Name: Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante un vector lentiviral único. Este protocolo simplifica la reprogramación celular para aplicaciones en medicina regenerativa.

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Estos estudios fueron financiados en parte por el NIH UO1HL107443-01 Premio a GJM y GM.

1. El aislamiento y la expansión de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) DÍA 0 <ol><li> Dibujar 4 ml de sangre periférica en un tubo BD Vacutainer CPT Preparación célula con citrato de sodio. Invertir el tubo de 8 a 10 veces y centrifugar a 1.800 xg durante 30 min a temperatura ambiente. Idealmente, este paso se debe hacer dentro de 2 horas de recogida. </li><li> Recoger las células mononucleares (MC) pipeteando la capa leucocitaria (capa de células de barrera entre el gel y plasma) en un tubo estéril de 15 ml de centrífuga cónico. Llevar a un volumen total de 10 ml estéril con salina tamponada con fosfato (PBS), invertir varias veces y centrifugar a 300 xg durante 15 min. </li><li> Resuspender las células en 10 ml de PBS estéril y realizar el recuento de células. Transferir 1 a 2x10 6 células en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml cónico y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de medio de expansión (EM) (QBSF-60 Stem medio celular que contenía 50 mg / ml AscoÁcido RBIC, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml de IL-3, 2 U / ml de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, dexametasona 1 mM y 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep) y transferir a un pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Centrifugar las células restantes a 300 x g durante 10 min y congelación ~ 2x10 6 células / vial en FBS que contenía 10% de DMSO. </li><li> Para iniciar el protocolo utilizando PBMCs congeladas, descongelar 1 vial de células en 10 ml de medio de QBSF y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a un pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> Los días 3 y 6 <ol start="17"><li> Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a un pocillo de un 12Y placa. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> 2. La transducción de las PBMCs con STEMCCA Lentivirus DÍA 9 <ol><li> Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en 1 ml de EM fresco que contenía 5 mg / ml de polibreno y lentivirus STEMCCA (MOI = 1 a 10) y la transferencia a un pocillo de una placa de 12 pocillos. (El protocolo que describe la producción de partículas lentivirales se puede encontrar en <a href="http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/" target="_blank">http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/</a> ) </li><li> Se centrifuga la placa a 2.250 rpm a 25 ° C durante 90 min. </li><li> Después de girar, agregar un adicional de 1 ml de EM frescas que contiene 5 g / ml de polibreno durante un total de 2 ml de medio y se incuba la placa en un 37 ° C,5% de CO 2 incubadora. </li></ol> DÍA 10 <ol start="16"><li> Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico y lavar el bien una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender las células en 2 ml de EM y transferir a 1 pocillo de una placa de 12 pocillos. Se incuban las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> 3. Revestimiento células transducidas en MEFs DÍA 11 <ol><li> Recubrir los pocillos de una placa de 6 pocillos con 0,1% de gelatina y fibroblastos placa inactivadas embriones de ratón (MEFs) a 2x10 5 células / pocillo en medio de MEF (IMDM que contenía 10% de FBS, 1% no aminoácidos esenciales, 100 mM β- mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep). Prepare 3 pozos por infección. </li></ol> DÍA 12 <ol start="2"><li> Transferir las células a un tubo estéril de 15 ml cónico<html> y lavar el pozo una vez con 1 ml de QBSF-60 Media de células madre para recoger las células adherentes. </li><li> Resuspender las células en 3 ml de medio de MEF que contiene 10 ng / ml de bFGF, y ácido ascórbico y los factores de crecimiento en las mismas concentraciones que se utilizan en EM media (50 mg / ml de ácido ascórbico, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 mM de dexametasona). </li><li> Placa de 1 ml de células por pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía MEFs. Añadir 1,5 ml de MEF medios de comunicación con el bFGF, ácido ascórbico, y factores de crecimiento para un total de 2,5 ml de medio / pocillo. </li><li> Se centrifuga la placa a 500 rpm a 25 ° C durante 30 min. Se incuba la placa en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li></ol> DÍA 14 <ol start="6"><li> Células de alimentación cada dos días con 2,5 ml de medio de MEF que contienen 10 ng / ml de bFGF y 50 ug / ml de ácido ascórbico (sin factores de crecimiento). Aspirar y desechar las células flotantes con cada toma. </li><li> Añadir MEFs adicional cuando sea necesario (generalmente una vez a la semana). </li></ol>p &quot;&gt; ~ DÍA 20 <ol start="8"><li> Una vez que aparecen pequeñas colonias, las células de alimentación diaria con 2 ml de células madre embrionarias humanas (hESC) medio (DMEM/F12 que contiene reemplazo del 20% Knockout Serum, 1% no aminoácidos esenciales, 100 mM β-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina , 100 mg / ml o primocin 1% Pen / Strep y 10 ng / ml de bFGF). </li></ol> 4. Picking y expansión de clones de IPSC ~ DÍA 30 a 40 <ol><li> Recoger cada colonia en pocillos individuales de una placa de 12-así pre-siembra con MEFs inactivada que contiene 1 ml / pocillo de medio de hESC más 10 mM de Stemolecule Y27632 (ROCK inhibidor). </li><li> Alimentar a las células al día posteriormente con 1 ml de medio de hESC sólo (sin inhibidor ROCK). </li></ol> 5. La tinción de inmunofluorescencia para marcadores de pluripotencia <ol><li> La tinción se realizó utilizando el kit &quot;célula ES Marker Kit de muestra&quot; de Millipore y siguiendo el protocolo del fabricante. </li></ol> 6. Escisión de Integnominal STEMCCA Vector <ol><li> Escisión de reprogramación casete se logra utilizando un Cre-IRES-Puro expresando vector de transfección y tras breve selección puromicina como se describe 6. </li></ol>

<ol><li>Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotency%3A+history%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications.</a> Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).</li>
<li>Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+lung+disease-specific+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+a+single+excisable+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette.</a> Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+human+iPS+cell+derivation+by+a+non-integrating+plasmid+from+blood+cells+with+unique+epigenetic+and+gene+expression+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures.</a> Cell Res. 21, 518-529 (2011).</li>
<li>vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+the+in+vitro+erythroid+expansion+potential+resides+in+CD34%28-%29+cells%2C+outweighing+the+contribution+of+CD34%28%2B%29+cells+and+significantly+increasing+the+erythroblast+yield+from+peripheral+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples.</a> Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Nos en la presente memoria se describe el uso del vector lentiviral STEMCCA para generar iPSCs humanos a partir de células mononucleares aisladas de unos pocos mililitros de sangre periférica recién recogida. El protocolo también se puede utilizar para reprogramar PBMCs congeladas (obtenidos directamente a partir de la capa leucocitaria), un detalle de importantes implicaciones prácticas cuando se utilizan células de donantes adquiridos desde una ubicación distante. Antes de la inducción de la reprogramación, PBMCs aisl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer CPT Celular Preparación del tubo con citrato de sodio </td><td> BD Biosciences </td><td> 362760 </td><td></td></tr><tr><td> QBSF-60 Stem medio celular </td><td> De calidad biológica </td><td> 160-204-101 </td><td></td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11330 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biológicos </td><td> S10250 </td><td></td></tr><tr><td> Knockout Serum reemplazo </td><td> Invitrogen </td><td> 10828 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-pm-2 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> No esenciales Aminoácidos </td><td> Invitrogen </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> MP Biomedicals </td><td> 190242 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> Sigma </td><td> A4544 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 291-G1 </td><td></td></tr><tr><td> IL-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 203-IL </td><td></td></tr><tr><td> SCF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 255-SC </td><td></td></tr><tr><td> EPO </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 286-EP </td><td></td></tr><tr><td> Dexametasona </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> H-9268 </td><td></td></tr><tr><td> bFGF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td><td></td></tr><tr><td> Stemolecule Y27632 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0012 </td><td></td></tr><tr><td> ES Cell Marker Kit de muestra </td><td> Millipore </td><td> SCR002 </td><td></td></tr></tbody></table>

generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el stemcca vector lentiviral

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

A través de la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción, Oct4, Klf4, Sox2 y cMyc, las células somáticas humanas se puede convertir en un estado pluripotente, generando así llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPS) 1-4. Específicos del paciente iPSCs carecen de las preocupaciones éticas que rodean a las células madre embrionarias (CME) y pasaría por alto el rechazo inmunológico posible. Por lo tanto, iPSCs han atraído una considerable atención por los estudios de modelos de enfermedades, la detección de compuestos farmacológicos y terapias regenerativas 5. Hemos demostrado la generación de transgén libres de iPSCs humanos de pacientes con enfermedades pulmonares diferentes usando una sola extirpable policistrónico Stem lentiviral casete celular (STEMCCA) que codifica los factores de Yamanaka 6. Estas líneas IPSC se generaron a partir de fibroblastos de la piel, el tipo de célula más común utilizado para la reprogramación. Normalmente, la obtención de fibroblastos de piel requiere un punzón de biopsia seguida por la expansión de la células en la cultura de algunos pasajes. Es importante destacar que, un número de grupos han informado de la reprogramación de células humanas de sangre periférica en iPSCs 7-9. En un estudio, una versión inducible Tet del vector STEMCCA se empleó 9, que requiere las células de la sangre que se infectan simultáneamente con un lentivirus constitutivamente activa que codifica el transactivador inverso tetraciclina. En contraste con los fibroblastos, las células de sangre periférica pueden recogerse a través de procedimientos mínimamente invasivos, reduciendo considerablemente el malestar e incomodidad del paciente. Un protocolo sencillo y eficaz para la reprogramación de células de la sangre utilizando un vector constitutiva sujetos a impuestos especiales solo pueden acelerar la aplicación de la tecnología IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia. Además, la reprogramación de células de sangre periférica permite la generación de iPSCs de individuos en los que las biopsias de piel debe ser evitado (es decir. Aberrante cicatrización) o debido a condiciones de enfermedad pre-existentes Preventing acceso a biopsias. Aquí se demuestra un protocolo para la generación de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando una única floxed-extirpable vector lentiviral que expresa constitutivamente los 4 factores. PBMC recién arrancadas o descongelados se expanden durante 9 días descrita 10,11 en ácido ascórbico que contiene medio, SCF, IGF-1, IL-3 y EPO antes de ser transducidas con el lentivirus STEMCCA. Después las células se sembraron en MEFs y ESC-como colonias se puede visualizar dos semanas después de la infección. Finalmente, los clones seleccionados se expanden y se ensayaron para la expresión de los marcadores de pluripotencia SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81. Este protocolo es simple, robusto y muy consistente, proporcionando una metodología fiable para la generación de iPSCs humanos fácilmente accesible desde 4 ml de sangre.

Se demuestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos a partir de PBMCs utilizando un vector lentiviral único. Figura 1A muestra una representación esquemática del protocolo. La sangre se recogió en un tubo BD Vacutainer CPT Preparación célula con citrato de sodio, y después de la centrifugación, las células mononucleares se pueden recoger de la interfaz entre el gel de poliéster y el plasma (buffy coat) (Figura 1B). Las PBMC aisladas se expanden en cultivo duran...

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Mediante la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción, Oct4, Klf4, Sox2 y cMyc, las células somáticas humanas pueden convertirse a un estado pluripotente, ...

El protocolo demuestra cómo generar eficientemente células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de cuatro mililitros de sangre periférica. En el día cero, aísle y expanda las células mononucleares de la muestra de sangre periférica. Transduzca las células primarias con el vector de codificación de reprogramación de células madre.En el día nueve, proceda a sembrar las células transducidas sobre fibroblastos embrionarios de ratón inactivados y cultive durante aproximadamente tres semanas. Seleccione las colonias similares a CESH para su expansión y caracterización. Resultados de la tinción de inmunofluorescencia para la expresión de marcadores de pluripotencia como SS EEA cuatro, trial uno 60 y trial 180 1.Demostrar la generación eficiente de células madre pluripotentes inducidas humanas. El uso del vector antiviral de células madre para generar células madre pluripotentes inducidas humanas ofrece varias ventajas sobre otros métodos existentes. Quizás lo más atractivo sea la simplicidad general del enfoque, ya que requiere acceso fácil al tejido donante, y con eso me refiero a muestras fácilmente obtenibles de sangre periférica.Los atributos más importantes de este método son la eficiencia de la reprogramación y la calidad de los clones de células IPS obtenidos. La realización del procedimiento será demostrada por Andrea January Summer, investigadora postdoctoral en mi laboratorio, y Sarah Rozelle, estudiante de posgrado en el laboratorio de George Murphy. Todo en el día cero.Extraiga cuatro mililitros de sangre periférica en un tubo vacutainer para preparación celular con citrato de sodio. Invierta el tubo de ocho a 10 veces dentro de las dos horas posteriores a la recolección. Centrifugue la muestra a 1.800 G durante 30 minutos a temperatura ambiente para recolectar las células mononucleares.Aspire el plasma y pipetee el coágulo leucocitario, la capa celular entre la barrera de gel y el plasma. Transfiera el coágulo leucocitario a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y complete el volumen hasta 10 mililitros con PBS estéril. Invierta los tubos varias veces y centrifugue a 300 ×g durante 15 minutos.Reuspenda el sedimento celular en 10 mililitros de PBS estéril, realice un recuento celular y luego transfiera de uno a dos veces 10 a la sexta células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Recoga las células por centrifugación y reuspenda el sedimento en dos mililitros de medio de expansión. A continuación, siembre las células mononucleares aisladas en un pocillo de una placa de 12 pocillos y cultive a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono.Recolecte las células restantes por centrifugación y congele alícuotas de aproximadamente dos veces 10 a la sexta células por vial en FBS que contenga 10% de DMSO los días tres y seis. Transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y lave el pocillo una vez con un mililitro de medio para células madre QBSF 60. Para recolectar las células adherentes.Recoger las células por centrifugación, resuspender el sedimento celular en dos mililitros de em. A continuación, transferir la suspensión celular a un pocillo de una placa de 12 pocillos y devolver el cultivo al incubador en el día nueve. Transferir las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y lavar el pocillo una vez con un mililitro de medio para células madre QB SF 60 para recoger las células adheridas; centrifugar el cultivo a 300 ×g durante 10 minutos.A continuación, resuspenda el botón celular en un mililitro de EM fresco que contenga cinco microgramos por mililitro de polibreno y lentivirus STEM para una MOI de uno a 10. Luego, transfiera la suspensión a un pocillo de una placa de 12 pocillos y centrifugue a 2.250 RPM durante 90 minutos a 25 grados Celsius. Añada un mililitro adicional de EM fresco que contenga cinco microgramos por mililitro de polibreno para un volumen total de dos mililitros de EM y coloque la placa en el incubador de cultivo celular el día 10.Después de recolectar las células como se mostró anteriormente, suspenda el sedimento celular en dos mililitros de medio de cultivo EM. Las células transducidas en un pocillo de una placa de 12 pocillos el día 11 recubren los pocillos de una placa de 6 pocillos con gelatina al 0,1 %, luego siembre los fibroblastos embrionarios de ratón inactivados a dos veces 10 a la quinta células por pocillo en medio meth. Prepare tres pocillos por infección.Al día siguiente, recolecte las células mononucleares transducidas como se mostró anteriormente. Después de la centrifugación, re suspenda el sedimento celular en tres mililitros de medio metH que contiene BFGF. Ácido ascórbico y factores de crecimiento.Ahora aspire el medio de la placa MES, un mililitro de las MCs por pocillo de OFMs. A continuación, agregue 1,5 mililitros de medio de metilo completo y centrifugue la placa a 500 RPM a 25 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, cultive a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante dos días a partir del día 14 en adelante.Reponga el medio cada dos días con 2,5 mililitros de medio con metionina que contenga 10 nanogramos por mililitro de BFGF y 50 microgramos por mililitro de ácido ascórbico, pero sin factores de crecimiento. Alrededor del día 20, una vez que aparezcan colonias pequeñas, alimente las células diariamente con dos mililitros de medio para células madre embrionarias humanas entre los días 30 y 40. Seleccione cada colonia y transfiérala a pozos individuales de una placa de 12 pozos previamente recubiertos con maths inactivadas, conteniendo un mililitro por pozo de medio HESC más inhibidor de ROCK; alimente las células diariamente.Posteriormente, con un mililitro de medio HESC sin el inhibidor de ROCK, las células madre pluripotentes derivadas de monocitos humanos ya están listas para la tinción de inmunofluorescencia de marcadores de pluripotencia y también para la eliminación del casete de reprogramación integrado. Durante este protocolo, las células experimentan varios cambios morfológicos desde los BMC hasta la generación de iPSC humanas. En el día cero, las células mononucleares aisladas de sangre periférica se cultivan en medio de expansión tras nueve días.Se observan racimos de uvas similares a agrupaciones de células, lo que sugiere que las células están sanas y proliferando antes de la transducción. Alrededor del día 21, semana después de que las células se siembran sobre las MA, se forman colonias. En el día 30, las colonias de IPSC muestran una morfología típica de células madre embrionarias humanas.Este análisis de inmunofluorescencia de IPC generados a partir de pbmc muestra la expresión de los marcadores de pluripotencia SSEA cuatro, trial uno 60 y trial 180 1. Las I PSC también presentan tinción positiva para fosfatasa alcalina. Estas imágenes muestran los pasos para generar IPC libres de transgenes mediante transfección con un plásmido coexpresando la recombinasa CRE y un gen de resistencia a la puromicina, como se describe en Summers et al. 2010; en comparación con los IPC antes de la transfección, se observa muerte celular.Después de dos días de selección con puromicina, aparecen nuevas colonias a partir de células resistentes alrededor de los 10 días posteriores a la transfección. Los análisis de sangre southern en colonias seleccionadas confirman la eliminación del transgén. Las líneas 1, 3, 5 y 7 muestran la presencia del transgén en los clones de IPSC antes de la eliminación. Estas bandas están ausentes en las líneas 2, 4, 6 y 8 tras la eliminación del transgén. Después de ver este video, usted debería ser capaz de generar de forma constante y robusta células IPS humanas de alta calidad, normales o específicas de enfermedades, a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica de cualquier individuo.Este enfoque simplifica el proceso de reprogramación de células somáticas para hacerlo ampliamente accesible para la comunidad de células madre. Al mismo tiempo, proporciona una base para la generación de poblaciones más homogéneas de líneas de células madre.

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Investigación

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Biology

Biología

Demostramos el protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas humanas con lentivirus mediada por la entrega de los factores humanos Oct4, Sox2, Nanog, y Lin28. Pluripotencia fue confirmada por la morfología y la presencia de células madre embrionarias (ES) de células específicas de los marcadores.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

A continuación, presentamos nuestro método establecido para reprogramar las células somáticas humanas en transgenes libre iPSCs humanas con virus Sendai, que muestra resultados consistentes y una mayor eficiencia.

Eficiente generación, por actividad humana células madre pluripotentes de células somáticas humanas con virus Sendai-

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante una estrategia basada en la reprogramación episoma y los inhibidores de la histona deacetilasa.

Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

Describimos un protocolo para derivar células madre pluripotentes inducidas humanas basadas en lentivirales, reprogramadas y caracterizadas, y convertirlas en condiciones putativas de grado clínico.

Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Este protocolo describe la inducción eficiente de endotelio hemogénico y progenitores hematopoyéticos multipotenciales a partir de células madre pluripotentes humanas a través de la expresión forzada de factores de transcripción.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

Este protocolo describe cómo generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas en condiciones libres de alimentadores utilizando una combinación de vectores de virus Matrigel y Sendai que contienen factores de reprogramación.

Generación de pluripotentes inducidas células madre a partir de células T periféricas Humanos Uso de Sendai virus en Condiciones-Feeder gratuita

Proponemos un protocolo para reprogramar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Al colocar las células sanguíneas transducidas en placas recubiertas de matriz con centrifugación, las iPSC se inducen con éxito a partir de células flotantes. Esta técnica sugiere un protocolo de reprogramación simple y efectivo para células como PBMC y CBMC.

Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Aquí, presentamos un protocolo para formar con precisión endotelio hemogénico a partir de células madre pluripotentes humanas en una condición libre de alimentador y xeno. Este método tendrá amplias aplicaciones en el modelado de enfermedades y cribado de compuestos terapéuticos.

Diferenciación de endotelio hemogénico de células madre pluripotentes humanas en una condición definida libre de alimentador y xeno

Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante un vector lentiviral único. Este protocolo simplifica la reprogramación celular para aplicaciones en medicina regenerativa.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

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