Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de múltiples especies proteicas simultáneamente con precisión nanométrica en células fijadas o vivas. Esto se logra primero ajustando la posición de una cámara y de la óptica hasta que una imagen enfocada del microscopio se proyecte sobre el sensor de la cámara. El segundo paso consiste en alinear los haces láser para que coincidan directamente sobre una muestra colocada en la platina del microscopio.

A continuación, se ilumina la muestra celular preparada y se selecciona una célula que exprese las proteínas deseadas. El paso final consiste en obtener imágenes de la célula mediante microscopía de localización por activación foto-fluorescente, iluminando la muestra con láseres y dirigiendo luego la fluorescencia celular hacia el chip de la cámara para adquirir un conjunto de datos. En definitiva, la microscopía de localización por activación foto-fluorescente se utiliza para mostrar la localización de múltiples especies proteicas a escala espacial de nanómetros en células fijadas o vivas, ya sea en campo amplio o empleando fluorescencia por reflexión interna total para aislar una región delgada de la muestra.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la microscopía confocal o electrónica, es que permite obtener imágenes de múltiples proteínas simultáneamente con resolución nanométrica en células fijadas o vivas. Los siguientes pasos hacen referencia a un sistema de numeración mostrado aquí, que es un esquema del montaje multicolor F Om proporcionado como figura uno en el protocolo de texto adjunto para alinear el microscopio; comience colocando una escala de calibración o una retícula en la platina del microscopio con un objetivo de 10 x colocado y la lámpara ajustada para luz transmitida. Centre la línea vertical en el centro del campo de visión.

A continuación, ajuste el microscopio para una iluminación coaxial cerrando el diafragma de campo y observando a través de los oculares en posición vertical. Si los bordes del diafragma de campo están desenfocados, ajuste la altura del condensador hasta que tanto el diafragma de campo como el retículo estén enfocados. Luego, ajuste la posición lateral del diafragma de campo hasta que esté centrado con respecto al campo de visión, y cierre el diafragma de campo hasta que solo la cuadrícula central del retículo esté iluminada.

La primera vez que se ensamblan estos componentes, ajuste las longitudes de trayectoria de cada canal para que sean iguales. Para llevar a cabo este procedimiento, refleje la luz roja hacia el sensor de la cámara ajustando los espejos siete y nueve, y cierre la abertura de detección para evitar la superposición espacial entre los dos canales. Luego, enfoque la imagen del radical en el canal de luz reflejada y verifique si también está enfocada en el canal de luz transmitida.

Si la imagen en el canal de luz transmitida no está enfocada, desplace el espejo nueve hasta que la imagen radical esté enfocada simultáneamente en ambos canales. Comience a alinear los láseres retirando la lente uno del trayecto del láser y bloqueando los haces de activación y lectura. Luego, coloque una tarjeta blanca al ras contra el espejo cuatro, abra el obturador del microscopio y enfoque hasta que la imagen radical se proyecte sobre la tarjeta frente al espejo cuatro.

A continuación, desbloquee el haz de lectura y ajuste el espejo uno para centrar el láser de lectura en la cruz del imagen del radical sobre el espejo cuatro. Una vez centrado, proyecte la imagen del radical sobre el espejo cinco y ajuste el espejo cuatro hasta que el haz esté centrado en la cruz de la imagen del espejo cinco. El haz de lectura ahora debe estar centrado tanto en M cuatro como en M cinco.

Luego bloquee el haz de lectura cerrando el obturador uno. A continuación, proyecte la imagen del radical sobre el espejo tres. Retire el expansor de haz de la trayectoria del láser y desbloquee el láser de activación.

Ahora ajuste el espejo dos para centrar el haz de activación sobre las líneas cruzadas de la imagen del radical en el espejo tres. Una vez centrado, reemplace el expansor de haz entre los espejos dos y tres, y ajuste la posición del expansor de haz hasta que el haz esté centrado sobre las líneas cruzadas de la imagen del radical. En el espejo tres, proyecte la imagen del radical sobre el espejo cinco y enfoque.

Utilizando el botón de enfoque del microscopio, ajuste el ángulo del espejo dicróico número uno hasta que el haz de activación esté centrado en la imagen redle. A continuación, bloquee el láser de activación cerrando el obturador dos sin objetivo colocado y con el obturador del microscopio abierto. Abra el obturador de lectura, obturador uno, y proyecte el láser a través de la abertura posterior del microscopio.

Ajuste el espejo cinco hasta que el haz salga del microscopio, de modo que el haz salga verticalmente del microscopio con la lente uno y el objetivo nuevamente en su lugar. Coloque una muestra que contenga bromo B a 100 micromolares sobre la platina con el láser de activación bloqueado. Proyecte el láser de lectura a través de un objetivo de 60 x y dentro del colorante.

Con la ganancia de multiplicación de electrones desactivada. Envíe esta imagen a la cámara. A continuación, enfoque el objetivo en la muestra.

Abrir la abertura lo suficientemente ancha como para permitir la obtención de imagen del perfil completo del haz. Luego, trasladar lateralmente la abertura de modo que el centro del perfil del haz y la abertura sean concéntricos. Mediante el software de la cámara, seleccionar la región de interés para permitir la región más pequeña de lectura de la cámara que englobe ambos canales y registrar estas coordenadas.

En este momento, registre una única instantánea para representar el perfil del haz de lectura. A continuación, bloquee el láser de lectura cerrando el obturador uno y abra el obturador dos. Para comenzar a medir el perfil del haz de activación, proyecte el láser de activación sobre la muestra; si es necesario, utilice una ganancia de multiplicación electrónica inferior a 100 y ajuste el primer espejo dicróico hasta que el haz esté centrado en cada campo de visión.

Luego, registre una instantánea del perfil del haz de activación para comenzar la adquisición de imágenes multicolor de F palm. Elimine toda la iluminación ambiental. A continuación, proyecte la lámpara de mercurio mediante el soporte abatible sobre las células transfectadas y cambie el cubo de filtros a uno que contenga la longitud de onda de excitación adecuada del estado previo al fotoconmutado.

Una vez seleccionada una célula, baje el soporte giratorio para permitir que los láseres pasen al microscopio y cambie la torreta de filtros a la que contiene el espejo dicromático adecuado para la obtención de imágenes, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Luego proyecte esta imagen a la cámara para distinguir las células transfectadas de la fluorescencia de fondo y confirmar que las moléculas son fotoactivables. Ilumine brevemente la muestra con una potencia baja inferior a 10 microvatios procedente del láser de activación.

A continuación, prepare el software de la cámara para la adquisición de series cinéticas ajustando la ganancia de multiplicación electrónica a 200 y el número deseado de cuadros entre cinco y 10.000. También establezca la exposición entre 10 y 30 milisegundos. Luego bloquee el haz de activación, desbloquee el haz de lectura y proyecte la imagen de la célula iluminada hacia la cámara.

Seleccione un plano focal cerca de la membrana celular inferior moviendo el enfoque hacia abajo hasta que las moléculas individuales ya no sean visibles. Luego, mueva gradualmente el enfoque hacia arriba hasta que las moléculas comiencen a ser visibles. Ahora desbloquee el haz de activación e ilumine la muestra con una intensidad inferior a un vatio por centímetro cuadrado.

Comience a adquirir estos datos mediante el software de la cámara mientras mantiene una densidad de 0,1 a una molécula fotoactivable visible por micrómetro cuadrado, ajustando dinámicamente el filtro de densidad neutra colocado frente al láser de activación. Para la imagen de fluorescencia por reflexión interna total, monte el espejo cinco y la lente uno sobre una única platina de traslación que se moverá lateralmente justo detrás de la entrada del microscopio. A medida que se trasladan el espejo cinco y la lente uno, los láseres que salen hacia arriba a través de la muestra por el objetivo se inclinarán gradualmente hacia un lado; continúe trasladando la platina hasta que el ángulo de los láseres alcance 90 grados respecto a la vertical.

En este momento, el láser emergente desaparecerá por sí mismo y el láser entrante se reflejará hacia atrás dentro de la abertura, viajando en sentido antiparalelo al haz entrante y desplazado hacia un lado. Debería observar una reducción del fondo cuando la muestra entre en fluorescencia por reflexión interna total tras completar las adquisiciones de imagen; cierre inmediatamente el obturador del microscopio y bloquee ambos haces. Desactive la ganancia de multiplicación electrónica.

Configure la cámara para grabar un cuadro y establezca la región de lectura de la cámara en su tamaño máximo. Finalmente, bloquee un canal colocando una tarjeta sobre F tres o F cuatro con un filtro de paso largo montado en la lámpara del microscopio. Ilumine la muestra y proyecte esta imagen hacia la cámara.

Registre una imagen de la célula para representar toda la célula en luz transmitida. Aquí se muestra un ejemplo de una adquisición de F palm de dos colores de una célula NIH 3T3 que expresa tanto DENDRA dos hemaglutinina como actina PAM Cherry. El canal transmitido a la izquierda contiene longitudes de onda más largas que el canal reflejado a la derecha.

Se muestran aquí instantáneas de la adquisición de FOM de dos colores tras la sustracción del fondo y la transformación para superponer los canales izquierdo y derecho. Se pueden identificar y localizar moléculas individuales. Algunas moléculas aparecen más brillantes en el canal transmitido y otras tienen una distribución más uniforme de la emisión entre los dos canales.

Esto indica la diferencia en los espectros de emisión entre PAM cherry y DENDRA dos, respectivamente, y se utiliza en el análisis para identificar estas dos especies. El histograma mostrado aquí indica una relación de la intensidad del canal rojo transmitido dividida por la intensidad total para todas las moléculas localizadas después de que se hubieran aplicado las tolerancias. Los píxeles aparecen blancos en la imagen inferior izquierda y aparecen rojos en la imagen final fusionada mostrada en la parte inferior derecha, donde aquellos en la región verde se muestran como blancos en la imagen superior derecha y aparecen verdes en la imagen final fusionada mostrada en la parte inferior derecha.

Los niveles umbral que se eligen al renderizar afectan en gran medida el grado de ruido y la apariencia de la colocalización mostrada. Aquí se presentan tres opciones diferentes de renderizado que resultan en distintos grados de solapamiento; los niveles umbral más conservadores se muestran en los dos últimos. Los histogramas de color F palm alfa son más fáciles de interpretar cuando hay dos picos claramente distinguibles en la imagen.

Aunque el histograma de la izquierda es un buen candidato para un análisis posterior, las imágenes resultantes de los otros dos histogramas serán mucho más difíciles de interpretar siguiendo este procedimiento. Métodos como la reflexión interna total, la microscopía y la imagenología de células vivas pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como cómo están organizadas las proteínas a escala nanométrica en las membranas de células vivas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar su propio microscopio FAR y utilizarlo para adquirir datos.

No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso, y se debe completar la capacitación en seguridad antes de intentar este procedimiento.