Name: Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprenda a romper la barrera hematoencefálica en ratas mediante infusión intraarterial de manitol para mejorar la entrega de fármacos al cerebro. Este método permite evaluar terapias neurovasculares dirigidas.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación JB Marshall.

1. Preparar Animal y Equipo para efectuar el procedimiento <ol><li> Antes de comenzar la cirugía, prepare el área quirúrgica y el animal. Hacer que el catéter de la carótida mediante la inserción de una aguja de punta roma de calibre 23-en un extremo de 12 &quot;de tubo de PE50. Cortar un bisel aproximadamente 45 ° en el extremo opuesto del catéter. Esterilizar el equipo antes del procedimiento. Use un capó cabello, máscara quirúrgica y guantes estériles. </li><li> Coloque una almohadilla térmica sobre la superficie donde se realizará la cirugía. Actívalo y deje que se caliente. Cubra el área con una almohadilla absorbente banco. </li><li> Compruebe que tiene 25% de manitol en solución sin cristales. Si hay cristales, que se disuelvan colocando el vial en un baño de agua caliente a 80 ° C y agitando periódicamente. </li><li> Registrar la masa del animal. </li><li> Hacer una dilución de propofol para la entrega a 0,8 mg / kg / min a una velocidad de 0,1 ml / min. </li><li> Coloque la rata en la caja de la inducción durante 3 min. Configuración: 5% de isoflurano, 2 L / minCaudal ventilador. </li><li> En la parte superior de una toalla desechable, afeitarse el cuello y los muslos internos. </li></ol> 2. Intube la Rata <ol><li> Volver a colocar el animal en el cuadro de la inducción durante 3 min. </li><li> Prepare el tubo endotraqueal con un catéter intravenoso. Para este tamaño y raza de ratas, se utiliza un catéter de calibre 18. El tubo debe ser suficientemente grande para permitir la circulación de aire adecuada, pero lo suficientemente pequeño para encajar en la tráquea sin causar daños. Tire de la aguja fuera del catéter plástico con cuidado y romper la aguja aprox. 1 cm de su punta afilada. La aguja tocada será su lápiz. Vuelve a colocar la aguja en el catéter. </li><li> Colgar la rata por los dientes en una superficie inclinada. </li><li> Enciende una luz directamente sobre el cuello del animal y alineados entre sus orejas. </li><li> Inserte una pequeña espátula aprox. 3 cm en la orofaringe. Levante hacia arriba mientras tira suavemente la lengua fuera de la boca. </li><li> Visualizar la apertura de la tráquea. Lo harás síea agujero pequeño abierto y cercano con cada respiración. </li><li> Inserte suavemente catéter en el orificio. A veces se puede sentir el plástico entrar en el cartílago de la tráquea. La tráquea es sensible. No fuerce el catéter. </li><li> Ajuste el ventilador a 1 L / min y 60 lpm y el isoflurano al 2%. </li><li> Conectar el catéter al ventilador y el tubo de cinta a la superficie de operación. </li><li> Verificar que el animal es anestesiado mediante la realización de un sujetador del pie. </li></ol> 3. Establecer anestesia Propofol IV <ol><li> Asegure la rata con cinta adhesiva las cuatro extremidades y la cola a la superficie de operación. </li><li> Frote el cuello afeitado y sitios de la ingle con clorhexidina jabón tres veces. Luego frote con clorhexidina enjuague tres veces. </li><li> Conecte una jeringa de propofol a un conjunto de extensión IV. Monte la jeringa en una bomba de infusión. </li><li> Con un escalpelo, cortar a través de la piel del muslo rasurada. Evite cortar el músculo. </li><li> Abra la incisión con fuerzaps para visualizar la vena femoral. </li><li> Tire el tejido sobre la arteria para exponer el recipiente. </li><li> Inserte un 26 ga Monoject veterinario catéter IV en la vena. Cuando la aguja perfora la pared de la vena se siente que son más fáciles de empujar. Retraer la aguja y empuje el catéter en el vaso. </li><li> Iniciar la infusión de propofol a 0,1 ml / min. </li><li> 3-5 min después de comenzar la infusión de propofol, cambiar el gas de la anestesia a una mezcla de 50% O 2 y 50% N O 2 y apagar el isoflurano. </li></ol> 4. Exponer la bifurcación de la arteria carótida común <ol><li> Hacer una incisión en la línea media del cuello con hoja de bisturí. </li><li> Cortar entre las dos grandes glándulas salivales con tijeras o bisturí. </li><li> Diseccionar tejido lateral a la línea media para exponer la arteria carótida. Utilice unas pinzas para abrir capas de tejido. Usted puede utilizar tijeras para retirar las piezas que lo expongan con las pinzas y determinar que minimally vascular. Controlar el sangrado con una gasa, hisopos de algodón, y cauterización si es necesario. </li><li> Inyectar 3 ml de solución salina IP si ha habido sangrado moderado a fuerte. </li><li> Utilice separadores para extraer el tejido fuera de la carótida. Encuentra la bifurcación. </li><li> Exponer la arteria occipital, justo distal a la bifurcación. Cauterize que entre pinzas y separarlo con un electrocauterio. </li><li> Use pinzas para exponer completamente la bifurcación de la carótida y como mucho de la ECA como sea posible. </li><li> Exponer la arteria tiroidea superior se desvía la ECA distal a la arteria occipital. Cauterize que entre pinzas y separarlo con un electrocauterio. </li></ol> 5. Cateterización de la arteria carótida externa <ol><li> Coloque dos trozos de 4/0 seda bajo el ACA. </li><li> Coge un trozo de sutura con su pinza hemostática y retraer la ECA atrás caudalmente (hacia los pies de la rata). </li><li> Tomar la otra sutura y atar en la medida de cranealmente (hacia la boca de la rata) como sea posible won un nudo de cirujano. Esto forma una ligadura permanente a sacrificar la ECA. </li><li> Retire la pinza hemostática primero (el que se aplica la tensión caudal) y coge la otra sutura (la que se anuda alrededor de la ECA) y aplique una ligera tensión craneal con la pinza hemostática. </li><li> Atar nudo otro cirujano suelta (no aseguran - dejar apenas atado) distal a la bifurcación y proximal a la ligadura permanente. </li><li> Irrigar con lidocaína al 1% para relajar la arteria. </li><li> Llenar el catéter con solución salina heparinizada. </li><li> Colocar una grapa de vaso temporal lo más cerca posible a la bifurcación. Place grapa de vaso en un ángulo para maximizar el espacio para la cateterización. Deslice el nudo flojo hacia el clip. </li><li> Hacer una arteriotomía pequeña (corte) en la CEPA justo proximal a la ligadura usando micro tijeras. No debe haber sangrado y si el clip de ligadura son seguras. </li><li> Utilizando pinzas para controlar las paredes de ECA, alimentar el extremo biselado del catéter en el vaso. </li&gt; <li> Fijar el catéter con el nudo de sutura sueltos. Ate la arteria alrededor del catéter. </li><li> Retire el clip y limpiar la zona con un bastoncillo de algodón. </li><li> Avanzar el catéter a aproximadamente 1 mm distal a la bifurcación. Mantener la arteria con fórceps proximales al nudo para asegurar el recipiente se inmoviliza. </li></ol> 6. Administre Manitol <ol><li> Llenar un 8 &quot;juego de extensión IV y una jeringa de 6 ml con manitol sin crear burbujas de aire en la tienda de esta incubadora a 37 ° C. Nota: el trabajo rápidamente con el manitol -, será fácil de precipitar de la solución a temperatura ambiente.. </li><li> Para visualizar BBBD, puede administrar colorante azul de Evans y verlo entrar en las áreas del cerebro donde se ha interrumpido la barrera. Para ello, dar al animal 2 ml / kg de Evans 2% Blue a través de un nuevo sitio IV en la pierna contralateral a la infusión de propofol. </li><li> Conecte el juego de extensión a un filtro de 5 micras y llenarlo con manitol para eliminar el aire bubbles. A continuación, conecte esta a la llave de paso sin crear burbujas. </li><li> Administrar manitol a 0,09 ml / seg para 25 seg. Reloj para el manitol para alcanzar el equilibrio con el flujo en la carótida común en un punto justo proximal a la ICA. Se debería aparecer a pulso con una frecuencia cardiaca de la rata. Si el manitol simplemente fluye hacia el corazón que hayas superado la presión arterial de la rata. Esto puede causar complicaciones potencialmente mortales y BBBD pobres. </li></ol>

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<li>Fortin, D., McCormick, C. I., Remsen, L. G., Nixon, R., Neuwelt, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+neurotoxicity+of+etoposide+phosphate+administered+in+combination+with+other+chemotherapeutic+agents+after+blood-brain+barrier+modification+to+enhance+delivery%2C+using+propofol+for+general+anesthesia%2C+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Unexpected neurotoxicity of etoposide phosphate administered in combination with other chemotherapeutic agents after blood-brain barrier modification to enhance delivery, using propofol for general anesthesia, in a rat model.</a> Neurosurgery. 47, 199(2000).</li>
<li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+CNS+lymphoma+treated+with+osmotic+blood-brain+barrier+disruption%3A+prolonged+survival+and+preservation+of+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Primary CNS lymphoma treated with osmotic blood-brain barrier disruption: prolonged survival and preservation of cognitive function.</a> Journal of clinical oncology. 9, 1580(1991).</li>
<li>Remsen, L. G., Trail, P. A., Hellström, I., Hellström, K. E., Neuwelt, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+delivery+improves+the+efficacy+of+a+tumor-specific+doxorubicin+immunoconjugate+in+a+human+brain+tumor+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Enhanced delivery improves the efficacy of a tumor-specific doxorubicin immunoconjugate in a human brain tumor xenograft model.</a> Neurosurgery. 46, 704(2000).</li>
<li>Neuwelt, E. A., Pagel, M. A., Kraemer, D. F., Peterson, D. R., Muldoon, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+chemoprotection+without+compromise+of+chemotherapy+efficacy+in+a+rat+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bone marrow chemoprotection without compromise of chemotherapy efficacy in a rat brain tumor model.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 309, 594-599 (2004).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hay unos pocos medios para aumentar al máximo la eficacia de BBBD. Es importante minimizar el sangrado durante la fase de corte hacia abajo. La presión arterial y el ritmo cardíaco puede ser afectada por hemorragia significativa y estos factores se sabe que afectan el grado de BBBD 13. El sangrado puede ser reducido mediante el uso de suturas para ligar vasos importantes, tales como la tiroidea superior y las arterias occipital, que deben ser divididas. Además, la electrocauterización puede ser utilizado para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Larga rata Evans </td><td> Harlan Laboratories </td><td></td><td> 210-250 g, varón </td></tr><tr><td> PE 50 Tuberías </td><td> Beckton-Dickinson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Calibre 18 x 2,5 &quot;catéter IV </td><td> Terumo </td><td></td><td> Para tubo ET </td></tr><tr><td> 30 &quot;extensión IV se </td><td> Abbott </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 26 calibre veterinaria catéter IV </td><td> Monoject </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Colorante azul de Evans </td><td> Sigma </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> Bipolar </td><td> Codman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Filtro, 5 m </td><td> Braun </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida therapeutics neurovascular

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Células endoteliales con uniones estrechas a lo largo de la membrana basal y los pies de astrocitos finales rodean los vasos sanguíneos cerebrales para formar la barrera sangre-cerebro 1. La barrera selectivamente excluye moléculas de cruce entre la sangre y el cerebro en base a su tamaño y carga. Esta función puede impedir el suministro de agentes terapéuticos para trastornos neurológicos. Una serie de fármacos quimioterapéuticos, por ejemplo, no será efectiva cruzar la barrera sangre-cerebro para alcanzar las células tumorales 2. Por lo tanto, mejorar el suministro de fármacos a través de la barrera sangre-cerebro es un área de interés. Los métodos más frecuentes para intensificar el suministro de fármacos al cerebro son la infusión directa cerebral y la barrera hematoencefálica interrupción 3. Directos garantías infusión intracerebral que las terapias de alcanzar el cerebro, sin embargo, este método tiene una capacidad limitada para dispersar el fármaco 4. Barrera hematoencefálica interrupción (BBBD) allos puntos bajos de medicamentos para fluir directamente desde el sistema circulatorio en el cerebro y así llegar más eficazmente células tumorales dispersas. Tres métodos de alteración de la barrera incluyen alteración de la barrera osmótica, alteración de la barrera farmacológico, y el ultrasonido focalizado con microburbujas. Rotura osmótica, iniciada por Neuwelt, utiliza una solución hipertónica de 25% de manitol que deshidrata las células de la barrera sangre-cerebro, causando que se encojan y alterar sus uniones estrechas. Alteración de la barrera también se puede lograr con compuestos farmacológicamente vasoactivas tales como histamina y bradiquinina 5 6. Este método, sin embargo, es selectiva principalmente para la barrera cerebro-tumor 7. Además, RMP-7, un análogo del péptido bradiquinina, se encontró que era inferior en comparación cabeza a cabeza con BBBD osmótico con 25% de manitol 8. Otro método, ultrasonido focalizado (FUS), en relación con microburbujas agentes de contraste de ultrasonidos, también se ha demostradopara abrir reversiblemente la barrera sangre-cerebro 9. En comparación con FUS, sin embargo, 25% de manitol tiene una larga historia de seguridad en pacientes humanos que hace que sea una herramienta probada para la investigación traslacional 10-12. Con el fin de lograr BBBD, manitol deben ser entregados a una tasa alta directamente en la circulación arterial del cerebro. En los seres humanos, un catéter endovascular es guiado hasta el cerebro donde se puede flujo rápido, directo logrado. Este protocolo modelos BBBD humana tan estrechamente como sea posible. Después de un corte hacia abajo a la bifurcación de la arteria carótida común, se inserta un catéter retrógrado en el TCE y utilizados para entregar el manitol directamente en la arteria carótida interna (ICA) la circulación. Propofol y N 2 O anestesia se utilizan por su capacidad de maximizar la eficacia de la ruptura de la barrera 13. Si se ejecuta correctamente, este procedimiento tiene la capacidad de forma segura, eficaz y reversible abrir la barrera sangre-cerebro y mejorare la administración de fármacos que normalmente no llegan al cerebro 8,13,14.

<img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50019/50019fig1.jpg" /> Figura 1. Visualización de sangre-cerebro alteración de la barrera a través de la extravasación de azul de Evans colorante. Colorante azul de Evans es un pigmento que se une a la albúmina y no es extravasada en el cerebro en condiciones fisiológicas. La interrupción de la barrera sangre-cerebro en un lado del cerebro permite azul de Evans para entrar y mancha el azul hemisferio interrumpido mien...

Hematoencefálica interrupción de la barrera ayuda a la entrega de ciertos medicamentos para el cerebro. Manitol entregado intraarterial células se contrae los vasos sanguíneos circundantes con el fin de perturbar físicamente la barrera.

Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

El objetivo general de este procedimiento es alterar la barrera hematoencefálica. Esto se logra colocando primero al animal en anestesia intravenosa con una vía aérea endotraqueal. A continuación, se expone la bifurcación de la arteria carótida común.Luego, se inserta un catéter en la arteria carótida externa. Por último, se administra manitol. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la ruptura de la barrera hematoencefálica a través de la extravasación del tinte azul de Evan.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes de terapia intraarterial es que permite que entren en el cerebro fármacos que normalmente no atraviesan la barrera hematoencefálica en condiciones fisiológicas. Esto tiene implicaciones en el campo de la neurociencia porque nos permite probar nuevas terapias que tienen poca capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la neurooncología, ya que muchos agentes quimioterapéuticos no atraviesan la barrera hematoencefálica.Bueno, aunque este método nos proporciona información sobre la nueva oncología, también puede proporcionarnos información sobre otros trastornos neurológ

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Microburbujas mediada por la interrupción ultrasonido focalizado de la barrera hemato-encefálica (BHE) es una técnica prometedora para no invasiva la entrega de fármacos en el...

Resonancia magnética guiada por disrupción de la barrera sangre-cerebro con ultrasonido transcraneal Enfocado en un modelo de rata

En este video, describimos un protocolo integral para establecer un modelo in vitro que imita la barrera hematoencefálica. El modelo es prometedor para comprender la administración de agentes terapéuticos para el tratamiento de tumores cerebrales.

Barrera hematoencefálica o modelo BBTB: una adaptación del modelo de barrera hematoencefálica o BBB para evaluar la administración de tratamientos al tumor

Establecimiento de modelos humanos de la barrera sangre-cerebro (BBB) ​​puede beneficiar a la investigación de las condiciones del cerebro asociadas con la acreditación fracaso. Se describe aquí una técnica mejorada para la preparación de un modelo de acreditación de contacto, que permite que el cocultivo de astrocitos humanos y las células endoteliales del cerebro en los lados opuestos de una membrana porosa.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una técnica muy reproducible para evaluación en vivo de la interrupción de la barrera blood - brain en modelos de rata de accidente cerebrovascular isquémico.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Aquí presentamos un protocolo que describe la configuración de un cellulo en BBB (barrera hematoencefálica)-cultura de membrana porosa poliester Minibrain insertar sistema para evaluar el transporte de biomoléculas o agentes infecciosos a través de una BBB humana y sus impacto fisiológico en las células cerebrales vecinas.

Un modelo de interfaz de sangre-cerebro humano estudiar cruces de barrera por patógenos o medicamentos y sus interacciones con el cerebro

Medicamentos dirigidos a tumores del sistema nervioso central es un gran desafío. Aquí se describe un protocolo para producir a un imitador in vitro de la tumor-barrera blood-brain con células murinas y humanas y discutir su pertinencia para la previsibilidad del sistema nervioso central tumor targeting in vivo.

Prediciendo en Vivo cargas entrega usando una Barrera Blood-brain Tumor en un plato

La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

Este protocolo describe un método para establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica humana (BHE). Las células endoteliales y los pericitos se siembran a cada lado de un filtro de inserción (compartimento sanguíneo), y los astrocitos se siembran en el pozo inferior (compartimento cerebral). El modelo caracterizado se utilizó para experimentos de transporte de nanopartículas.

Un sistema celular de triple cultivo que modela la barrera hematoencefálica humana

La barrera hematoencefálica (BHE) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de un entorno cerebral estable y saludable. La disfunción de la barrera hematoencefálica se asocia con muchas enfermedades neurológicas. Hemos desarrollado un modelo 3D derivado de células madre de la BHE para investigar la patología cerebrovascular, la integridad de la BHE y cómo la BHE se ve alterada por la genética y la enfermedad.

Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

Aprenda a romper la barrera hematoencefálica en ratas mediante infusión intraarterial de manitol para mejorar la entrega de fármacos al cerebro. Este método permite evaluar terapias neurovasculares dirigidas.

Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular

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