Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón
25 de noviembre de 2012
Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.
El primer paso consiste en armar el dispositivo a partir de un juego para extracción de sangre. Corte una aguja de calibre 25 y tres cuartos de esta longitud de ocho centímetros de tubo estéril. Con un sistema de bloqueo tipo luer, puede adquirir una aguja capilar de vidrio con un diámetro de cien micrones, o fabricar una usted mismo con un micropipeteador Sutter P 97, y luego aspire solución salina estéril para llenar el espacio muerto del tubo.
Sujete un tubo capilar de vidrio al extremo del tubo plástico estéril, expulse algo de solución salina a través de la aguja para asegurarse de que esté correctamente fijado y no presente fugas. Si observa bajo un microscopio, examine la presión aplicada y la velocidad de expulsión del líquido a través de la punta fina; utilizaremos una solución coloreada para representar el vector viral o las células madre. Coloque esto en una placa de Petri estéril, aspire un poco de aire y luego la solución de inyección.
Para nuestros fines, utilizamos P cinco ratones. En esta imagen, puede observarse el hocico. La ubicación del ojo está cubierta por un párpado.
Las líneas punteadas muestran el borde del párpado y el pliegue del párpado donde se realizará la incisión. Tijeras rectas y finas se utilizan para hacer una incisión de un milímetro y medio a lo largo del párpado cerrado. Pinzas de presión para fisuras se emplean para separar los párpados y sacar el ojo, colocando el borde del párpado ligeramente detrás del globo ocular.
Para realizar la esclerotomía, es importante poder identificar algunos puntos de referencia. La transición entre la córnea transparente y la esclerótica está marcada por el limbo. Justo dentro de la esclerótica se encuentra el epitelio pigmentario retiniano, luego la retina y después el vítreo. Matomy se coloca a la mitad de la distancia hacia atrás o en el ecuador del globo ocular, realizando un rasguño en la superficie con una hoja microquirúrgica de 15 grados en animales de pigmentación oscura.
Se hará visible un tejido pigmentado de color marrón oscuro en el punto de la incisión. Si la incisión se realiza demasiado lejos, en realidad verá salir líquido. Esto representa el vítreo y significa que ha ido demasiado lejos.
Pasando la retina de RPE. Esta incisión podría utilizarse para una inyección intravítrea. Ahora, elija su propio animal.
En este punto, la incisión está completa. Incisiones adicionales y rasguños liberarán el vítreo para una inyección subretiniana; el objetivo consiste en colocar el tubo de vidrio capilar microfino en el espacio subretiniano, justo entre la retina y el epitelio pigmentario retiniano (RPE). Si la incisión es demasiado profunda, la aguja puede atravesar la retina y adentrarse en el vítreo. Inserte la aguja paralela a la pared externa del ojo.
Para acceder al espacio subretiniano. Aplique una ligera presión sobre el émbolo y comience a inyectar el líquido. Si la aguja está colocada correctamente, se sentirá una resistencia moderada y se creará un BLE en el espacio subretiniano.
Si la aguja está en el vítreo, hay una presión contraria significativamente menor. Para evitar un reflujo importante, mantenga el émbolo en su lugar durante 15 segundos adicionales antes de retirar la aguja. Esto permitirá que la presión intraocular se estabilice.
Empuje suavemente el ojo hacia atrás, detrás de los párpados y dentro de la órbita, utilizando fórceps curvos para apósitos. Aquí hay otro ejemplo de una inyección subretiniana en el que el colorante llena el espacio subretiniano y es claramente visible en un animal albino. El menisco de aire permite ver cuándo se alcanza el final de la inyección.
Las inyecciones de líquido en un ojo con pigmentación oscura son un poco más difíciles. La inserción cuidadosa de la aguja permitirá obtener excelentes resultados.
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Descripción general
Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón. El proceso implica el ensamblaje cuidadoso de un dispositivo para la administración precisa de los agentes terapéuticos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Terapia génica
- Investigación con células madre
- Oftalmología
Antecedentes
- La terapia génica tiene como objetivo tratar o prevenir enfermedades mediante la introducción de material genético en las células.
- Las células madre tienen la capacidad de regenerar tejidos dañados.
- El espacio subretiniano es una zona crítica para las intervenciones oculares.
- Los modelos de ratón se utilizan comúnmente en estudios preclínicos en la investigación de la visión.
Objetivo del estudio
- Demostrar una técnica quirúrgica para la administración de vectores de terapia génica.
- Explorar el potencial de las células madre en el tratamiento de enfermedades retinianas.
- Perfeccionar métodos para inyecciones precisas en el ojo.
Métodos Utilizados
- Ensamblaje de un dispositivo a partir de un juego de recolección de sangre.
- Preparación de una aguja de capilar de vidrio para inyección.
- Aspiración de solución salina estéril para llenar el dispositivo.
- Uso de una solución coloreada para representar el vector viral o las células madre durante el procedimiento.
Resultados principales
- El dispositivo permite una inyección controlada en el espacio subretiniano.
- Visualización exitosa de la eyección del líquido bajo un microscopio.
- Demuestra la viabilidad de la técnica para aplicaciones de terapia génica.
- Implicaciones potenciales para futuros tratamientos de enfermedades retinianas.
Conclusiones
- Esta técnica proporciona un método confiable para la administración de terapia génica.
- Se necesitan estudios adicionales para evaluar los resultados a largo plazo.
- Abre vías para tratamientos innovadores en trastornos retinianos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta técnica quirúrgica permite la administración precisa de vectores de terapia génica y células madre al espacio subretiniano en ojos de ratones perinatales, facilitando la validación preclínica de terapéuticas oculares. Al minimizar el daño tisular y garantizar una correcta localización, el método mejora la reproducibilidad en flujos de trabajo de descubrimiento temprano para modelos de enfermedades retinianas. Proporciona una plataforma escalable para evaluar candidatos terapéuticos antes de avanzar a estudios en animales más grandes o investigaciones habilitantes para solicitudes de nuevos fármacos (IND).
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación funcional de constructos de terapia génica en un microentorno ocular relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Facilita la validación del blanco al confirmar la administración a las capas celulares retinianas deseadas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantificables de la distribución de vectores o células mediante la visualización de la formación de blebs en el espacio subretiniano.
- Valor operativo: Estandariza los parámetros de inyección para lograr una dosificación reproducible de compuestos o células en diferentes cohortes del estudio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la evaluación longitudinal del injerto o expresión en modelos perinatales.
- Valor operativo: Permite pruebas de respuesta a la dosis, fundamentales para el perfilado preclínico de seguridad y eficacia.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, especialmente para terapias oculares génicas y celulares.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis sobre el tropismo del vector, la actividad del promotor o el injerto de células madre en el nicho retiniano.
- Selección: Administra volúmenes estandarizados de agentes terapéuticos para permitir la selección comparativa de candidatos.
- Análisis: Proporciona lecturas visuales y espaciales (por ejemplo, tamaño del bleb, fluorescencia) para cuantificar el éxito de la administración.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con estudios preclínicos mediante la validación de la administración en un modelo de ojo neonatal fisiológicamente relevante.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma quirúrgica reutilizable para la prueba iterativa de múltiples vectores o líneas celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la interacción con el blanco al confirmar la localización subcelular de los agentes administrados.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante el ensamblaje estandarizado del dispositivo y la técnica de inyección.
- Valor estratégico: Reduce los retrasos en la desviación biológica al permitir una validación funcional temprana in vivo.
- Impacto en la cartera: Apoya las decisiones de continuar o descartar basadas en métricas de eficiencia de administración e integridad del tejido.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía y conocimiento de la anatomía ocular neonatal.
- Depende de instrumentos de precisión, incluidas hojas microquirúrgicas, pinzas y herramientas para la preparación de capilares de vidrio.
- Necesita una formación estandarizada para minimizar la variabilidad en la profundidad de la incisión y la colocación de la aguja entre diferentes operadores.
- Debe tener en cuenta los desafíos de visualización dependientes de la pigmentación al adaptarse a diferentes cepas de ratones.
- Está limitado por la habilidad técnica necesaria para evitar la penetración del vítreo y garantizar la colocación subretiniana.
