Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

El protocolo demuestra cómo generar de manera eficiente células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de cuatro mililitros de sangre periférica. En el día cero, aísle y expanda las células mononucleares de la muestra de sangre periférica. Transducir las células primarias con el covector madre de reprogramación.

En el noveno día, proceda a colocar las células transducidas en ratones inactivados, embriones, fibroblastos y cultivo durante unas tres semanas. Elija las colonias similares a HESC para su expansión y caracterización. Resultados de la tinción de inmunofluorescencia para la expresión de marcadores de pluripotencia como SS EEA cuatro, ensayo uno 60 y ensayo 180 1.

Demostrar la generación eficiente de células madre pluripotentes humanas inducidas. El uso del vector antiviral de células madre para generar células madre inducidas por humanos per potentes ofrece varias ventajas sobre otros métodos existentes. Quizás lo más atractivo es la simplicidad general del enfoque, ya que requiere un fácil acceso al tejido del donante, y con eso me refiero a los extranjeros de sangre periférica que se pueden obtener fácilmente.

Los atributos más importantes de este método son la eficiencia de la programación de repeticiones y la calidad de los clones de células IPS obtenidos. Andrea January Summer, becaria postdoctoral en mi laboratorio, y Sarah Rozelle, estudiante de posgrado en el laboratorio de George Murphy, demostrarán el procedimiento. Todo en el día cero.

Extraiga cuatro mililitros de sangre periférica en un tubo de preparación de células vacutainer con citrato de sodio. Invierta el tubo de ocho a 10 veces dentro de las dos horas posteriores a la recolección. Centrifugar la muestra a 1.800 g durante 30 minutos a temperatura ambiente para recoger las células mononucleares.

Aspire el plasma y pipetee la capa celular entre la barrera de gel y el plasma. Transfiera la capa Buffy a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mililitros y lleve el volumen total a 10 mililitros con PBS estéril. Invierta los tubos varias veces y centrifugue a 300 G durante 15 minutos.

Reus: suspende el pellet de células en 10 mililitros de PBS estéril, realiza un recuento de células y luego transfiere una o dos veces 10 a las sextas células a un tubo de centrífuga crónica estéril de 15 mililitros. Recolectar las células por centrifugación y resuspender el pellet en dos mililitros de medio de expansión. A continuación, siembre las células mononucleares aisladas en un pocillo de una placa de 12 pocillos y cultive a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Coseche las células restantes por centrifugación y congele las existencias de aproximadamente dos veces 10 a la sexta célula por vial en FBS que contenga 10% de DMSO en los días tres y seis. Transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y lave el pocillo una vez con un mililitro de medio de células madre QBSF 60. Para recoger las células adherentes.

Coseche las células por centrifugación, vuelva a suspender el pellet de la célula en dos mililitros de em. A continuación, transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa de 12 pocillos y devuelva el cultivo a la incubadora el noveno día. Transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 mililitros y lave el pocillo una vez con un mililitro de medio de células madre QB SF 60 para recoger las células adheridas, centrifugar el cultivo a 300 G durante 10 minutos.

A continuación, vuelva a suspender el pellet de célula en un mililitro de EM fresco que contenga cinco microgramos por mililitro de poli cerebro y lentivirus STEM para un MOI de uno a 10. Luego transfiera la suspensión a un pocillo de una placa de 12 pocillos y centrifugue a 2.250 RPM durante 90 minutos a 25 grados Celsius. Agregue un mililitro adicional de EM fresco que contenga cinco microgramos por mililitro de policerebro para un total de dos mililitros de em y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular el día 10.

Después de recolectar las células como se muestra anteriormente, resus suspende el pellet de la célula en dos mililitros de cultivo EM. Las células transducidas en un pocillo de una placa de 12 pocillos en el día 11 cubren los pocillos de una placa de seis pocillos con 0,1% de gelatina, luego colocan fibroblastos embrionarios de ratón inactivados en placa dos veces 10 a la quinta célula por pocillo en medio de metanfetamina. Prepare tres pocillos por infección.

Al día siguiente, recoja las células mononucleares transducidas como se muestra anteriormente. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet de la célula en tres mililitros de medio de metanfetamina que contenga BFGF. Ácido ascórbico y factores de crecimiento.

Ahora aspire el medio de la placa MES un mililitro de los MC por OFM de pocillo. Luego agregue 1.5 mililitros de medio de metanfetamina completo, centrifugar la placa a 500 RPM a 25 grados Celsius durante 30 minutos. A continuación, cultive a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos días a partir del día 14

Reponga el medio cada dos días con 2.5 mililitros de metanfetamina que contengan 10 nanogramos por mililitro de BFGF y 50 microgramos por mililitro de ácido ascórbico, pero sin factores de crecimiento. Alrededor del día 20, una vez que aparecen las pequeñas colonias, alimente las células diariamente con dos mililitros de medio de células madre embrionarias humanas entre los días 30 y 40. Elija cada colonia y transfiérala a pozos individuales de una placa de 12 pocillos precedida con matemáticas inactivadas que contengan un mililitro por medio HESC más celdas de alimentación inhibidoras de roca diariamente.

A partir de entonces, con un mililitro de medio HESC sin el inhibidor de roca, las células madre pluripotentes derivadas de monocitos humanos están listas para la tinción por inmunofluorescencia de marcadores de pluripotencia y también para la escisión del casete de reprogramación integrado. Durante este protocolo, las células experimentan varios cambios morfológicos desde las P BMC hasta la generación de I PSC humanas. En el día cero, las células mononucleares aisladas de sangre periférica se cultivan en medio de expansión después de nueve días.

Se observan racimos de uvas como grupos de células, lo que sugiere que las células están sanas y proliferan antes de la transducción. Alrededor del día 21, una semana después de que las células se siembran en MA, se forman colonias. A los 30 días, las colonias de IPSC muestran una morfología típica similar a la de las células madre embrionarias humanas.

Este análisis de inmunofluorescencia de IPCs generadas a partir de pbmc muestra la expresión de los marcadores de pluripotencia SSEA cuatro, ensayo uno 60 y ensayo 180 1. Las PSC I también tiñen positivamente para fosfatasa alcalina. Estas imágenes muestran los pasos para generar IPCs libres de transgenes por transfección con un plásmido coex que expresa CRE recombinasa, y un gen de resistencia a purmicina como se describe en el verano de 2010 en comparación con los IPCs antes de que se observe la muerte celular por transfección.

Después de dos días de selección de purmicina, emergen nuevas colonias de células resistentes alrededor de 10 días después de la transfección. Los análisis de sangre del sur en colonias seleccionadas confirman la escisión del transgénito. Los carriles 1, 3, 5 y siete muestran la presencia del transgén en los clones de IPSC antes de la escisión. Estos bams están ausentes en los carriles 2, 4, 6 y ocho después de la escisión del transgén. Después de ver este video, debería ser capaz de generar de manera consistente y robusta células IPS humanas de alta calidad, normales o específicas de la enfermedad a partir de pequeñas cantidades de sangre periférica de cualquier individuo.

Este enfoque simplifica el proceso de programación de representantes para que sea ampliamente accesible a la comunidad de células madre. Al mismo tiempo, proporciona una línea de base para la generación de poblaciones más homogéneas de líneas de células madre.