Терапия, тестирование в модели культуры на основе сфероида 3D клеток для головы и шеи плоскоклеточный рак

Общая цель этого метода in vitro заключается в создании трехмерных сфероидов клеточной культуры, которые позволяют тестировать современные стандартные или экспериментальные схемы терапии плоскоклеточного рака головы и шеи. Этот метод помогает нам понять трехмерный опухолевый рост клеток рака головы и шеи при воздействии радиации или химиолучевой терапии. Остается сказать, что работа с первичными опухолевыми клетками сложна и не всегда приводит к надежному трехмерному образованию сфероидов.

Демонстрировать процедуру будет Сабина Швенк-Цигер, техник из нашей лаборатории. При использовании первичных клеток из образца опухоли поместите образец на подходящую стерильную поверхность и тщательно разрежьте его стерильным одноразовым скальпелем на очень мелкие кусочки. После достаточного механического разделения первичной ткани перенесите ее во флакон, содержащий коллагеназу 1 и 2, и инкубируйте в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

Далее просейте смесь через 70 микрометровое сетчатое фильтр Falcon и промойте суспензию с помощью HBSS. После успешного разделения и последующей промывки перенесите суспензию, содержащую от одного до двух миллионов клеток, в колбу для клеточной культуры T75 для выращивания до субслияния при 37 градусах Цельсия в течение десяти дней. Под микроскопом подтвердите рост опухолевых клеток.

Подсчитайте клетки в культуре. Используя 96-луночный планшет со сверхнизкой адгезией и вогнутым круглым дном, затравите 5 000 клеток первичной опухоли, или от 1 000 до 2 000 клеток промежуточной клеточной линии, в 200 до 300 микролитров среды в лунки. Далее культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия.

Меняйте носители через день. Следите за тем, чтобы не отсасывать сфероид с пипеткой во время смены среды. Культивируйте сфероиды до тех пор, пока не будут наблюдаться трехмерные конгломераты клеток сфероидальной формы.

Не забывайте об исключении из дальнейших исследований скважин с нерегулярным или множественным сфероидальным образованием. Затем замените среду на среду с химиотерапевтическими препаратами и/или моноклональными антителами в желаемых концентрациях. Добавьте цисплатин в концентрациях 2,5, 5 или 10 микромоляров или 5-фторурацил в концентрации 30 микромоляров.

В этой процедуре измерьте размер сфероида после цифровой фотодокументации на шестой, 10-й и 16-й день с помощью графического программного обеспечения. После центрифугирования планшета при 520г в течение 2,5 минут удалите надосадочную жидкость. Затем промойте ячейки 1x PBS и снова центрифугируйте пластину, после чего удалите надосадочную жидкость.

Затем добавьте 100 микролитров раствора для отслоения ферментативных клеток в каждый флакон, чтобы сфероиды растворились. Впоследствии инкубируйте тарелку в течение восьми минут при температуре 37 градусов Цельсия. Проверьте на успешное растворение сфероидов под микроскопом.

Добавьте 100 микролитров DMEM. Далее центрифугируем планшет при 520г в течение 2,5 минут. Затем удалите надосадочную жидкость и суспензируйте клетки в 100 микролитрах DMEM.

Впоследствии, при необходимости, проводят коммерчески доступный колориметрический пролиферативный анализ и считывают анализ в ИФА-ридоре. Все клеточные линии могли бы генерировать надежные сфероиды с различиями в размере и времени считывания. Первичные клетки образовывали воспроизводимые сфероиды в пластинах со сверхнизким уровнем прикрепления.

Окрашивание Ki-67 показывает периферию культуры, демонстрирующую гораздо более высокие скорости пролиферации, чем центральные клетки, имитируя распределение питательных веществ в солидных опухолях слизистой оболочки, которые часто демонстрируют некротические ядра. Здесь рассматривается влияние нескольких методов химиотерапии и облучения на размер сфероида. Облучение двумя серыми цветами перед лечением цисплатином, привело к значительному уменьшению размера сфероида по сравнению с одним цисплатином.

С дальнейшим созданием сфероидов из первичных клеток человека, именно так может быть реализована концепция тестирования терапии. Сфероиды будут генерироваться после биопсии опухоли, а затем проверяться на молекулярные характеристики и восприимчивость к терапии. Нам удалось разработать протокол для получения воспроизводимых сфероидов из клеточных суспензий как для клеточных линий, так и для первичных опухолевых клеток человека.

Этот мультимодальный анализ достаточно чувствителен для выявления небольших различий между группами. В будущем этот анализ может быть использован для оценки индивидуальной реакции на стандартные и экспериментальные протоколы терапии. Во-вторых, дополнительно охарактеризовать опухолевые клетки из свежих образцов.

И, в-третьих, коррелировать реакцию терапии с молекулярными паттернами. Использование первичных клеток и генерация сфероидов позволит сохранить как можно больше характеристик роста опухоли in vivo в сочетании с экономически эффективным анализом для изучения индивидуального ответа на терапию.