punto de tiempo, y los resultados se representan en este gráfico en relación con el vehículo. Todas las dosis de TSA mostraron algún grado de inhibición del crecimiento en los OID tridimensionales. A concentraciones de TSA de 125 nanomolares y 250 nanomolares, el crecimiento de los esteroides tridimensionales se suprimió fuertemente para comprender la histología del esteroide tridimensional neto.

Las tinciones con H y e e inmunohistoquímica se realizaron en esteroides 3D que habían sido cultivados durante 17 días. KI 67 es un marcador para células proliferantes, mientras que la caspasa tres escindida es un marcador para células apoptóticas. Los resultados indican que las células de la capa externa de los esteroides 3D se encuentran en proliferación activa, pero las células del núcleo son principalmente necróticas o apoptóticas.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar ensayos adicionales, como el ensayo Cell Titer Glo, para determinar la viabilidad celular de estos esteroides 3D. Después de su desarrollo, esta técnica puede ampliarse a placas de 96 pocillos para realizar cribados de alto rendimiento, lo que facilitará el descubrimiento de fármacos terapéuticos en la investigación del cáncer.