2.2: Pases celular

El paso, o subcultivo, de las células, es un procedimiento común en el que las células de un cultivo determinado se dividen, o "dividen", en nuevos cultivos y se alimentan con medios frescos para facilitar una mayor expansión. Si bien el concepto en sí es relativamente simple, en este video discutiremos algunos de los pasos más importantes para el mantenimiento y la expansión exitosos de las líneas celulares.

Los metabolitos tóxicos se acumulan en los medios de cultivo celular con el tiempo. Al expandir las células, es particularmente importante cambiar el medio regularmente para mantener la salud celular y monitorear la expansión celular para evitar el crecimiento excesivo de células.

Generalmente, se subcultivan dos tipos principales de células: las líneas celulares inmortalizadas y las líneas de células madre

Las líneas celulares inmortalizadas son células que se derivan de organismos multicelulares que han experimentado algún tipo de mutación que afecta a la regulación de su ciclo celular, lo que les permite proliferar indefinidamente. Quizás la línea celular inmortalizada más famosa es la línea celular HeLa, que se derivó de una lesión de cáncer de cuello uterino encontrada en una biopsia tomada de la Sra. Henrietta Lacks en 1951.

A diferencia de las líneas celulares inmortalizadas por el cáncer, las líneas de células madre se generan aislando células autorrenovadoras y multipotentes de una variedad de tejidos, tanto de tejidos adultos como embrionarios. En las condiciones adecuadas, estas células, al igual que las células madre embrionarias humanas que se ven aquí, pueden mantenerse en cultivo indefinidamente.

Las células se cultivan de manera óptima en suspensión, como células inmortalizadas aisladas de la sangre, o crecen mejor cuando se adhieren a una superficie, como es el caso de muchas células derivadas de tejidos.

El crecimiento de estas células adherentes debe ser monitoreado de cerca para garantizar la salud celular. Dependiendo del tipo de célula, la mayoría de las células adherentes necesitan ser pasadas cuando tienen un 70-90% de confluente, es decir, cuando cubren el 70-90% de la superficie del contenedor de cultivo.

Tenga en cuenta que las líneas celulares conservan muchas características del cultivo celular original, pero con cada paso sucesivo también pueden comenzar a adquirir características únicas del cultivo expandido. Por lo tanto, considere la posibilidad de limitar el número de veces que continúa pasando un cultivo celular individual.

Al pasar las células, es importante utilizar una técnica estéril y los reactivos y equipos adecuados.

Es esencial utilizar los medios adecuados para el crecimiento y la expansión óptimos de su línea celular. Cada línea celular requerirá un cóctel específico de suplementos de crecimiento, sin embargo, la mayoría de las líneas celulares requieren como mínimo suplementación con lo siguiente: Suero, como el suero fetal bovino, que debe ser tratado térmicamente para inactivar el complemento bovino y que proporciona factores de crecimiento vitales para las células, antibióticos, como la penicilina y la estreptomicina, que ayudan a limitar el crecimiento contaminante en el cultivo, y otros factores de crecimiento, como el factor de crecimiento de fibroblastos, para ayudar a prolongar el crecimiento y la expansión de las líneas celulares. Guarde los medios de cultivo celular suplementados o "completos" a 4 C cuando no los esté utilizando.

En primer lugar, tome nota del color de los medios de cultivo de tejidos. Los medios frescos de cultivo celular son ricos en nutrientes y tienen un color naranja claro, en parte debido a la adición del indicador de pH, el rojo fenol.

A medida que las células comienzan a utilizar los nutrientes en los medios, los desechos y el ácido comienzan a acumularse en el cultivo celular, lo que reduce el pH. Por esta razón, muchos medios de cultivo de tejidos contienen rojo fenol, que hace que el medio pase de naranja a amarillo cuando las células vuelven ácido el cultivo. ¡Cambia el medio antes de que se vuelva de este color!

Cuando el rojo fenol convierte el medio en un color rosado, lo que indica que el pH se ha vuelto demasiado básico para el crecimiento celular saludable, puede ser el momento de cambiar su tanque de CO2 y su medio.

La mayoría de las líneas celulares adherentes se adhieren naturalmente al plástico sin recubrimiento. Por lo tanto, las placas de cultivo celular de plástico, como las placas de Petri o las placas de 6 pocillos, se utilizan con frecuencia para el subcultivo de células.

También se utilizan matraces de plástico para cultivos celulares. El matraz de cultivo celular T25, por ejemplo, se utiliza a menudo para expandir poblaciones de líneas celulares pequeñas o para iniciar el crecimiento de una línea celular que se expande lentamente. Los matraces de cultivo T75 se utilizan comúnmente para líneas celulares que proliferan más rápidamente o para generar un mayor número de células de las que pueden caber en un matraz T25.

Al eliminar las células adherentes, primero se deben escindir las proteínas que unen las células al plástico. Para ello, se utiliza con frecuencia la enzima digestiva tripsina. Es importante cronometrar cuidadosamente la exposición a la tripsina, ya que el tratamiento durante demasiado tiempo puede provocar daños en otras proteínas de la superficie celular.

Los medios de cultivo celular pueden contener neutralizadores de tripsina. Por lo tanto, la solución salina tamponada con fosfato, o PBS, se usa a menudo para lavar las células antes de la tripsinización.

El EDTA, un quelante del calcio, a veces también se usa para mejorar la función proteolítica de la tripsina.

Para la expansión de la colonia celular, las células recién pasadas se cultivan en una incubadora de cultivo celular en las condiciones apropiadas para esa línea celular, generalmente a aproximadamente 37 C, 5% de CO2 y 95% de humedad.

Antes de comenzar, es importante comprender la frecuencia con la que se deben monitorear sus células, lo que dependerá de qué tan rápido proliferen sus células.

Ahora que sus medios tienen un color naranja feliz, observe las otras condiciones del cultivo, como si el cultivo está turbio o no. posiblemente indicando contaminación: el tamaño y la densidad de las colonias celulares, y la calidad general de las células.

Si las células han alcanzado aproximadamente el 90% de confluencia, retire el medio de cultivo de tejidos y lave las células con PBS sin calcio ni magnesio.

Ahora agregue tripsina a las células y luego incube a 37 C. Después de unos 5 minutos, confirme que las células se han desprendido y, a continuación, detenga la proteólisis añadiendo medios de cultivo de tejidos frescos.

Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico para la centrifugación. Luego, después de girar las células, retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo y vuelva a suspender las células en medios frescos. Cuente cuántas células ha recolectado y luego siembre las células de acuerdo con la densidad apropiada para una expansión inmediata o posterior.

Ahora que sabes cómo pasar las células, veamos algunas aplicaciones diferentes del método.

Como se mencionó anteriormente, las células madre embrionarias humanas son un tipo de célula que debe ser expulsada. Por lo general, se cocultivan con fibroblastos embrionarios de ratón, o MEF, que proporcionan factores que ayudan a las células madre a mantener su estado pluripotente.

Las colonias de células madre cultivadas en células alimentadoras necesitan ser ?recogidas? una vez que han alcanzado la etapa adecuada de desarrollo. Pueden seleccionarse mediante micropipeta o mediante un raspado suave con una herramienta de recogida de vidrio y luego recubrirse en un nuevo cultivo para su expansión.

Algunas líneas celulares son sensibles a la digestión enzimática o son tan adherentes que no pueden ser resuspendidas con el tratamiento con tripsina solo. Se puede usar un raspador de células para eliminar suavemente las células de la parte inferior de la placa de cultivo. Si las células son particularmente adherentes, intente mover una pipeta serológica con un movimiento de raspado firme mientras enjuaga el fondo del recipiente de células con medios u otra solución adecuada. Tenga cuidado con este método, ya que las células delicadas pueden dañarse por este método mecánico de disociación.

Para aumentar la expansión de sus células de forma más rápida y reproducible de lo que se puede lograr en los matraces de una sola capa, se pueden utilizar matraces multicapa, que pueden expandir los cultivos celulares de 3 a 5 veces en comparación con los matraces de una sola capa.

Acabas de ver la introducción de JoVE a las células de paso. En este video revisamos qué es una línea celular, cómo subcultivar una y algunas aplicaciones diferentes de las células de paso. ¡Gracias por mirar y recuerde mantener sus medios actualizados!