Человека нейроэндокринной опухоли клеточных линий в качестве трехмерных моделей по изучению прав нейроэндокринные опухоли терапия

Общей целью данного эксперимента является разработка легкого и простого метода получения однородных трехмерных нейроэндокринных опухолевых стероидов, а также простого метода обработки встраивания HistoGel для изучения гистологии этих стероидов. Это достигается за счет равномерного покрытия 24-луночных планшетов аэросом, на которые засеиваются клетки нейроэндокринных опухолей человека в одноклеточной суспензии. Затем планшет инкубируется на орбитальном шейкере в инкубаторе в течение ночи со скоростью ниже 40 об/мин, а затем переносится на устойчивую полку в инкубаторе.

Сфероиды формируются на третий или четвертый день, а их рост и целостность контролируются с помощью фазово-контрастной микроскопии с целью изучения их гистологии. 3D-стероиды встраиваются в подогретый гистогель до получения результатов рутинной обработки парафина, которые показывают рост нейроэндокринных опухолей 3D-стероидов на основе изображений, полученных во время фазово-контрастной микроскопии. Гистология 3D стероида анализируется с помощью h и e и иммуногистохимического окрашивания парафиновых блоков срезов 3D стероидов.

Основное преимущество этого метода перед существующим методом заключается в том, что он прост, легок, надежен и экономически эффективен. Этот метод может облегчить исследования в области разработки лекарств, помогая быстро идентифицировать терапевтические препараты для пациентов с нейроэндокринными опухолями. В целом, люди, плохо знакомые с этим методом, поначалу будут испытывать трудности, по крайней мере, за то, чтобы вырастить 3D-стероиды одинаковой формы.

Ключом к этому является обеспечение равномерного покрытия 24-луночных планшетов агросом, а также обеспечение того, чтобы суспензии одиночных клеток были хорошо диспергированы и были точными. Чтобы понять гистологию 3D-стероидов, нам необходимо выполнить обработку парен и иммунохимическое окрашивание. Гисто-встраивание 3D-стероидов является ключевым этапом, который будет продемонстрирован к концу сегодняшнего дня: чтобы подготовить 1% аугуров для покрытия 24-луночных планшетов, добавьте один грамм аэроса в 100 миллилитров деионизированной воды в бутылку объемом от 250 до 500 миллилитров и автоклав для стерилизации аэроса после стерилизации.

Переложите бутылку на водяную баню при температуре 70 градусов Цельсия примерно на час. Чтобы аэрос охладился до 70 градусов по Цельсию, его необходимо постоянно держать стерильным. В шкафу биобезопасности используйте пипетку-репитер для дозирования 200 микролитров аэроса в каждую лунку от 2 до 24.

Ну и плоские донные пластины для этого протокола. Любой вид 24-луночных пластин с плоским дном будет работать до тех пор, пока пластины можно визуализировать под фазово-контрастным микроскопом: вращать аэродинамики вокруг лунки, чтобы она равномерно покрывала лунку. 200 микролитров аэроса оптимальны для формирования вогнутой поверхности, позволяющей сфероиду формировать последовательные сферические формы.

Примерно через 10 минут 24-луночные планшеты с аэросовым покрытием готовы к использованию. Клетки bon one, использованные в этом эксперименте, представляют собой нейроэндокринную опухоль поджелудочной железы человека или клетки, поддерживаемые клетками NET в D-M-E-M-F 12 с 10% FBS средой в стерильной чашке для культуры тканей в увлажнённом инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Когда однослойные соединения одной клетки достигают текучести от 70 до 80% Co, суспензии одиночных клеток готовятся в шкафу биобезопасности.

Извлеките среду и промойте клетки PBS дважды, выбейте клетки из чашки, добавив один миллилитр трип-ле и инкубируя при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки отделены от чашки, а затем добавьте девять миллилитров. Среда роста к трипсину.

Клетки глаза несколько раз поднимают и опускают клетки пипетки, чтобы обеспечить равномерную суспензию одной клетки. Используйте сетчатый фильтр для ячеек 70 микрон для фильтрации клеток. Соберите отфильтрованные клетки после проведения подсчета клеток, приготовьте суспензию 5 000 клеток на миллилитр в D-M-E-M-F 12 с ростом 10% FBS. Терпимая.

Количество ячеек, которые должны быть пластинами, должно быть определено опытным путем на основе размера сфер на шестой день. В идеале вы должны иметь размер спирта от 300 до 400 наномикрометров и диаметра. По этой причине мы тарелируем тысячу ячеек на 200 микролитров на лунку.

Чтобы начать эту процедуру, наложите 200 микролитров одноклеточной суспензии на каждую лунку с покрытием из ранее подготовленных 24-луночных пластин, запечатайте 24-луночные пластины стерильной потолочной лентой для предотвращения испарения. Поместите 24-луночные планшеты с аэродинамическим покрытием, содержащие bon one, на орбитальный шейкер при очень медленном перемешивании в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в воздухе, инкубируйте в течение ночи на следующее утро, переместите планшеты на устойчивую платформу и продолжайте выращивать культуры в инкубаторе. Каждые три дня.

Добавьте по 200 микролитров питательной среды в каждую лунку пластин. Чтобы не нарушить PHE, прикоснитесь наконечником пипетки к краю лунки и дайте среде стечь вниз по стенке лунки в лунку, контролируйте образование OID в 24-луночных планшетах под микроскопом. Медикаментозное лечение 3D-стероидами начинается на шестой день культивирования.

Когда сфероиды имеют диаметр от 300 до 400 микрон, это обозначается как нулевой день для медикаментозного лечения на шестой день. Каждая лунка планшетов содержит около 400 микролитров среды, чтобы гарантировать, что лекарственные препараты находятся в одной х конечной концентрации в каждой лунке для каждой дозы обработки, сделать в три раза больше желаемой концентрации, развести соответствующее количество запаса лекарственного средства в пяти миллилитрах питательной среды в конической пробирке объемом 15 миллилитров, что достаточно для восьми повторений PHE в каждом ряду из 24 луночных планшетов характеризуются как транспортные дозы 1, 2, 3, 4 и пять. На каждой 24-луночной пластине имеется четыре повтора для каждой дозы лечения.

Обычно 3D phe обрабатывают по меньшей мере в 2 24 луночных планшетах, что приводит по меньшей мере к восьми повторениям для каждой дозы лечения. Перед добавлением лечения в каждую скважину, прокрутите 24 луночные пластины, чтобы убедиться, что весь конденсат на потолочной ленте уходит в колодец из-за плавающей функции 3D-стероида. Среда в каждой лунке не удаляется после центрифугирования.

Чтобы избежать нарушения работы СФЭ, осторожно добавляйте по 200 микролитров каждой дозы обработки в соответствующие лунки вдоль стенки каждой. Хорошо запечатайте 24 лунки планшетов потолочной лентой и инкубируйте культуры в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в воздухе. Контролируйте 3D-культуры стероидов в каждый выбранный момент времени после медикаментозного лечения с помощью фазово-контрастного микроскопа.

Объектив с пятью кратами является идеальным, потому что объектив PHE быстро перерастает поле визуализации с объективом с 10-кратным увеличением. Получите изображения стероида в каждой лунке в каждый момент времени до введения HistoGel. Встраивая в сетку 3D стероиды собираются из 24 луночных планшетов и фиксируются в 10% формине.

Поместите тюбик с холодным Гистогелем в стакан, наполненный водой. Нагрейте стакан в микроволновой печи в течение одной минуты или до полного разжижения геля. Держите тюбик в том же стакане, наполненном водой, на протяжении всей процедуры.

С помощью одноразовой пластиковой пипетки. Перенесите весь стероид в криоформу для биопсии. Дайте стероиду постоять минуту, чтобы он опустился на дно биопсийной криоформы.

Попробуйте избавиться от жидкости в биопсийной криоформе с помощью салфеток Кима. Очень аккуратно протолкните стероид к центру на дне биопсийной криоформы с помощью зубочистки. Затем с помощью пипетки Пастера очень аккуратно удерживайте стероид в центре биопсийной криоформы.

Добавьте тонкий слой подогретого Гистогеля в криоформу для биопсии. Не добавляйте слишком много Гистогеля. Как раз достаточно для стабилизации стероидов в центре.

Дайте стероиду в Гистогеле постоять одну-две минуты при комнатной температуре или пока Гистогель не застынет. Заполните оставшуюся часть криоформы для биопсии подогретым гистогелем и дайте ей застыть при комнатной температуре в течение примерно 10 минут. Непосредственно перед извлечением этих OID HistoGel блокирует его из биопсийной криоформы.

Оставьте криоформу на льду на одну минуту, затем извлеките неповрежденный стероидный блок HistoGel. Заверните блок в кусок биообертки и поместите его в кассету для салфеток и биопсии. Храните ткань и биопсийную кассету в контейнере с 70% этанолом.

В дальнейшем выполняются рутинные процедуры обработки тканей для заделки парафина при выращивании на 24-луночных планшетах с аэродинамическим кодом. Различные клеточные линии сетки имеют различную морфологию, как показано здесь. Клеточная линия поджелудочной железы человека N 1 и клеточная линия H 7 27 легких человека образуют 3D стероиды.

В отличие от него, qgp один. Клетки поджелудочной железы человека представляют собой большие пористые массы, похожие на виноград, которые не считаются стероидами. После посева одной клетки на покрытой агросом 24-луночной пластине многоклеточного стероида обычно происходит к третьему или четвертому дню, а к шестому дню стероид становится более круглым.

Из-за ограничения питательных веществ и кислорода. Клетки в плотном ядре стероида начинают умирать примерно на 10-й день, а к 17-му дню стероиды начинают распадаться. Из-за большого размера или, в некоторых случаях, выброса некротического каната, стероид обычно может вырастать до 1000 микрон в диаметре.

В этом эксперименте 3D-стероиды шестого дня были выбраны в качестве отправной точки для лечения ингибитором гистоновой болезни триками статином А или TSA. Ранее сообщалось, что ингибиторы гистондеацетилазы проявляют антипролиферативное и прото-действие на сетевые клетки. Эти изображения отслеживают морфологию 3D-стероидов в начале лечения и через 24, 48, 72 и 96 часов.

V указывает на обработку транспортным средством, которым в данном случае является ДМСО. D от одного до D 5 представляют лечение с увеличением дозы TSA по размеру каждого индивидуума. OID был оценен автоматически с помощью специально разработанной компьютерной программы MATLAB.

По крайней мере, восемь sph были измерены на одну дозу TSA в каждый момент времени, и результаты представлены на этом графике относительно транспортного средства. Все дозы TSA показали некоторую степень ингибирования роста на 3D OID. При ТСА концентрации 125 наномоляров и 250 наномоляров рост 3D стероидов был сильно подавлен для понимания гистологии чистого 3D стероида.

H и e окрашивание и иммуногистохимическое окрашивание проводили на 3D стероидах, которые культивировались в течение 17 дней. KI 67 является маркером пролиферирующих клеток, в то время как расщепленная каспаза 3 является маркером апоптотических клеток. Результаты показывают, что клетки внешнего слоя 3D-стероида активно пролиферируют, но клетки внутри ядра в основном некротизированы или апоптотизированы.

После этой процедуры могут быть проведены дополнительные анализы, такие как анализ свечения титра клеток, чтобы определить жизнеспособность этих 3D-стероидов. После его разработки этот метод может быть расширен до 96 настенных пластин для выполнения высокопроизводительных экранов, что облегчит поиск терапевтических лекарств в исследованиях рака.