Name: El uso de matrices inversas de proteínas de fase (RPPA) para explorar la variación de expresión de proteínas individuales dentro de cánceres de células renales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprende a utilizar matrices inversas de proteínas de fase (RPPA) para analizar la variación de expresión proteica en cáncer renal. Este método permite identificar biomarcadores de respuesta al tratamiento y comprender la heterogeneidad tumoral.

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El trabajo de los autores FCO, DF, JN, DJH y GDS se ha mencionado anteriormente es financiado por la Oficina de Director Científico, el número de concesión: ETM37 y apoyado por el Centro de Cáncer Research UK Medicina Experimental del Cáncer. La obra de AL es financiado por el Colegio Real de Cirujanos de Edimburgo Robertson Trust, el Fideicomiso de Melville para el cuidado y la cura del cáncer y el Consejo de Investigación Médica. IO es apoyado por una beca de la Royal Society de Edimburgo Gobierno escocés cofinanciado por las acciones Marie Curie y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido. Los autores desean agradecer a SCOTRRCC cosolicitantes y colaboradores por sus útiles debates sobre algunos de los temas tratados en este documento.

1. La identificación de la heterogeneidad morfológica y molecular del tumor <ol><li> Tumores extraídos de -80 ° C congelador y se mantuvo en hielo seco. </li><li> Dividir los tumores en secciones de aproximadamente 1 cm 3. Mapear la posición original de cada sección del tumor respecto a la otra y la etiqueta con un nombre único. Almacenar las muestras en crioviales individuales a -80 º C hasta que esté listo para su uso. </li><li> Muestras de abrigo en octubre y cortadas en un criostato a -22 ° C. </li><li> Las muestras se tiñeron con hematoxilina y eosina método counterstaining. </li><li> El análisis microscópico de cortes congelados para asegurar que son de naturaleza ccRCC, tumor viable y para la clasificación (de bajo grado y de alto grado o mixto baja / alta calidad, difícil de diferenciar los grados Fuhrman 1 a 4 de la sección congelada). Figura 1 A y B (H &amp; E tinción de alta calidad y bajo mixta). </li><li> Seleccione hasta 4 muestras de cada región morfológicamente diferentes dentro de cada tumor para la extracción de proteínas. </li></ol> 2. La extracción de proteínas de muestras de tumores <ol><li> Cortar muestra de tumor de octubre </li><li> Place 50-75 mg de tejido en tubos de 2 ml con 990 l de tampón de lisis [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA (pH 8,5), NaCl 150 mM] suplementado con aprotinina (Sigma A6279) (10 mg / ml), cóctel inhibidor de fosfatasa 2 (Sigma, P5716), cóctel inhibidor de fosfatasa 3 (Sigma, P0044) y un cóctel inhibidor de proteasa (Roche, 11836153001). </li><li> Añadir una sola bola de acero de 5 mm a cada tubo y homogeneizar a 50 Hz durante 5 minutos dos veces utilizando un TissueLyser, comprobando el nivel de homogeneización después de cada período de 5 minutos. </li><li> Verter la muestra homogeneizada a nuevo tubo de 2 ml con pipeta dejando detrás de la bola de acero. </li><li> Añadir 10 l de Triton X-100 a cada muestra antes de la centrifugación a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Transferir los sobrenadantes a tubos de microcentrífuga frescos. </li><li> Determinar la concentración de proteína usando BCA ensayo (Figura 2). </li><li>Normalizar las concentraciones de proteína a 1 mg / ml. </li></ol> 3. Validación de anticuerpos <ol><li> Preparar muestras de proteínas (extraído de las líneas celulares adecuadas o tejido) para transferencia Western y se ejecutan en un 10% SDS-PAGE gel. </li><li> Transferir las muestras a una membrana de nitrocelulosa durante la noche a 4 ° C. </li><li> Bloquear la membrana en tampón de Odyssey Li-Cor bloqueo (50:50 diluyó en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Diluir los anticuerpos primarios en Buffer Odyssey Li-Cor 50:50 Bloqueo (diluido en PBS) a los fabricantes recomienda dilución normalmente de 1 en 1.000. </li><li> Incubar la membrana en los anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. </li><li> Hacer un 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T, 1 ml de Tween 20 / 1L PBS). </li><li> Lavar la membrana en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3). </li><li> Diluir fluorescente marcada con anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo Odyssey (diluido en PBS 50:50) 0,01% SDS a 1:10,000 dilución (1,5 μl/15 ml). </li><li> Incube la membrana en secundariaanticuerpos a temperatura ambiente durante 45 min con agitación suave - es importante para proteger la membrana de la luz hasta el momento en que finalmente se ha escaneado. </li><li> Lavar la membrana en PBS-T a temperatura ambiente durante 5 min (x3), manteniendo la membrana en la oscuridad. </li><li> Lavar la membrana en PBS a temperatura ambiente durante 5 min (x3) para eliminar Tween20 residual, manteniendo de nuevo la membrana en la oscuridad. </li><li> Lie membrana plana sobre un trozo de papel de filtro en la oscuridad y dejar secar al aire - permitiendo que la membrana se seque puede mejorar la señal y reducir el fondo, pero hacen inútil para pelar y re-sondeo. </li><li> Escanear la membrana en el escáner Odyssey LiCor. Mantener la membrana en la oscuridad hasta el momento en que se ha escaneado. </li><li> Sólo seleccionar anticuerpos que generan una sola banda predominante en el peso molecular correcto. Figura 3 muestra ejemplos de anticuerpos aceptables e inaceptables para su uso con RPPA. </li></ol> 4. RPPA Printing <ol><li> Proteína lisados ​​fueron avistados en portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa (Whatman Fastslides-) utilizando un MicroGrid II robot ayudante. Las diapositivas utilizadas contenían 2 almohadillas en el que las muestras fueron vistos. Cada almohadilla fue vista con muestras idénticas, en este caso 100 muestras. Otros formatos disponibles son 1, 8 y 16 diapositivas de pad. Cuanto mayor sea el número de almohadillas más pequeño es el número de muestras que se pueden observar en cada uno. </li><li> Una serie de cinco diluciones de 2 veces se hicieron de cada muestra y cada uno fue visto entonces por triplicado (que resulta en un total de 15 puntos por muestra). </li></ol> 5. RPPA de detección de proteínas <ol><li> Portaobjetos húmedos en Buffer LiCor exceso de bloqueo (50:50 diluyó en PBS). Incubar a temperatura ambiente durante 1 h en una plataforma oscilante. </li><li> Preparar 800 l de anticuerpos primarios en tampón de bloqueo LiCor (50:50 diluyó en PBS) a las concentraciones deseadas y mantener en hielo. </li><li> Montar las diapositivas, ya sea (i) el clip único chip marcoo (ii) cuatro el &#39;FastFrame&#39; soporte de diapositivas bahía de modo que un sello hermético se forma entre la corredera y la cámara de incubación. </li><li> Retire tampón residual de los pozos y añadir 600 l anticuerpo primario a los pozos respectivos. </li><li> Colocar el portaobjetos y la cámara en una caja sellada húmeda e incubar en la plataforma oscilante durante la noche a 4 ° C. </li><li> Completar hasta 0,1% PBS-Tween 20 (PBS-T; 100 l de Tween 20/100 ml de PBS). </li><li> Retire los portaobjetos de la cámara frigorífica y retire con cuidado los anticuerpos primarios de cada pocillo. </li><li> Añadir 600 l de PBS-T y lavar los portaobjetos en la plataforma oscilante a temperatura ambiente durante 5 min (X3). </li><li> Preparar fluorescente marcada con anticuerpos secundarios mediante la dilución en tampón de bloqueo Odyssey (50:50 diluyó en PBS) 0,01% de SDS a 1:2,000 dilución (1 l / 2 ml) en la primera instancia. </li><li> Retire tampón de los pocillos y añadir 600 l fluorescente marcada con anticuerpos secundarios a los pozos respectivos. Incubar anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 45 min con agitación suave - loEs importante para proteger la membrana de la luz hasta el momento en que finalmente se ha escaneado. </li><li> Eliminar los anticuerpos secundarios de lavado bien y brevemente (x3) en 600 l de PBS-T a temperatura ambiente. Extraer el portaobjetos de la portadora, transferir a un recipiente adecuado y lavar en exceso de PBS-T durante 15 minutos, manteniendo la membrana en la oscuridad. </li><li> Retirar PBS-T y la membrana lavado adicional con PBS a temperatura ambiente durante 15 min para retirar los residuos de Tween-20, manteniendo de nuevo la membrana en la oscuridad. </li><li> Secar la Fastslide en 50 ° C horno durante 10 min y luego escanear en el escáner Odyssey Li-Cor. Mantenga la diapositiva en la oscuridad hasta que se hayan escaneado. </li><li> Escanear el portaobjetos a 680 nm y / o 800, dependiendo del anticuerpo secundario / anticuerpos utilizados. Para la detección de dos colores siempre uso altamente transversal adsorbidos anticuerpos secundarios para minimizar la reactividad cruzada. La cuidadosa selección de anticuerpos primarios y secundarios es necesario para la detección de dos colores. De importancia primaria es la selección de losespecies diferentes de acogida (por ejemplo, conejo y ratón) para los dos anticuerpos primarios. Esto permite la discriminación por anticuerpos secundarios anti-conejo y anti-ratón que están marcados con colorante con espectros de emisión fácilmente distinguibles. </li><li> Los archivos de imágenes se guardan como archivos. Tiff. Figura 4 (imagen de los archivos escaneados). </li></ol> 6. Análisis de Datos <ol><li> Activar el software MicroVigene (VigeneTech, Carlisle, MA, EE.UU.). </li><li> Abra. Archivo tiff imagen que contiene el análisis de la diapositiva RPPA. </li><li> Seleccionar un archivo de plantilla predefinida que tendrá una rejilla para superponer sobre la imagen de la diapositiva RPPA. </li><li> Haga clic en la Definición de zonas de interés (ROI) botón para que aparezca la cuadrícula. </li><li> Coloque la rejilla sobre los puntos RPPA. Figura 6a (imagen de la cuadrícula sobre la imagen). </li><li> Haga clic en el botón Seleccionar todo para seleccionar todo el ROI. </li><li> Haga clic en Buscar todos. MicroVigene se Automticamente encontrar el ROI, encontrar los puntos, se resta el fondo, limpie el polvo y cuantificar las manchas. </li><li> Haga clic en el botón Ver Curve dilución para mostrar los resultados de todas las muestras de la diapositiva RPPA. </li><li> Haga clic en Guardar Datos de dilución. </li><li> Como cada muestra se imprime a través de 5 puntos cada dilución por triplicado hay 15 puntos a analizar, lo que reduce el riesgo de errores y mejora la calidad de ajuste de la curva. MicroVigene produce un 4-parámetro logistic-log modelo &quot;Supercurve&quot; algoritmo (Figura 6b), que incorpora todos los puntos para producir una curva sigmoidea de la cinética de anticuerpos de unión a antígeno. El supuesto es que los mismos anticuerpo-antígeno cinética de unión se lleva a cabo en cada punto de la muestra, incluso en las diferentes muestras, por lo tanto, tomando todos los puntos en una matriz para ajustar una curva de respuesta común puede aumentar la confianza del ajuste de la curva 10,11 Y = a + ((ba) / (1 + e (c * d-ln (x))) donde x es la dilutiofactor n e Y es la intensidad de la señal. Las muestras pueden ser analizadas comparativamente con el valor y0, que en nuestro análisis corresponde al valor de y en el punto medio de los valores de x después de la asignación de aquellos en el supercurve. </li><li> Exportar los datos en Microsoft Excel y la trama y0 como en la figura 7. </li><li> Varianza proteína intratumoral se calculó por separado para los pacientes tratados no tratados y tratados en un marco de ANOVA. Distribuciones de varianza combinando los datos de todas las proteínas analizadas se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney (MWT). Variaciones intratumorales de proteínas individuales se compararon mediante una prueba F donde las hipótesis de normalidad y homocedasticidad celebradas respectivamente evaluó mediante la Lillefours y pruebas Fligner, tasa de falso descubrimiento (FDR) corrección se aplicó 12. La expresión diferencial de proteínas entre muestras de los pacientes tratados y no tratados fue probado para cada proteína usando la t de Student prueba donde la normalidad y la homoscedasticidad suposicións se cumplieron, por lo demás MWT se realizó, FDR fue aplicado sobre valores combinados t-test y MWT 12. Importancia de la expresión de la proteína y la correlación de Pearson varianza para las proteínas se estimaron utilizando un enfoque estándar [R de referencia] y FDR aplicado 12. </li></ol>

<ol><li>Stewart, G. D., O'Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+molecular+pathology+contribute+to+the+management+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma.</a> Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).</li>
<li>Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+biomarker+analysis+of+sunitinib+in+patients+with+bevacizumab-refractory+metastatic+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma.</a> J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).</li>
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<li>Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+in+chronic+myeloid+leukemia+after+sequential+treatment+with+multiple+tyrosine+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors.</a> Blood. 110, 4005-4011 (2007).</li>
<li>Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).</li>
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<li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li>
<li>O'Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+automated+quantitative+analysis+to+evaluate+epithelial-to-mesenchymal+transition+associated+proteins+in+clear+cell+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma.</a> PLoS One. 7, e31557(2012).</li>
<li>Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-phase+protein+lysate+microarrays+for+cell+signaling+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis.</a> Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).</li>
<li>Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+quantification+of+protein+lysate+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Non-parametric quantification of protein lysate arrays.</a> Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).</li>
<li>Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+protein+arrays+for+quantitative+systems+analysis+of+the+dynamics+of+signaling+pathway+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions.</a> Proteome Sci. 9, 53(2011).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+False+Discovery+Rate%3A+A+Practical+and+Powerful+Approach+to+Multiple+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método que aquí se presenta RPPA representa una alternativa de alto rendimiento para la técnica de transferencia rendimiento ampliamente utilizado, pero relativamente baja occidental de análisis de proteínas. El método permite a cientos de muestras a ser semi-cuantitativamente analizados y comparados simultáneamente permitiendo la comparación directa de las proteínas clave a través de una amplia selección de líneas celulares y muestras de tejidos. Multiplexación con especies diferentes de anticuerpo aumenta aún más l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> aprotinina </td><td> Sigma </td><td> A6279 </td></tr><tr><td> cóctel de inhibidores de fosfatasa 2 </td><td> Sigma </td><td> P5726 </td></tr><tr><td> cóctel de inhibidores de fosfatasa 3 </td><td> Sigma </td><td> P0044 </td></tr><tr><td> cóctel inhibidor de la proteasa </td><td> Roche </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Triton-X </td><td> T8787 </td></tr><tr><td> Li-Cor Odyssey tampón de bloqueo </td><td> Li-Cor </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> TissueLyser </td><td> Qiagen </td><td> 85600 </td></tr><tr><td> MicroGrid II robot vigilante </td><td> Biorrobótica </td><td></td></tr><tr><td> Cuatro FastFrame &#39;bay soporte de diapositivas </td><td> Whatman </td><td> 10486001 </td></tr><tr><td> RÁPIDO Slide - 2-Pad </td><td> Whatman </td><td> 10485317 </td></tr><tr><td> IRDye 680LT cabra anti-ratón IgG </td><td> Licor </td><td> 926-68020 </td></tr><tr><td> IRDye 800CW cabra anti-conejo IgG </td><td> Licor </td><td> 926-32211 </td></tr></tbody></table>

el uso de matrices inversas de proteínas de fase (rppa) para explorar la variación de expresión de proteínas individuales dentro de cánceres de células renales

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Actualmente no existe ningún tratamiento curativo para el cáncer metastásico de células renales de células claras, el más común de variante de la enfermedad. Un factor clave en esta resistencia al tratamiento se cree que es la complejidad molecular de la enfermedad de 1. La terapia dirigida, tales como el inhibidor de la tirosina cinasa (ITC)-sunitinib han sido utilizados, pero sólo el 40% de los pacientes responderán, con la gran mayoría de estos pacientes que recaen dentro de 1 año 2. Por ello, la cuestión de la resistencia intrínseca y adquirida en pacientes renales de células cancerosas es muy relevante 3. Con el fin de estudiar la resistencia a TKIs, con el objetivo final de desarrollar tratamientos eficaces y personalizados, tejido secuencial después de un período específico de terapia dirigida se requiere, un enfoque que ha resultado exitoso en leucemia mieloide crónica 4. Sin embargo, la aplicación de esta estrategia en el carcinoma de células renales se complica por el alto nivel de bOTH inter e intratumoral heterogeneidad, que es una característica de carcinoma de células renales 5,6, así como otros tumores sólidos 7. Heterogeneidad Intertumoral debido a las diferencias transcriptomic y genética está bien establecida incluso en pacientes con presentación similar, estadio y grado del tumor. Además es evidente que existe un gran morfológica (intratumoral) heterogeneidad en RCC, que es probable que represente heterogeneidad molecular aún mayor. Mapa detallado y clasificación de los tumores RCC por análisis morfológico combinada y la clasificación de Fuhrman permite la selección de áreas representativas para el análisis proteómico. El análisis de proteínas basado en 8 de CCR es atractivo debido a su amplia disponibilidad en los laboratorios de patología, sin embargo, su aplicación puede ser problemática debido a la limitada disponibilidad de anticuerpos específicos 9. Debido a la naturaleza de dot blot de las matrices de la proteína de fase inversa (RPPA), la especificidad del anticuerpo debe be pre-validado; como tal control de calidad estricto de los anticuerpos utilizados es de suma importancia. A pesar de esta limitación, el formato de dot blot sí permite la miniaturización de ensayo, lo que permite la impresión de cientos de muestras en un portaobjetos de nitrocelulosa sola. Diapositivas impresas se pueden analizar de una forma similar a análisis de Western con el uso de anticuerpos primarios específicos y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, lo que permite la multiplexación. La expresión diferencial de proteínas en todas las muestras en un portaobjetos se pueden analizar simultáneamente al comparar el nivel relativo de fluorescencia de una manera más rentable y de alto rendimiento.

Un ejemplo de una diapositiva escaneada RPPA se puede ver en la Figura 4 (i) con dos canales 680 y 800 nm mostradas. La separación de las imágenes por longitud de onda, la Figura 4 (ii) permite a cada almohadilla en la diapositiva RPPA a analizar y expresión de la proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como se puede ver en la Figura 4 (iii) la expresión de las proteínas individuales en las muestras es único con gelsolina tiene un alto nivel de ...

RPPA permite la expresión de la proteína de cientos de muestras, impresos en portaobjetos de nitrocelulosa para ser interrogado simultáneamente, usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Esta técnica se ha aplicado para estudiar el efecto de la heterogeneidad de tratamiento de drogas dentro de células claras carcinoma renal.

El uso de matrices inversas de proteínas de fase (RPPA) para explorar la variación de expresión de proteínas individuales dentro de cánceres de células renales

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

El objetivo de este procedimiento es estudiar la variación de la expresión proteómica en el cáncer de células renales mediante matrices de proteínas de fase reversa o RPPA. Esto se logra primero mapeando y seleccionando áreas heterogéneas de tumores individuales. El segundo paso es extraer las proteínas de las muestras.A continuación, las proteínas se normalizan y se imprimen en portaobjetos de RPPA. El paso final es analizar los portaobjetos utilizando anticuerpos contra las proteínas de interés. En última instancia, la RPPA se utiliza para mostrar la variación diferencial de la expresión proteómica en dos grupos de tratamiento del cáncer de células renales.Este método puede ayudar a responder algunas de las preguntas clave en el campo del cáncer de células renales. Porque existe una gran heterogeneidad de proteínas. Las implicaciones de esta técnica son que puede tener un impacto positivo en el tratamiento de los pacientes con cáncer de células renales que son tratados con terapias dirigidas.Esto se debe a que podemos investigar la heterogeneidad antes y después del tratamiento en muestras de tejido y, por lo tanto, esperamos identificar nuevos objetivos farmacológicos para los pacientes que desarrollan resistencia adquirida a estos tratamientos. La demostración del criostato y el procedimiento de rodilla H estará a cargo de la directora del laboratorio de investigación, Helen Caldwell, y la demostración de la técnica de extracción de proteínas estará a cargo de la técnica de investigación de nuestro grupo, Jo Nanda. La demostración de la impresión de OR PPA estará a cargo de nuestro colega de St. Andrews, Peter Mullen.Para comenzar este procedimiento, retire los tumores del congelador a menos 80 grados centígrados y manténgalos en hielo seco. Divida los tumores en secciones de aproximadamente un centímetro cúbico. Asigne la posición original de cada sección del tumor en relación con las demás y etiquétela con un nombre único.Cubrir las muestras en OCT y cortarlas en un criostato de menos 22 grados centígrados después de teñir las muestras. Utilizando el método de tinción de los contadores hemat, toin y DSN, analice las secciones congeladas por microscopía. Asegúrese de que las secciones sean un tumor viable de carcinoma de células renales de células claras y clasifique como de alto grado, de bajo grado o mixtas de grados bajos y altos.Seleccione hasta cuatro muestras de cada región morfológicamente diferente dentro de cada tumor para la extracción de proteínas, que se mostrarán a continuación para extraer proteínas de muestras tumorales. Coloque de 50 a 75 miligramos de pañuelos desechables. Corte de una tomografía computarizada en tubos de dos mililitros.Añadir 990 microlitros de tampón de lisis, suplementado con una proteína e inhibidores de la fosfatasa y la proteasa. Añade una sola bola de acero de cinco milímetros a cada tubo y homogeneiza a 50 hercios durante cinco minutos. Usando un láser de tejido.Verifique el nivel de homogeneización y luego homogeneice durante otros cinco minutos. Usando una pipeta, transfiera la muestra homogeneizada a un nuevo tubo de dos mililitros, dejando la bola de acero detrás de 10 microlitros de Triton X 100 a cada muestra, y luego centrifuga a 13.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera los sobrenadantes S a tubos de microcentrífuga nuevos y determine la concentración de proteínas mediante el ensayo BCA.Concentraciones de proteínas normalizadas a un miligramo por mililitro antes de nuestra impresión PPA. A partir de cada muestra se realiza una serie de cinco diluciones dobles. Uno de los aspectos que más tiempo consume de este procedimiento es hacer cientos de diluciones, se puede asegurar un resultado exitoso verificando dos veces antes de imprimir portaobjetos.A continuación, se utiliza un observador robótico de dos microrredes para detectar lisados de proteínas en portaobjetos de vidrio recubiertos de nitrocelulosa. Cada muestra se mancha por triplicado, lo que da como resultado un total de 15 manchas por muestra. Los portaobjetos utilizados en este experimento contenían dos almohadillas en las que se ven las muestras.Cada almohadilla fue detectada con muestras idénticas, en este caso, 100 muestras. Otros formatos disponibles incluyen diapositivas de uno, ocho y 16 almohadillas. Cuanto mayor sea el número de almohadillas, menor será el número de muestras que puede haber en cada una.Para comenzar el procedimiento de detección de proteínas, humedece los portaobjetos, un tampón de bloqueo excesivo e incuba a temperatura ambiente Durante una hora en una plataforma oscilante, prepare 800 microlitros de anticuerpos primarios en tampón de bloqueo a las concentraciones deseadas y manténgalo en hielo. Después de la incubación de una hora. En el bloqueo, el tampón se monta en el portaobjetos de un solo bastidor o en el portaobjetos de cuatro bases de bastidor rápido para que se forme un sello hermético entre el portaobjetos y la cámara de incubación.Retire el tampón residual de los pocillos y agregue 600 microlitros de anticuerpo primario a los pocillos respectivos. Coloque los portaobjetos y la cámara en una caja húmeda sellada e incube en una plataforma oscilante durante la noche a cuatro grados centígrados a la mañana siguiente. Retire los portaobjetos de la cámara frigorífica.Retire con cuidado los anticuerpos primarios de cada uno. Bueno, agregue 600 micro liberaciones de 0.1%PBS entre 20 o PBST y lave los portaobjetos en una plataforma mecedora a temperatura ambiente durante cinco minutos. De esta manera, reemplace el PBST por un PBST nuevo.Lave los portaobjetos un total de tres veces. Retire el tampón de los pocillos y agregue 600 microlitros de anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia en la dilución adecuada a los pocillos respectivos. Incubar con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 45 minutos con una agitación suave, es importante proteger la membrana de la luz hasta el momento de la exploración.Después de 45 minutos, retire los anticuerpos secundarios de los pocillos y lávese brevemente tres veces en 600 microlitros de PBST a temperatura ambiente. Retire los portaobjetos del transportador, transfiéralos a un recipiente adecuado y lave el exceso de PBST durante 15 minutos. Mantener la membrana en la oscuridad.Retire el PBST y lave la membrana con PBS a temperatura ambiente durante 15 minutos para eliminar de nuevo los residuos de 20 minutos, manteniendo la membrana en la oscuridad. Pruebe los deslizamientos rápidos en un horno a 50 grados centígrados durante 10 minutos. Finalmente, escanee los portaobjetos como 680 nanómetros o 800 nanómetros dependiendo de los anticuerpos secundarios utilizados.Asegúrese de mantener las diapositivas en la oscuridad hasta que se hayan escaneado. Guarde las imágenes como archivos T. En esta figura se puede ver un ejemplo de una diapositiva RPPA escaneada con canales de 680 y 800 nanómetros.La separación de las imágenes por longitud de onda permite analizar cada almohadilla del portaobjetos RPPA y determinar la expresión individual de la proteína, como se muestra aquí. La expresión de proteínas individuales en las muestras es única, ya que la soína en gel tiene un alto nivel de expresión en el portaobjetos en comparación con el cmic, que tiene una expresión de proteínas mucho menor, pero aún así se expresa universalmente en todas las muestras analizadas. Por el contrario, CD 10 dio una expresión variable con ciertas muestras que dieron un alto nivel de expresión a pesar de que otras muestras tenían poca o ninguna expresión detectable.Finalmente, p JK dos no logró producir ninguna expresión proteica detectable por encima del nivel de fondo. La siguiente figura pone de manifiesto la falta de reactividad cruzada entre los anticuerpos secundarios y los anticuerpos primarios de otra especie. La imagen de la parte inferior izquierda muestra la detección de la expresión de proteínas utilizando anticuerpos secundarios escaneados a la longitud de onda correcta de 680 nanómetros.La expresión de proteínas no se detecta en la imagen de la derecha, escaneada a la longitud de onda incorrecta de 800 nanómetros. Aquí se muestra un ejemplo de la supercurva utilizada para el análisis comparativo de todas las muestras en la diapositiva RPPA. Los puntos verdes representan puntos aceptables y los puntos rojos representan valores atípicos basados en límites predefinidos en el software de análisis.La supercurva se utiliza para producir datos de expresión relativa basados en proteínas. Esta figura muestra los niveles de expresión de una proteína representativa mlh one en tres portaobjetos de RPPA, lo que pone de manifiesto cómo el RPPA puede detectar diferencias entre muestras tratadas y no tratadas. Cada muestra corresponde a una subregión tumoral.La siguiente figura muestra la expresión diferencial de proteínas para mlh uno después de que las muestras se hayan agrupado en función del tratamiento. Se encontró una mayor expresión de MLH uno en el grupo pre-tratamiento cuando se calculó la varianza intratumoral en la expresión de mlh uno entre las muestras pre y post-tratamiento. Después de agrupar las muestras en función del tratamiento, se observó una mayor varianza en las muestras posteriores al tratamiento.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar o PPA para el estudio de la heterogeneidad de proteínas.

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