Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

Este protocolo detalla la generación de líneas celulares reporteras de luciferasa y el posterior seguimiento de los ritmos circadianos autónomos de la expresión de bioluminiscencia. En primer lugar, se construyen los indicadores de expresión de luciferasa lentiviral y se producen partículas lentivirales, se procede a infectar las células de interés y se amplifican los cultivos seleccionados. A continuación, supervise la expresión de la bioluminiscencia en células indicadoras sincronizadas utilizando un dispositivo de registro adecuado.

En última instancia, el registro de bioluminiscencia se utiliza para demostrar los ritmos circadianos autónomos de las células. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transfección transitoria y la protección de la línea germinal, es que la VIR está mediada. El gen proporciona una integración estable en el genoma de las células, así como una mayor eficiencia y versatilidad.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de relojes citados. Por ejemplo, ¿existen relojes circadianos específicos para cada tejido? Si es así, ¿cuáles son las propiedades de los relojes circadianos específicos de tejidos?

Aunque este método puede proporcionar información sobre los mecanismos del reloj. También se puede aplicar a otros sistemas como la dinámica del ciclo celular, la tumorgénesis, etcétera. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando decidimos estudiar relojes de sujeción específicos para tejidos o tipos de células.

La Dra. Chita Norm Napkin, becaria postdoctoral, y Sandra, estudiante de posgrado de mi laboratorio Atory, demostrarán el procedimiento. Típicamente, una construcción reportera circadiana de mamíferos contiene un casete de expresión en el que un promotor circadiano se fusiona con el gen de la luciferasa. En este reportero lentiviral, la luciferasa desestabilizada está bajo el control del promotor del ratón por dos.

Para obtener instrucciones detalladas sobre la construcción de vectores indicadores por reacción de recombinación, consulte el manuscrito adjunto para una transfección eficiente. Comience con un cultivo de células de riñón embrionario humano de bajo número de paso que sean 90 a 100% confluentes. Ahora para recubrir seis, bien placas de cultivo.

Para la transfección, agregue un mililitro de licina de 0.001% de poli L a cada uno, incube bien a temperatura ambiente durante 20 minutos y enjuague una vez con PBS. A continuación, coseche las células con tripsina y siembre las células en cada pocillo de las placas prerrecubiertas. Gire las placas para obtener una distribución uniforme de las células.

Verifique que las células sembradas hayan alcanzado una confluencia del 80 al 90% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Prepare la mezcla de transfección de plásmidos de un plásmido indicador lentiviral, ADN y los tres vectores de empaquetamiento como control tanto para la transfección como para la infección posterior. Incluir un pocillo adicional para un vector de expresión lentiviral de GFP que alberga la proteína fluorescente verde mejorada bajo el control del promotor del CMV.

A continuación, agregue 100 microlitros de cloruro de calcio 0,25 molar a los plásmidos y mezcle bien. A continuación, añada 100 microlitros de dos soluciones XBBS y mezcle suave pero bien. Incuba la mezcla de ADN a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Mientras espera, reemplace el medio de las 2 9 3 células T con dos mililitros de medio fresco. Regrese la placa a la incubadora durante al menos 10 minutos para equilibrar el pH medio. A continuación, agregue la mezcla de transfección a las células, agite suavemente la placa, observe la formación de partículas bajo un microscopio y luego coloque las células en una incubadora durante la noche.

Aproximadamente 16 horas después de la transfección, reponga el medio con dos mililitros de DMEM fresco y el cultivo durante la noche. A continuación, para evaluar la eficiencia de la transfección, evalúe la expresión de EGFP en las células de control de transfección. La eficiencia de transfección del 90 al 100% con alta expresión de EGFP es un predictor confiable de una buena preparación viral.

Coseche el medio que contiene partículas virales infecciosas secretadas, centrifugue para eliminar las células T 2 9 3 residuales y recoja el virus que contiene supernat. En el tercer día, siembre aproximadamente 12, 003 células T tres células en un cultivo en placa de 12 pocillos durante la noche hasta un 20 a 30% de fluidez y observe las células en el cuarto día. Todavía en el cuarto día, agregue poly brain al medio recolectado que contiene partículas virales y mezcle bien mediante pipeteo.

Ahora aspire el medio de las tres células T tres y agregue un mililitro de mezcla viral por pocillo. Incubado a 37 grados Celsius durante la noche después de lavar las células una vez con PBS, reponer el medio e incubar las células a 37 grados Celsius durante la noche para su recuperación y crecimiento. Cuando se dividen las células y se cultivan durante la noche del día siguiente.

Para iniciar la selección de las células infectadas, agregue un medio fresco que contenga 10 microgramos por mililitro. Dejando a un lado lo blástico, el ácido blastóstico en el coche de muerte debe determinarse empíricamente para cada línea celular. Reponga el medio que contiene blastina cada dos o tres días para una selección continua de células resistentes a los antibióticos.

Expresando reporteros de reloj. Después de propagar el cultivo de células reporteras resistentes a la blastina en placas de cultivo de 35 milímetros hasta que confluyan, generalmente preparamos tres o más placas para cada línea de células reporteras en cada condición para el fenotipo sarcánico. Después de un lavado con PBS, agregue DMEM que contiene 10 micromolares de forlina o 200 nanomolares de dexametasona incubados a 37 grados centígrados durante una hora para sincronizar las células.

Ahora coloque las celdas en un medio de grabación recién hecho. Cubra las placas de cultivo con cubreobjetos estériles de 40 milímetros y séllelas en su lugar con grasa al vacío para evitar la evaporación. Cargue los platos en el luminómetro de ciclo luminoso e inicie la bioluminiscencia en tiempo real.

Grabación Para la grabación de 96 placas antiguas. Con el dispositivo de grabación GSR de dos ver manuscrito de acompañamiento. Registramos fácilmente el ritmo durante cinco a siete días en el programa de análisis del ciclo lum.

La primera línea de base se ajusta a los datos brutos. A continuación, utilice los datos sustraídos de línea base para ajustarlos a una onda sinusoidal y determine los parámetros necesarios para las muestras que muestran ritmos persistentes. Una bondad de los datos de pies hacia arriba superior al 90% se logra fácilmente debido a la alta transitoria de Luminate.

Siente hacia arriba y media el cambio. Por lo general, excluimos el primer ciclo de datos de nuestro análisis para la presentación de datos. Trace los datos sin procesar en función del tiempo cuando sea necesario.

Represente los datos sustraídos de referencia para comparar la amplitud y la fase tanto en la transfección transitoria de 2 9 3 células T como en la infección de líneas celulares. Las imágenes fluorescentes de las células transfectadas y transducidas que expresan GFP indican que el sistema de administración de genes mediado por lentivirus es altamente eficiente. El bucle de retroalimentación central de un reloj circadiano consta de factores transcripcionales que actúan sobre los elementos potenciadores circadianos para producir la expresión génica rítmica.

Aquí, cuatro construcciones reporteras diferentes en tres células T tres producen fases distintas de expresión reportera. Se pueden generar nuevas fases intermedias con regulación combinatoria por múltiples elementos circadianos utilizando la eliminación de genes a través de ARNi y compuestos farmacológicamente activos. Este experimento utilizó el luminómetro de ciclo lum para el registro de bioluminiscencia de células en placas de 35 milímetros en células U2 OS.

Irna se utilizó para iluminar los efectos de derribo de los genes cry one y cry two. En este caso, se utilizó un luminómetro de sinergia para el registro de la bioluminiscencia de las células. En una placa de 96 pocillos en tres celdas T tres reporteras.

Los ARN se utilizaron para evaluar los efectos de la eliminación triuna en los ritmos celulares. En este ejemplo, se utilizó el sistema UX y un luminómetro tecan para el registro de la bioluminiscencia de las células en 3 84. Mientras se seleccionan las placas, como se indica, las moléculas pequeñas pueden dirigirse farmacológicamente y perturbar la función de la proteína en los ritmos celulares de las células reporteras del sistema operativo U2.

Después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo de la biología circadiana para explorar los mecanismos del reloj y la fisiología en diferentes tipos de células y tejidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar Lucifer, informar líneas celulares y monitorear los volúmenes.

Y no olvide que trabajar con el VIR puede ser extremadamente peligroso, y las pretensiones, como las protecciones personales y la descontaminación viral, siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.