Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

El protocolo demuestra cómo generar eficientemente células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de cuatro mililitros de sangre periférica. En el día cero, aísle y expanda las células mononucleares de la muestra de sangre periférica. Transduzca las células primarias con el vector de codificación de reprogramación de células madre.

En el día nueve, proceda a sembrar las células transducidas sobre fibroblastos embrionarios de ratón inactivados y cultive durante aproximadamente tres semanas. Seleccione las colonias similares a CESH para su expansión y caracterización. Resultados de la tinción de inmunofluorescencia para la expresión de marcadores de pluripotencia como SS EEA cuatro, trial uno 60 y trial 180 1.

Demostrar la generación eficiente de células madre pluripotentes inducidas humanas. El uso del vector antiviral de células madre para generar células madre pluripotentes inducidas humanas ofrece varias ventajas sobre otros métodos existentes. Quizás lo más atractivo sea la simplicidad general del enfoque, ya que requiere acceso fácil al tejido donante, y con eso me refiero a muestras fácilmente obtenibles de sangre periférica.

Los atributos más importantes de este método son la eficiencia de la reprogramación y la calidad de los clones de células IPS obtenidos. La realización del procedimiento será demostrada por Andrea January Summer, investigadora postdoctoral en mi laboratorio, y Sarah Rozelle, estudiante de posgrado en el laboratorio de George Murphy. Todo en el día cero.

Extraiga cuatro mililitros de sangre periférica en un tubo vacutainer para preparación celular con citrato de sodio. Invierta el tubo de ocho a 10 veces dentro de las dos horas posteriores a la recolección. Centrifugue la muestra a 1.800 G durante 30 minutos a temperatura ambiente para recolectar las células mononucleares.

Aspire el plasma y pipetee el coágulo leucocitario, la capa celular entre la barrera de gel y el plasma. Transfiera el coágulo leucocitario a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y complete el volumen hasta 10 mililitros con PBS estéril. Invierta los tubos varias veces y centrifugue a 300 ×g durante 15 minutos.

Reuspenda el sedimento celular en 10 mililitros de PBS estéril, realice un recuento celular y luego transfiera de uno a dos veces 10 a la sexta células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Recoga las células por centrifugación y reuspenda el sedimento en dos mililitros de medio de expansión. A continuación, siembre las células mononucleares aisladas en un pocillo de una placa de 12 pocillos y cultive a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.

Recolecte las células restantes por centrifugación y congele alícuotas de aproximadamente dos veces 10 a la sexta células por vial en FBS que contenga 10% de DMSO los días tres y seis. Transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y lave el pocillo una vez con un mililitro de medio para células madre QBSF 60. Para recolectar las células adherentes.

Recoger las células por centrifugación, resuspender el sedimento celular en dos mililitros de em. A continuación, transferir la suspensión celular a un pocillo de una placa de 12 pocillos y devolver el cultivo al incubador en el día nueve. Transferir las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y lavar el pocillo una vez con un mililitro de medio para células madre QB SF 60 para recoger las células adheridas; centrifugar el cultivo a 300 ×g durante 10 minutos.

A continuación, resuspenda el botón celular en un mililitro de EM fresco que contenga cinco microgramos por mililitro de polibreno y lentivirus STEM para una MOI de uno a 10. Luego, transfiera la suspensión a un pocillo de una placa de 12 pocillos y centrifugue a 2.250 RPM durante 90 minutos a 25 grados Celsius. Añada un mililitro adicional de EM fresco que contenga cinco microgramos por mililitro de polibreno para un volumen total de dos mililitros de EM y coloque la placa en el incubador de cultivo celular el día 10.

Después de recolectar las células como se mostró anteriormente, suspenda el sedimento celular en dos mililitros de medio de cultivo EM. Las células transducidas en un pocillo de una placa de 12 pocillos el día 11 recubren los pocillos de una placa de 6 pocillos con gelatina al 0,1 %, luego siembre los fibroblastos embrionarios de ratón inactivados a dos veces 10 a la quinta células por pocillo en medio meth. Prepare tres pocillos por infección.

Al día siguiente, recolecte las células mononucleares transducidas como se mostró anteriormente. Después de la centrifugación, re suspenda el sedimento celular en tres mililitros de medio metH que contiene BFGF. Ácido ascórbico y factores de crecimiento.

Ahora aspire el medio de la placa MES, un mililitro de las MCs por pocillo de OFMs. A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio de metilo completo y centrifugue la placa a 500 RPM a 25 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, cultive a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante dos días a partir del día 14 en adelante.

Reponga el medio cada dos días con 2,5 mililitros de medio con metionina que contenga 10 nanogramos por mililitro de BFGF y 50 microgramos por mililitro de ácido ascórbico, pero sin factores de crecimiento. Alrededor del día 20, una vez que aparezcan colonias pequeñas, alimente las células diariamente con dos mililitros de medio para células madre embrionarias humanas entre los días 30 y 40. Seleccione cada colonia y transfiérala a pozos individuales de una placa de 12 pozos previamente recubiertos con maths inactivadas, conteniendo un mililitro por pozo de medio HESC más inhibidor de ROCK; alimente las células diariamente.

Posteriormente, con un mililitro de medio HESC sin el inhibidor de ROCK, las células madre pluripotentes derivadas de monocitos humanos ya están listas para la tinción de inmunofluorescencia de marcadores de pluripotencia y también para la eliminación del casete de reprogramación integrado. Durante este protocolo, las células experimentan varios cambios morfológicos desde los BMC hasta la generación de iPSC humanas. En el día cero, las células mononucleares aisladas de sangre periférica se cultivan en medio de expansión tras nueve días.

Se observan racimos de uvas similares a agrupaciones de células, lo que sugiere que las células están sanas y proliferando antes de la transducción. Alrededor del día 21, semana después de que las células se siembran sobre las MA, se forman colonias. En el día 30, las colonias de IPSC muestran una morfología típica de células madre embrionarias humanas.

Este análisis de inmunofluorescencia de IPC generados a partir de pbmc muestra la expresión de los marcadores de pluripotencia SSEA cuatro, trial uno 60 y trial 180 1. Las I PSC también presentan tinción positiva para fosfatasa alcalina. Estas imágenes muestran los pasos para generar IPC libres de transgenes mediante transfección con un plásmido coexpresando la recombinasa CRE y un gen de resistencia a la puromicina, como se describe en Summers et al. 2010; en comparación con los IPC antes de la transfección, se observa muerte celular.

Después de dos días de selección con puromicina, aparecen nuevas colonias a partir de células resistentes alrededor de los 10 días posteriores a la transfección. Los análisis de sangre southern en colonias seleccionadas confirman la eliminación del transgén. Las líneas 1, 3, 5 y 7 muestran la presencia del transgén en los clones de IPSC antes de la eliminación. Estas bandas están ausentes en las líneas 2, 4, 6 y 8 tras la eliminación del transgén. Después de ver este video, usted debería ser capaz de generar de forma constante y robusta células IPS humanas de alta calidad, normales o específicas de enfermedades, a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica de cualquier individuo.

Este enfoque simplifica el proceso de reprogramación de células somáticas para hacerlo ampliamente accesible para la comunidad de células madre. Al mismo tiempo, proporciona una base para la generación de poblaciones más homogéneas de líneas de células madre.