Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

Este protocolo describe la generación de líneas celulares portadoras de un reportero luciferasa y el posterior monitoreo de los ritmos circadianos autónomos celulares mediante la expresión de bioluminiscencia. En primer lugar, construya reporteros de expresión de luciferasa mediante vectores lentivirales y produzca partículas lentivirales; luego, proceda a infectar las células de interés y amplifique las culturas seleccionadas. A continuación, supervise la expresión de bioluminiscencia en células reporteras sincronizadas utilizando un dispositivo de registro adecuado.

En última instancia, el registro de bioluminiscencia se utiliza para demostrar ritmos circadianos autónomos a nivel celular. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transfección transitoria y la protección de la línea germinal es que la integración está mediada por virus. El gen proporciona una integración estable en el genoma celular, así como una mayor eficiencia y versatilidad.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del reloj circadiano. Por ejemplo, ¿existen relojes circadianos específicos de tejido? De ser así, ¿cuáles son las propiedades de los relojes circadianos específicos de tejido?

Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos del reloj biológico, también puede aplicarse a otros sistemas, como la dinámica del ciclo celular, la tumorigénesis, etc. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando decidimos estudiar relojes biológicos específicos de tejidos o tipos celulares.

El procedimiento será demostrado por la Dra. Chita Norm Napkin, investigadora postdoctoral, y Sandra, una estudiante de posgrado de mi laboratorio Atory. Típicamente, un constructo reportero circadiano de mamífero contiene un casete de expresión en el que un promotor circadiano se fusiona con el gen de luciferasa. En este reportero lentiviral, la luciferasa inestable está bajo el control del promotor murino per dos.

Para obtener instrucciones detalladas sobre la construcción de vectores repórter mediante reacción de recombinación, consulte el manuscrito adjunto para una transfección eficiente. Comience con un cultivo de células renales embrionarias humanas de bajo número de pasajes que presenten una confluencia del 90 al 100 %. Ahora, recubra placas de cultivo de seis pocillos.

Para la transfección, agregue un mililitro de poli-L-lisina al 0,001 % a cada pocillo, incúbelo a temperatura ambiente durante 20 minutos y enjuague una vez con PBS. A continuación, recoga las células utilizando tripsina y siembre las células en cada pocillo de las placas previamente recubiertas. Agite suavemente las placas para obtener una distribución uniforme de las células.

Verifique que las células sembradas hayan alcanzado una confluencia del 80 al 90 % en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Prepare la mezcla de transfección del plásmido que contenga un plásmido reportero lentiviral, ADN y los tres vectores de empaquetamiento como control tanto para la transfección como para la infección subsiguiente. Incluya un pocillo adicional para un vector de expresión lentiviral de GFP que contenga la proteína verde fluorescente mejorada bajo el control del promotor CMV.

A continuación, agregue 100 microlitros de cloruro de calcio 0,25 molar a los plásmidos y mezcle completamente. Luego, agregue 100 microlitros de solución dos XBBS y mezcle suavemente pero a fondo. Incube la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Mientras espera, sustituya el medio de las células 293T con dos mililitros de medio fresco. Devuelva la placa al incubador durante al menos 10 minutos para equilibrar el pH del medio. A continuación, de forma gota a gota, agregue la mezcla de transfección a las células, agite suavemente la placa, observe la formación de partículas bajo el microscopio y luego coloque las células en el incubador durante la noche.

Aproximadamente 16 horas después de la transfección, reponga el medio con dos mililitros de DMEM fresco y cultive durante la noche. A continuación, para evaluar la eficiencia de transfección, analice la expresión de EGFP en las células de control de transfección. Una eficiencia de transfección del 90 al 100 % con alta expresión de EGFP es un indicador confiable de una buena preparación viral.

Recolecte el medio que contiene partículas virales infecciosas secretadas y centrifugue para eliminar las células 293T residuales y recoja el sobrenadante que contiene el virus. En el día tres, siembre aproximadamente 12.000 células 293T en una placa de 12 pocillos y cultívelas durante la noche hasta alcanzar una confluencia del 20 al 30 %, y observe las células el día cuatro. Aún el día cuatro, agregue polibrena al medio recolectado que contiene partículas virales y mezcle bien mediante pipeteo.

Ahora aspire el medio de las tres células T3 y añada un mililitro de mezcla vírica por pocillo. Incube a 37 grados Celsius durante la noche. Después de lavar las células una vez con PBS, reponga el medio e incube las células a 37 grados Celsius durante la noche para recuperación y crecimiento. Cuando estén confluentes, divida las células y cultívelas durante la noche al día siguiente.

Para iniciar la selección de células infectadas, agregue medio fresco que contenga 10 microgramos por mililitro. La concentración de blasticidina necesaria para matar las células debe determinarse empíricamente para cada línea celular. Renueve el medio que contiene blasticidina cada dos o tres días para la selección continua de células resistentes al antibiótico.

Expresión de los reporteros del reloj. Después de propagar el cultivo de células resistentes al reportero en placas de cultivo de 35 milímetros hasta alcanzar confluencia, generalmente preparamos tres o más placas para cada línea celular de reportero bajo cada condición para el fenotipo sarcí. Tras un lavado con PBS, añadir DMEM que contenga 10 micromolares de forlina o 200 nanomolares de dexametasona e incubar a 37 grados Celsius durante una hora para sincronizar las células.

Ahora coloque las células en medio de registro recién preparado. Cubra las placas de cultivo con cubreobjetos estériles de 40 milímetros y selle en su lugar con grasa de vacío para prevenir la evaporación. Coloque las placas en el luminómetro de ciclo lumous y comience la bioluminiscencia en tiempo real.

Grabación Para grabar 96 placas antiguas. Con el dispositivo de grabación GSR dos, véase el manuscrito complementario. Registramos fácilmente el ritmo durante cinco a siete días en el programa de análisis del ciclo lum.

Primero, ajuste los datos brutos a una línea base. Luego, utilice los datos con la línea base restada para ajustarlos a una onda sinusoidal y determinar los parámetros requeridos para muestras que muestran ritmos persistentes. Una bondad de ajuste superior al 90 % se logra fácilmente debido a la alta luminiscencia transitoria.

Colocar en sentido correcto y cambiar el medio. Normalmente excluimos el primer ciclo de datos de nuestro análisis para la presentación de los datos. Representar gráficamente los datos brutos frente al tiempo cuando sea necesario.

Represente gráficamente los datos restados de la línea base para comparar la amplitud y la fase tanto en la transfección transitoria de células 2 9 3 T como en la infección de líneas celulares. Las imágenes fluorescentes de las células transfectadas y transducidas que expresan GFP indican que el sistema de entrega génica mediado por lentivirus es altamente eficiente. El bucle central de retroalimentación de un reloj circadiano consiste en factores de transcripción que actúan sobre los elementos reguladores circadianos para producir una expresión génica rítmica.

Aquí, cuatro constructos reporteros diferentes en células T tres producen fases distintas de expresión del reportero. Se pueden generar fases intermedias novedosas mediante la regulación combinatoria por múltiples elementos circadianos utilizando la inhibición génica mediante ARNi y compuestos farmacológicamente activos. Este experimento utilizó el luminómetro lum cycle para la grabación de bioluminiscencia de células en placas de 35 milímetros en células U2 OS.

Se utilizó ARNi para iluminar los efectos de silenciamiento de los genes cry uno y cry dos. Aquí se empleó un luminómetro de sinergia para el registro de bioluminiscencia de células en una placa de 96 pocillos con tres células reporteras T tres.

Los ARN se utilizaron para evaluar los efectos de la inhibición triple sobre los ritmos celulares. En este ejemplo, se emplearon el sistema UX y un luminómetro tecan para la grabación de bioluminiscencia de células en 3 placas de 84 pocillos. Aunque se indicaron las placas seleccionadas, las moléculas pequeñas pueden dirigirse farmacológicamente y alterar la función proteica en los ritmos celulares de las células reporteras U2 OS.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de la biología circadiana, permitiendo explorar los mecanismos del reloj biológico y la fisiología en diferentes tipos de células y tejidos. Después de ver este video, se debería tener una buena comprensión de cómo generar líneas celulares con reportero Lucifer y cómo monitorear las emisiones.

Y no olvide que trabajar con el VIR puede ser extremadamente peligroso, y que siempre se deben tomar precauciones, como protecciones personales y descontaminación viral, al realizar este procedimiento.