Pases celular

Passaging Cells

JoVE Science Education
Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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JoVE Science Education Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Passaging Cells

2.1: Using a Hemacytometer to Count Cells

2.3: PCR: The Polymerase Chain Reaction

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10:02 min

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April 30, 2023

Overview

Las líneas celulares se utilizan con frecuencia en experimentos biomédicos, ya que permiten la rápida cultura y extensión de tipos de células para análisis experimental. Líneas de células se cultivan en condiciones similares en comparación con las células recién aislado, o primaria, pero con algunas diferencias básicas importantes: (i) células requieren sus propios cócteles de factor de crecimiento específico y (ii) su crecimiento debe ser más de cerca controlar que las células primarias, como las mutaciones que les permiten ser cultivadas indefinidamente también pueden conducir rápidamente a su crecimiento excesivo. Por lo tanto, cuando una línea celular alcanza el punto de crecimiento en la cultura donde cubre la mayor parte de la parte inferior del contenedor de cultura, o sobre un 90% de confluencia, las células deben ser suspendidas, lavadas, utilizadas experimentalmente, congeladas para su uso posterior o volver a sembrar para expansión en recipientes nuevos de la cultura.

Este video muestra cómo utilizar indicadores de medios de comunicación para determinar salud de la cultura de célula, que reactivos y equipos es útil para eliminar con seguridad líneas de células adherentes de cultura y diversos métodos para la transferencia de estos robusta expansión nuevas células en se discutirán las culturas. También son métodos de cómo las células de cultivos alimentador (importantes para proporcionar factores de crecimiento esenciales para líneas celulares) y cómo expandir gran cantidad de cultivos de la línea de celulares a la vez.

Procedure

Pases o subcultivo de las células, es un procedimiento común en donde las células de una determinada cultura son divididas, o “dividir”, en nuevas culturas y alimentadas con medio fresco para facilitar la expansión. Aunque el concepto sí mismo es relativamente simple, en este video vamos a discutir algunos de los pasos más importantes para el mantenimiento del éxito y la expansión de líneas celulares.

Metabolitos tóxicos se acumulan en medios de cultivo celular con el tiempo. Cuando las células en expansión, es particularmente importante cambiar los medios regularmente para mantener la salud celular y controlar la expansión de la célula para evitar el crecimiento excesivo de células.

Por lo general, son subcultivados dos tipos principales de células: inmortalizó líneas celulares y líneas de células madre

Líneas celulares inmortalizadas son células derivadas de organismos multicelulares que han experimentado algún tipo de mutación que afecta a la regulación del ciclo celular, lo que les permite proliferar indefinidamente. Tal vez la más famosa línea de células inmortalizadas es la línea celular HeLa, que deriva de una lesión de cáncer de cuello uterino en una biopsia tomada de la Sra. Henrietta Lacks en 1951.

En contraste con las líneas celulares inmortalizadas por el cáncer, se generan líneas de células madre al aislar las células multipotentes y renueva a sí misma de una variedad de tejidos de tejidos embrionarios y adultos. Bajo las condiciones adecuadas estas células, como las células madre embrionarias humanas que ver aquí, se pueden mantener en cultivo indefinidamente.

Las células son óptimamente cultivadas en suspensión, como las células inmortalizadas aislaron de sangre, o crecen mejores cuando se adhiere a una superficie, como es el caso de muchas de las células derivadas de tejido.

El crecimiento de estas células adherentes debe ser vigilado estrechamente para garantizar la salud de la célula. Dependiendo del tipo de célula, mayoría de las células adherente deba ser pasados cuando son confluentes de 70-90%, es decir, cuando cubren 70-90% de la superficie del recipiente de cultivo.

Tenga en cuenta que las líneas celulares conservan muchas características de la cultura de la célula original, pero con cada paso sucesivo también pueden comenzar a adquirir características únicas a la cultura ampliada. Por lo tanto, considere limitar el número de veces que seguir a paso de una cultura de célula individual.

Cuando pases las células, es importante utilizar una técnica estéril y los reactivos apropiados y equipo.

Es esencial utilizar los medios adecuados para el óptimo crecimiento y expansión de su línea celular. Cada línea celular requerirá un cóctel de suplemento de crecimiento específico, sin embargo, la mayoría líneas de celulares por lo menos requieren suplementación con lo siguiente: suero, tales como suero de Bovino Fetal, que debe ser tratada térmicamente para inactivar el complemento bovino y que brinda factores de crecimiento esenciales para las células, los antibióticos, como penicilina y estreptomicina, que ayudan a limitar el crecimiento de contaminante en la cultura, y otros factores de crecimiento como factor de crecimiento del fibroblasto, para ayudar a prolongar el crecimiento y expansión de las líneas celulares. Almacenar los medios de cultivo celular suplementado, o “completa”, a 4 C cuando no estés usando.

En primer lugar, tomar nota del color de los medios de cultivo de tejidos. Fresco, medios de cultivo celular es rico en nutrientes y aparece un color naranja claro, en parte debido a la adición del indicador de pH, rojo de fenol.

Cuando las células comienzan a utilizar nutrientes en los medios de comunicación, residuos y ácido comienzan a construir en cultivo celular, bajando el pH. Por esta razón, muchos medios de cultivo de tejidos contienen rojo de fenol, que convierte a los medios de comunicación de naranja a amarillo cuando las células la cultura ácida. Los medios de comunicación antes de que el cambio convierte este color!

Cuando el rojo fenol se convierte los medios de comunicación un color rosáceo, lo que indica que el pH es demasiado básico para el crecimiento de la célula sana, puede ser hora de cambiar su tanque de CO2, así como sus medios de comunicación.

Mayoría de las líneas de células adherentes acople naturalmente sin recubrimiento plástico. Por lo tanto placas plástico celular, como placas de Petri o placas bien 6, utilizan con frecuencia para subcultivo de las células.

Frascos de cultivo celular plástico también se utilizan. El frasco de cultivo celular T25, por ejemplo, es de uso frecuente para ampliar las poblaciones línea de células pequeñas o para iniciar el crecimiento de una línea celular de lenta expansión. Frascos de cultivo T75 se utilizan para líneas de células que proliferan más rápidamente o para generar un mayor número de células que pueden caber en un matraz de T25.

Al retirar las células adherentes, las proteínas que se unen las células a la plástica primero deben ser troceadas. Para ello, se utiliza con frecuencia la tripsina enzima digestiva. Es importante cuidadosamente el tiempo de la exposición de tripsina, como tratamiento para demasiado largo puede causar daños a otras proteínas de superficie celular.

Medios de cultivo celular puede contener neutralizadores de tripsina. Por lo tanto, tamponada fosfato salino, o PBS, a menudo se usa para lavar las células antes de tripsinización.

EDTA, quelante del calcio, a veces también se utiliza para realzar la función proteolítica de la tripsina.

Para la expansión de la colonia de células, las células recién pasados luego se cultivan en una incubadora de cultura de célula en las condiciones apropiadas a esa línea de células, típicamente a cerca de 37 C, 5% CO2 y 95% de humedad.

Antes de comenzar, es importante entender cómo con frecuencia las células deben ser supervisadas, que dependerá de cómo rápidamente las células proliferan.

Ahora que su media es de un color naranja feliz, observan las otras condiciones de cultivo, como si la cultura es nublada – posiblemente indicando contaminación–el tamaño y la densidad de las colonias de células y la calidad de las células.

Si las células han alcanzado sobre el 90% de confluencia, eliminar los medios de cultivo de tejidos y lavan las células con calcio y magnesio-libre de PBS.

Ahora añade tripsina a las células y luego los incube a 37 C. Después de unos 5 minutos, confirman que las células han separado y luego detener la proteolisis mediante la adición de medios de cultivo de tejido fresco.

Transferir la suspensión de células en un tubo cónico para la centrifugación. Entonces, después de girar por las células, retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar el pellet y resuspender las células en medios frescos. Contar cuántas células que has recogido y luego sembrar las células según la densidad apropiada para expansión inmediata o posterior.

Ahora que sabes cómo células de paso, vamos a ver algunas aplicaciones del método.

Como se mencionó anteriormente, las células madre embrionarias humanas son un tipo de células que deben ser pasados. Ellos son típicamente morfología con fibroblastos embrionarios de ratón o MEFs, que proporcionan factores que ayudan a las células madre conservan su estado pluripotente.

Colonias de células madre en células de alimentador es necesario “recoger” una vez que han llegado a la etapa apropiada de desarrollo. Pueden ser seleccionadas por una micropipeta o por raspado suave con una herramienta de recolección de vidrio y luego plateados en una nueva cultura de expansión.

Algunas líneas de células son sensibles a la digestión enzimática o están tan firmemente adherentes no se resuspendió con tratamiento de tripsina solo. Un raspador celular puede utilizarse para eliminar suavemente las células de la parte inferior de la placa de cultivo. Si las células son particularmente adherentes, mueva una pipeta serológica en una empresa de movimiento de raspado y enjuague la parte inferior del contenedor de la célula con los medios de comunicación u otra solución apropiada. Tenga cuidado con este método, ya que las células delicadas pueden ser dañadas por este método mecánico de la disociación.

Más rápida y reproducible ampliar la expansión de las células que puede lograrse en frascos de una sola capa, frascos de múltiples capas, que pueden ampliar cultivos celulares 3-5 veces en comparación con frascos de una sola capa, puede ser utilizado.

Sólo ha visto introducción de Zeus a pases de células. En este video repasamos lo que es una línea celular, como subcultura uno y algunas aplicaciones diferentes de pases de las células. Gracias por ver y recordar mantener frescos sus medios!

Transcript

Passaging, or subculturing, of cells, is a common procedure wherein cells from a given culture are divided, or “split”, into new cultures and fed with fresh media to facilitate further expansion. While the concept itself is relatively simple, in this video we will discuss some of the more important steps for the successful maintenance and expansion of cell lines.

Toxic metabolites accumulate in cell culture media over time. When expanding cells, it is particularly important to change the media regularly to maintain cell health and to monitor the cell expansion to avoid cell overgrowth.

Generally, two main types of cells are subcultured: immortalized cell lines and stem cell lines

Immortalized cell lines are cells that are derived from multicellular organisms that have experienced some type of mutation affecting their cell cycle regulation, allowing them to proliferate indefinitely. Perhaps the most famous immortalized cell line is the HeLa cell line, which was derived from a cervical cancer lesion found on a biopsy taken from Ms. Henrietta Lacks in 1951.

In contrast to cell lines immortalized by cancer, stem cell lines are generated by isolating self-renewing and multipotent cells from a variety of tissues both from adult and embryonic tissues. Under the right conditions these cells, like the human embryonic stem cells you see here, can be maintained in culture indefinitely.

Cells are either optimally cultured in suspension, like immortalized cells isolated from blood, or they grow best when adhered to a surface, as is the case for many tissue-derived cells.

The growth of these adherent cells must be closely monitored to ensure cell health. Depending on the cell type, most adherent cells need to be passaged when they are 70-90% confluent, that is, when they cover 70-90% of the culture container surface.

Bear in mind that cell lines retain many characteristics of the original cell culture, but with each successive passage they can also begin to acquire characteristics unique to the expanded culture. Therefore, consider limiting the number of times you continue to passage an individual cell culture.

When passaging cells, it is important to use sterile technique and the appropriate reagents and equipment.

It is essential to use the appropriate media for the optimal growth and expansion of your cell line. Each cell line will require a specific growth supplement cocktail, however, most cell lines at minimum require supplementation with the following: Serum, such as Fetal Bovine Serum, which must be heat-treated to inactivate the bovine complement and which provides vital growth factors for the cells, antibiotics, like penicillin and streptomycin, which help limit contaminating growth in the culture, and other growth factors, like fibroblast growth factor, to help prolong the growth and expansion of the cell lines. Store the supplemented, or “complete”, cell culture media at 4 C when you’re not using it.

First, take note of the color of the tissue culture media. Fresh, cell culture media is rich in nutrients and appears a clear, orange color, partly due to the addition of the pH indicator, phenol red.

As cells begin to use up nutrients in the media, waste and acid begin to build up in the cell culture, lowering the pH. For this reason, many tissue culture medias contain phenol red, which turns the media from orange to yellow when cells turn the culture acidic. Change the media before it turns this color!

When the phenol red turns the media a pinkish color, indicating that the pH has become too basic for healthy cell growth, it may be time to change your CO2 tank as well as your media.

Most adherent cell lines attach naturally to uncoated plastic. Therefore plastic cell culture plates, like petri dishes or 6 well plates, are frequently used for subculturing cells.

Plastic cell culture flasks are also used. The T25 cell culture flask, for example, is often used to expand small cell line populations or to start the growth of a slowly expanding cell line. T75 culture flasks are commonly used for cell lines that proliferate more quickly or to generate larger numbers of cells than can fit in a T25 flask.

When removing adherent cells, the proteins that bind the cells to the plastic must first be cleaved. For this purpose, the digestive enzyme trypsin is frequently used. It is important to carefully time the trypsin exposure, as treatment for too long can result in damage to other cell surface proteins.

Cell culture media can contain trypsin neutralizers. Therefore, phosphate buffered saline, or PBS, is often used to wash the cells before trypsinization.

EDTA, a calcium chelator, is sometimes also used to enhance the proteolytic function of trypsin.

For expansion of the cell colony, the freshly-passaged cells are then grown in a cell culture incubator under the conditions appropriate to that cell line, typically at about 37 C, 5% CO2, and 95% humidity.

Before you begin, it is important to understand how frequently your cells should be monitored, which will depend on how fast your cells proliferate.

Now that your media is a happy orange color, observe the other culture conditions, such as whether or not the culture is cloudy – possibly indicating contamination — the size and density of the cell colonies, and the overall quality of the cells.

If the cells have reached about 90% confluency, remove the tissue culture media and wash the cells with calcium- and magnesium-free PBS.

Now add trypsin to the cells and then incubate them at 37 C. After about 5 minutes, confirm that the cells have detached, and then stop the proteolysis by adding fresh tissue culture media.

Transfer the cell suspension into a conical tube for centrifugation. Then, after spinning down the cells, carefully remove the supernatant without disturbing the pellet and resuspend the cells in fresh media. Count how many cells you’ve collected and then seed the cells according to the density appropriate for immediate or later expansion.

Now that you know how to passage cells, let’s look at some different applications of the method.

As mentioned earlier, human embryonic stem cells are a type of cell that must be passaged. They are typically cocultured with mouse embryonic fibroblasts, or MEFs, which provide factors that help stem cells retain their pluripotent state.

Stem cell colonies grown on feeder cells need to be “picked” once they’ve reached the proper stage of development. They can be selected by micropipette or by gentle scraping with a glass picking tool and then plated in a new culture for expansion.

Some cell lines are sensitive to enzymatic digest or they are so tightly adherent they can’t be resuspended with trypsin treatment alone. A cell scraper can be used to gently remove the cells from the bottom of the culture plate. If the cells are particularly adherent, try moving a serological pipette in a firm scraping motion while rinsing the bottom of the cell container with media or another appropriate solution. Take care with this method, as delicate cells can be damaged by this mechanical method of dissociation.

To more quickly and reproducibly scale up the expansion of your cells than can be achieved in single layer flasks, multilayer flasks, which can expand cell cultures 3-5 fold compared to single layer flasks, can be used.

You’ve just watched JoVE’s introduction to passaging cells. In this video we reviewed what a cell line is, how to subculture one, and some different applications of passaging cells. Thanks for watching and remember to keep your media fresh!

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