La captura simultánea imágenes en tiempo real en los dos canales de emisión mediante un sistema de división de doble cámara de emisiones: Las solicitudes de adhesión de células

El objetivo general de este procedimiento es realizar un ensayo de adhesión de cámara de flujo de placa paralela utilizando un sistema de división de emisiones de doble cámara para registrar simultáneamente secuencias de imágenes en tiempo real en dos colores. Para ello, primero se alinean las dos cámaras de la configuración de imágenes. A continuación, se preparan las celdas y el sustrato reactivo y se configura la cámara de flujo de placas paralelas.

A continuación, se calibran los ajustes de la cámara para la adquisición de imágenes en dos colores y se realizan las correcciones digitales necesarias en la alineación de la cámara. A continuación, se capturan secuencias de imágenes, que demuestran la adquisición de imágenes de doble color con alta resolución temporal. La ventaja de los sistemas de división de emisiones de doble cámara sobre los sistemas de una sola cámara es que se pueden asignar diferentes tiempos de exposición a cada cámara y se conserva todo el campo de visión.

Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la adhesión celular, como por ejemplo cómo podría la localización de las moléculas de adhesión en la superficie de las células afectar a los procesos biológicos dinámicos, como la migración celular, la inflamación y la metástasis del cáncer. El siguiente procedimiento requiere un microscopio de epifluorescencia invertida. Este debe estar equipado con una fuente de luz de alta intensidad acoplada a una guía de luz, un cubo de filtro combinado y un sistema de cámara de división de emisiones dual.

La configuración del microscopio debe estar conectada a una computadora que ejecute un software de imágenes capaz de recopilar y combinar imágenes capturadas por cámaras CCD monocromáticas. Aquí, se utiliza el software multicámara stream picks five con el módulo de selecciones simultáneas. Comience por abrir la secuencia selecciona cinco en la cinta de tareas, seleccione área de trabajo.

Luego, en el extremo derecho de la pantalla, abra el administrador de espacios de trabajo y seleccione nuevo espacio de trabajo. Después de nombrar la cámara, siga las instrucciones del software para seleccionar de una lista precargada, un modelo de cámara que coincida con el capturador, aparecerá un pequeño icono de cámara en el espacio de trabajo para indicar que se recibe la transmisión de la cámara. Los objetos fotografiados con el microscopio ahora se pueden ver en la pantalla.

Repita este proceso para el segundo espacio de trabajo de la cámara, luego para el espacio de trabajo combinado, repita esto una vez más y todas las cámaras estarán en uso. Aparecerá un mensaje de error. Este mensaje es normal que se asignen las cámaras desde el espacio de trabajo uno y dos al espacio de trabajo fusionado en el panel de acoplamiento ubicado en el lado derecho de la pantalla de visualización.

Las imágenes del espacio de trabajo uno y dos se superpondrán en el espacio de trabajo combinado como dos imágenes pseudocoloreadas. El aspecto más difícil de este procedimiento es la alineación de la cámara. Para garantizar el éxito, utilizamos la corredera del fabricante siguiendo meticulosamente las instrucciones del fabricante.

Para alinear las cámaras en el sistema de división de emisiones de doble cámara, envíe luz de campo claro o de contraste de fase al ocular del microscopio. Coloque la rejilla de calibración con recubrimiento metálico proporcionada por el fabricante en la platina del microscopio y cuadre la rejilla en la platina del microscopio. Muestre la cuadrícula sin agrupación y sin escalado automático y enfoque y luego desplácela, pero no retire la carcasa dicroica para alinear la cámara uno.

Luego, usando el dial de ajuste de enfoque en el puerto uno de los montes submarinos, vuelva a enfocar la imagen. A continuación, empuje completamente la carcasa dicroica en el dispositivo de adquisición de doble canal para que la imagen se divida por el dicroico a ambas cámaras. Afloje los tornillos de fijación 3 5 60 de cuarto de pulgada y gire la segunda cámara en el puerto dos de montura CM hembra hasta que la orientación de la cuadrícula sea idéntica en ambas imágenes usando el dial de ajuste de enfoque en el puerto de montura C dos, coloque la imagen de la cámara dos en el foco.

Para finalizar la alineación, use la perilla RL en el lado derecho de DC dos para ajustar las posiciones de imagen combinadas hasta que se levante a la derecha. El límite vertical de las imágenes se alinea con precisión en el espacio de trabajo combinado. A continuación, utilice el mando UD para ajustar la alineación hacia arriba y hacia abajo de la segunda imagen hasta que las barras horizontales de la cuadrícula estén correctamente alineadas.

Si durante la alineación hacia arriba y hacia abajo se produce una ligera rotación de la cámara, corrija este problema aflojando los tornillos de 3, 5 60 pulgadas y girando hasta que la imagen mostrada esté correctamente alineada. Prepare las células de cáncer de mama BET 20 para el ensayo de adhesión de la cámara de flujo de placa paralela tiñéndolas con anti CD 24 y TECA 4 5 2 utilizando LOR 5 68 y 4 88 secundarios como se describe en el documento adjunto, asegúrese de preparar los controles de color único apropiados después de la tinción y dispense las células en el depósito de la cámara de flujo de placa paralela. Conecte dos tramos separados de tubería a los puertos de entrada y salida de la cámara de flujo.

Un tubo se conectará al depósito que contiene las células marcadas suspendidas en DPBS más que contienen 0,1 % de PSA. Conecte el otro tubo a la bomba de jeringa, que extraerá el líquido a un caudal especificado. Conecte una línea de vacío a la cámara de flujo y coloque la cámara de flujo sobre la placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros que contiene una monocapa de células de ovario de hámster chino que expresan lectina o células cho e.

Ajuste la cámara de flujo y la junta de la cámara de flujo para garantizar un sellado al vacío adecuado. Extraiga el fluido del depósito monitoreando el conjunto de la cámara de flujo para un sellado adecuado. Finalmente, coloque el conjunto de la cámara de flujo en el microscopio, encienda la fuente de luz y configure el microscopio mediante inspección manual.

Asegúrese de que la carcasa dicroica esté en la posición de funcionamiento presionada correcta y no esté en modo de derivación. Cambie manualmente al modo de fluorescencia y seleccione el cubo de filtro de fluorescencia verde y rojo para determinar el tiempo de exposición y la ganancia por separado. Visualice las células utilizando fluorescencia roja en la cámara uno y fluorescencia verde en la cámara dos.

Presione manualmente el dicroico según sea necesario para obtener las imágenes. A continuación, deposite una suspensión de células BT 20 teñidas solo con flora roja. Cuatro anticuerpos conjugados en el reservorio conectados al puerto de entrada de la cámara de flujo de placas paralelas.

Utilice la bomba de jeringa para perfundir las células BT 20 sobre la monocapa choi en la cámara de flujo de placa paralela. En la configuración en vivo del software de imagen, ajuste el tiempo de exposición de la cámara uno para obtener una imagen en el canal rojo. Haga coincidir el tiempo de exposición de la cámara dos con el tiempo de exposición de la cámara uno.

Si se observa una imagen en el canal verde, hay artefactos de sangrado. Si esto sucede, mantenga el tiempo de exposición equivalente en la cámara uno y la cámara dos y reduzca el tiempo de exposición hasta que el artefacto de sangrado ya no sea visible en el canal verde. Ajuste la ganancia de la cámara uno para mejorar la visibilidad de la imagen en el canal rojo si es necesario.

A continuación, retire cualquier resto de suspensión de celda BT 20 del depósito y reemplace la suspensión con DPBS. Utilice la bomba de jeringa para perfundir la solución sobre la monocapa choi hasta que las células BT 20 ya no sean visibles en la monocapa. Vuelva a llenar el depósito con la suspensión de células BT 20 teñidas solo con anticuerpo conjugado verde fluorescente cuatro.

Repita el proceso de calibración de la cámara utilizando los controles verdes de un solo color. Esta vez defina el tiempo de exposición con la cámara dos para obtener imágenes de las celdas en el canal verde sin sangrar a través de los artefactos en el canal rojo recogidos por la cámara uno. Utilice el software de imágenes para ver simultáneamente las imágenes capturadas por las dos cámaras CCD monocromáticas en la cámara de flujo. Experimento.

Combine las imágenes recopiladas de ambas cámaras utilizando el módulo de fotos simultáneas de selecciones de transmisión. Utilice ajustes de corrección digital en imágenes simultáneas o software alternativo para alinear espacialmente las imágenes combinadas. Si es necesario, las imágenes se pueden corregir con el módulo PIC simul para ajustes horizontales, verticales y rotativos.

El sistema ya está listo para ser utilizado para capturar dos imágenes en color simultáneamente. Se utilizó un ensayo de adhesión de cámara de flujo de placa paralela para demostrar el sistema de división de emisiones de doble cámara descrito en este video. Como se muestra aquí, el sistema detectó células BT 20 que fueron marcadas con fluorescencia con CD 24 antihumano que se muestra en rojo y HECA 4 52, que se une a las moléculas relacionadas con SCO que se muestra en verde.

Algunas celdas rodantes mostraban señales rojas pero no verdes. Otras mostraban señales verdes pero no señales rojas, y otras celdas mostraban señales rojas y verdes. Aquí. Las cámaras mantuvieron la resolución óptica y temporal para rastrear las características de la célula en una célula, dando vueltas y vueltas a medida que rodaba sobre el sustrato reactivo en la dirección del flujo, los canales de emisión fusionados revelaron la distribución y colocalización de las moléculas CD-24 y saciadas en la superficie de las células BT 20 rodando y adhiriéndose a las monocapas CHO e.

Estas imágenes muestran un zoom de una sola célula BT 20 en la que CD 24 y las moléculas saciadas se colocalizan y aparecen como manchas amarillas a naranjas cuando se fusionan los canales de emisión pseudocoloreados rojo y verde. En conjunto. Esta información demuestra que el sistema de división de emisiones de doble cámara tiene la resolución espacial, temporal y óptica necesaria para revelar características celulares y moleculares en aplicaciones como los ensayos de adhesión en cámara de flujo en los que las células se mueven rápidamente a través del campo de visión.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar y calibrar un sistema de división de emisiones de doble cámara o obtener imágenes de un ensayo de adhesión de cámara de flujo de placa paralela en tiempo real en dos colores. Este método se puede aplicar a otros ensayos in vitro que utilizan fluorescencia para estudiar el comportamiento celular.