La captura simultánea imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión mediante un sistema de división de doble cámara de emisiones: Las solicitudes de adhesión de células

El objetivo general de este procedimiento es realizar un ensayo de adhesión en una cámara de flujo de placas paralelas utilizando un sistema de división de emisión dual con dos cámaras para registrar simultáneamente secuencias de imágenes en tiempo real en dos colores. Para ello, primero se alinean las dos cámaras del sistema de adquisición de imágenes. A continuación, se preparan las células y el sustrato reactivo, y se monta la cámara de flujo de placas paralelas.

A continuación, se calibran los ajustes de la cámara para la adquisición de imágenes en dos colores y se realizan las correcciones digitales necesarias en la alineación de la cámara. Luego se capturan secuencias de imágenes, que demuestran la adquisición de imágenes en dos colores con alta resolución temporal. La ventaja de los sistemas de división de emisión con dos cámaras frente a los sistemas con una sola cámara es que se pueden asignar tiempos de exposición diferentes a cada cámara y se conserva todo el campo de visión.

Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la adhesión celular, como cómo podría afectar la localización de las moléculas de adhesión en la superficie de las células procesos biológicos dinámicos tales como la migración celular, la inflamación y la metástasis del cáncer. El siguiente procedimiento requiere un microscopio invertido de fluorescencia epiescencia. Este debe estar equipado con una fuente de luz de alta intensidad acoplada a una guía de luz, un cubo de filtro combinado y un sistema de cámaras con división de emisión dual.

El equipo del microscopio debe conectarse a un ordenador que ejecute un software de imagen capaz de recopilar y combinar imágenes capturadas por cámaras CCD monocromáticas. Aquí, se utiliza el software StreamPix Five con el módulo SimulPix. Comience abriendo StreamPix Five en la cinta de tareas y seleccione el área de trabajo.

Luego, en el extremo derecho de la pantalla, abra el administrador de espacios de trabajo y seleccione un nuevo espacio de trabajo. Después de nombrar la cámara, siga las indicaciones del software para elegir de una lista predefinida un controlador que coincida con el modelo de la cámara; aparecerá un pequeño icono de cámara en el espacio de trabajo para indicar que se está recibiendo la transmisión de la cámara. Ahora los objetos observados con el microscopio pueden visualizarse en la pantalla.

Repita este proceso para el segundo espacio de trabajo de la cámara, luego para el espacio de trabajo combinado, repita una vez más y todas las cámaras estarán en uso. Aparecerá un mensaje de error. Este mensaje es normal al asignar cámaras del espacio de trabajo uno y dos al espacio de trabajo combinado en el panel de acoplamiento ubicado en el lado derecho de la pantalla de visualización.

Las imágenes en el área de trabajo uno y dos se superpondrán en el área de trabajo combinada como dos imágenes con pseudocolores. El aspecto más difícil de este procedimiento es la alineación de la cámara. Para asegurar el éxito, utilizamos la diapositiva del fabricante siguiendo meticulosamente las instrucciones del fabricante.

Para alinear las cámaras en el sistema de división de emisión con doble cámara, envíe luz de campo brillante o contraste de fase al ocular del microscopio. Coloque la rejilla de calibración recubierta de metal proporcionada por el fabricante sobre la platina del microscopio y alinee la rejilla en la platina del microscopio. Muestre la rejilla sin binning y sin escalado automático, enfoque la imagen y luego desplace, pero no retire, el alojamiento del divisor dicróico para alinear la cámara uno.

Luego, utilizando el dial de ajuste de enfoque en el puerto del monte submarino uno, enfoque nuevamente la imagen. A continuación, empuje completamente el alojamiento del divisor dicróico hacia el dispositivo de adquisición de doble canal, de modo que la imagen se divida mediante el divisor dicróico hacia ambas cámaras. Afloje los tornillos de fijación de 3 5 60 de un cuarto de pulgada y gire la segunda cámara en el puerto hembra CM montaje dos hasta que la orientación de la cuadrícula sea idéntica en ambas imágenes; utilizando el dial de ajuste de enfoque en el puerto C montaje dos, enfoque la imagen proveniente de la cámara dos.

Para finalizar el alineamiento, use el botón RL en el lado derecho del DC dos para ajustar las posiciones de las imágenes combinadas hasta el levantamiento derecho. La frontera vertical de las imágenes debe estar alineada con precisión en el área de trabajo combinada. Luego, use el botón UD para ajustar el alineamiento vertical de la segunda imagen hasta que las barras de la cuadrícula horizontal estén correctamente alineadas.

Si durante el alineamiento vertical ocurre una ligera rotación de la cámara, corrija este problema aflojando los tres tornillos de cuarto de pulgada de 5-60 para la cámara dos y girando hasta que la imagen mostrada esté correctamente alineada. Prepare células de cáncer de mama BET 20 para el ensayo de adhesión en cámara de flujo de placas paralelas teñéndolas con anti-CD 24 y TECA 4-5-2 utilizando anticuerpos secundarios LOR 5-68 y 4-88 según se describe en el documento adjunto; asegúrese de preparar los controles adecuados de un solo color. Tras la tinción, dispense las células en el depósito de la cámara de flujo de placas paralelas. Conecte dos tramos separados de tubo a los puertos de entrada y salida de la cámara de flujo.

Un tubo se conectará al depósito que contiene las células marcadas suspendidas en DPBS más 0,1 % de PSA. Conecte el otro tubo a la bomba de jeringa, que extraerá el líquido a una velocidad de flujo determinada. Conecte una línea de vacío a la cámara de flujo y coloque la cámara de flujo sobre la placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contiene una monocapa de células de ovario de hámster chino que expresan lectina o células CHO-E.

Ajuste la cámara de flujo y la junta de la cámara de flujo para garantizar un sello al vacío adecuado. Retire el fluido del depósito, supervisando el conjunto de la cámara de flujo para verificar el sello correcto. Finalmente, coloque el conjunto de la cámara de flujo sobre el microscopio, encienda la fuente de luz y configure el microscopio mediante inspección manual.

Asegúrese de que la carcasa del divisor de haz esté en la posición operativa deprimida correcta y no en modo de derivación. Cambie manualmente al modo de fluorescencia y seleccione el cubo de filtro de fluorescencia verde-rojo para determinar por separado el tiempo de exposición y la ganancia. Capture imágenes de las células utilizando la fluorescencia roja en la cámara uno y la fluorescencia verde en la cámara dos.

Presione manualmente el divisor de haz según sea necesario para obtener las imágenes. A continuación, agregue una suspensión de células BT 20 marcadas solo con flora roja. Cuatro anticuerpos conjugados en el depósito conectado al puerto de entrada de la cámara de flujo con placas paralelas.

Utilice la bomba de jeringa para perfundir las células BT 20 sobre el monocapa de choi en la cámara de flujo de placas paralelas. En los ajustes en vivo del software de imagen, ajuste el tiempo de exposición de la cámara uno para obtener una imagen en el canal rojo. Igualar el tiempo de exposición de la cámara dos al tiempo de exposición de la cámara uno.

Si se observa una imagen en el canal verde, están presentes artefactos de paso cruzado. Si esto ocurre, mantenga el tiempo de exposición equivalente en la cámara uno y la cámara dos, y reduzca el tiempo de exposición hasta que el artefacto de paso cruzado ya no sea visible en el canal verde. Ajuste la ganancia de la cámara uno para mejorar la visibilidad de la imagen en el canal rojo si es necesario.

A continuación, retire cualquier suspensión restante de células BT 20 del depósito y sustituya la suspensión por DPBS. Utilice la bomba de jeringa para perfundir la solución sobre la monocapa de choi hasta que las células BT 20 ya no sean visibles en la monocapa. Vuelva a llenar el depósito con la suspensión de células BT 20 marcadas únicamente con el anticuerpo conjugado con el fluoróforo verde cuatro.

Repita el proceso de calibración de la cámara utilizando los controles de color único verde. Esta vez, defina el tiempo de exposición con la cámara dos para obtener imágenes de las células en el canal verde sin artefactos de fuga en el canal rojo capturado por la cámara uno. Utilice el software de imagen para visualizar simultáneamente las imágenes capturadas por las dos cámaras CCD monocromáticas en la cámara de flujo.Experimento.

Combine las imágenes recopiladas desde ambas cámaras utilizando el módulo simul pics de stream picks. Utilice ajustes de corrección digital en simul pic o software alternativo para alinear espacialmente las imágenes combinadas. Si es necesario, las imágenes pueden corregirse con el módulo simul PIC para ajustes horizontales, verticales y rotacionales.

El sistema ya está listo para usarse con el fin de capturar simultáneamente imágenes de dos colores. Se utilizó un ensayo de adhesión en una cámara de flujo con placas paralelas para demostrar el sistema de división de emisión con dos cámaras descrito en este video. Como se muestra aquí, el sistema detectó células BT 20 marcadas fluorescentemente con anticuerpo anti-CD 24 humano, mostrado en rojo, y HECA 4 52, que se une a moléculas relacionadas con SCOs, mostrado en verde.

Algunas células en rodamiento mostraron señales rojas pero no verdes. Otras mostraron señales verdes pero no rojas, y aún otras células mostraron tanto señales rojas como verdes. Las cámaras mantuvieron la resolución óptica y temporal necesaria para rastrear las características celulares durante el giro y el movimiento extremo mientras las células rodaban sobre el sustrato reactivo en la dirección del flujo; los canales de emisión fusionados revelaron la distribución y colocalización de las moléculas CD24 y sialiladas en la superficie de las células BT20 que rodaban y se adherían a monocapas de CHO-e.

Estas imágenes muestran un acercamiento de una sola célula BT 20 en la que las moléculas CD 24 y sialiladas co-localizan y aparecen como puntos de color amarillo a naranja cuando se combinan los canales de emisión pseudo coloreados en rojo y verde. En conjunto, esta información demuestra que el sistema de división de emisión con doble cámara posee la resolución espacial, temporal y óptica necesaria para revelar características celulares y moleculares en aplicaciones como los ensayos de adhesión en cámaras de flujo, en los que las células se desplazan rápidamente a través del campo de visión.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y calibrar un sistema de división de emisión con dos cámaras o realizar en tiempo real un ensayo de adhesión en una cámara de flujo de placas paralelas con imágenes en dos colores. Este método puede aplicarse a otros ensayos in vitro que utilicen fluorescencia para estudiar el comportamiento celular.