Imágenes Multicolor Simultáneas de Estructuras Biológicas con Microscopía de Localización de Fotoactivación de Fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de múltiples especies de proteínas simultáneamente con precisión nanométrica en células fijas o vivas. Esto se logra ajustando primero la posición de una cámara y la óptica hasta que se proyecta una imagen enfocada del microscopio en el chip de la cámara. El segundo paso es organizar los rayos láser para que estén alineados directamente con una muestra en la platina del microscopio.

A continuación, se ilumina la muestra celular preparada y se elige una célula que exprese las proteínas deseadas. El paso final es obtener imágenes de la célula con microscopía de localización de fotoactivación de fluorescencia iluminando la muestra con láseres y, a continuación, dirigir la fluorescencia de la célula al chip de la cámara para adquirir un conjunto de datos. En última instancia, la microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia se utiliza para mostrar la localización de múltiples especies de proteínas a escala espacial nanométrica en células fijas o vivas y en campo amplio o cuando se utiliza fluorescencia de reflexión interna total para aislar una región delgada de la muestra.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la microscopía confocal o electrónica, es que se pueden obtener imágenes de múltiples proteínas simultáneamente con resolución nanométrica en células fijas o vivas. Los siguientes pasos se refieren a un sistema de numeración como se muestra aquí, que es un esquema para la configuración F Om multicolor proporcionada como figura uno en el protocolo de texto adjunto para alinear el microscopio Comience colocando una escala de calibración o radical en la platina del microscopio con un objetivo 10 x en su lugar y la lámpara configurada para la luz transmitida. Centra la vertical en el centro del campo de visión.

A continuación, ajuste el microscopio para obtener una iluminación más intensa cerrando la apertura del campo y mirando a través de los oculares a la vertical. Si los bordes de la apertura de campo están desenfocados, ajuste la altura del condensador hasta que tanto la apertura de campo como la redle estén enfocadas. A continuación, ajuste la posición lateral de la apertura de campo hasta que esté centrada con respecto al campo de visión y cierre la apertura de campo hasta que solo se ilumine la rejilla central del redle.

La primera vez que se ensamblen estos componentes, ajuste las longitudes de ruta de cada canal para que sean iguales. Para llevar a cabo este proyecto, el redle en el chip de la cámara ajusta los espejos siete y nueve y cierra la apertura de detección para evitar la superposición espacial entre los dos canales. A continuación, enfoque la imagen del radical en el canal de luz reflejada y compruebe si también está enfocada en el canal de luz transmitida.

Si la imagen en el canal de luz transmitida no está enfocada, traslade el espejo nueve hasta que la imagen radical esté enfocada simultáneamente en ambos canales. Comience a alinear los láseres quitando la lente uno de la trayectoria del láser y bloqueando los haces de activación y lectura. A continuación, coloque una tarjeta blanca al ras del espejo cuatro, abra el obturador del microscopio y enfoque hasta que la imagen radical se proyecte en la tarjeta frente al espejo cuatro.

A continuación, desbloquee el haz de lectura y ajuste el espejo uno para centrar el láser de lectura en el punto de mira de la imagen radical en el espejo cuatro. Una vez centrado, proyecte la imagen radical en el espejo cinco y ajuste el espejo cuatro hasta que el haz esté centrado en el punto de mira de la imagen del espejo cinco. El haz de lectura ahora debería estar centrado tanto en M cuatro como en M cinco.

A continuación, bloquee el haz de lectura cerrando el obturador uno. A continuación, proyecte la imagen radical en el espejo tres. Retire el expansor de haz de la trayectoria del láser y desbloquee el láser de activación.

Ahora ajuste el espejo dos para centrar el haz de activación en el punto de mira de la imagen radical en el espejo tres. Una vez centrado, reemplace el expansor de haz entre los espejos dos y tres y ajuste la posición del expansor de haz hasta que el haz esté centrado en los puntos de mira de la imagen radical. En el espejo tres, proyecte la imagen radical en el espejo cinco y enfoque.

Usando la perilla de enfoque del microscopio, ajuste el ángulo del espejo dicroico número uno hasta que el haz de activación se centre en la imagen roja. A continuación, bloquee la activación del láser cerrando el obturador dos sin ningún objetivo en su lugar y abriendo el obturador del microscopio. Abra el obturador de lectura y proyecte el láser a través de la apertura trasera del microscopio.

Ajuste el espejo cinco hasta que el haz emerja del microscopio, de modo que el haz salga del microscopio verticalmente con la lente uno y el objetivo en su lugar. Coloque una muestra que contenga 100 micromolares de bromo B en la platina con el láser de activación bloqueado. Proyecte el láser de lectura a través de un objetivo de 60 x y en el tinte.

Con la ganancia multiplicadora de electrones desactivada. Envía esta imagen a la cámara. A continuación, concentre el objetivo en la muestra.

Abra la apertura lo suficiente como para permitir la obtención de imágenes del perfil de haz completo. A continuación, traslade la apertura lateralmente para que el centro del perfil del haz y la apertura sean concéntricos. Con el software de la cámara, elija la región de interés para permitir que la región de lectura de la cámara más pequeña encapsule ambos canales y registre estas coordenadas.

En este punto, grabe una sola instantánea para representar el perfil de la viga de lectura. A continuación, bloquee el láser de lectura cerrando el obturador uno y abriendo el obturador dos. Para comenzar a medir el perfil del haz de activación, proyecte el láser de activación a la muestra, si es necesario, use una ganancia de multiplicación de electrones de menos de 100 y ajuste el primer espejo dicroico hasta que el haz esté centrado en cada campo de visión.

A continuación, grabe una instantánea del perfil del haz de activación para comenzar a adquirir imágenes multicolor de la palma de la mano. Elimine toda la iluminación de la habitación. A continuación, proyecte la lámpara de mercurio a través de la montura abatible sobre las células transfectadas y cambie el cubo del filtro a uno que contenga la longitud de onda de excitación adecuada del pre-fotointerruptor. Estado.

Una vez que se elige una celda, mueva la montura abatible hacia abajo para permitir que los láseres pasen al microscopio, cambie la torreta del filtro a la que contiene el espejo dicroico apropiado para la obtención de imágenes como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, proyecte esta imagen a la cámara para distinguir las células transfectadas de la fluorescencia de fondo y confirmar que las moléculas son fotovoltables. Ilumine brevemente la muestra con una potencia baja de menos de 10 microvatios del láser de activación.

A continuación, prepare el software de la cámara para la adquisición de series cinéticas ajustando el juego de multiplicación de electrones a 200 y el número deseado de fotogramas a entre cinco y 10.000. También establece la exposición entre 10 y 30 milisegundos. A continuación, bloquee el haz de activación, desbloquee el haz de lectura y proyecte la imagen de la célula iluminada en la cámara.

Elija un plano focal cerca de la membrana celular inferior desplazando el enfoque hacia abajo hasta que las moléculas individuales ya no sean visibles. Luego, mueva gradualmente el enfoque hacia arriba hasta que las moléculas se hagan visibles por primera vez. Ahora desbloquee el haz de activación e ilumine la muestra con menos de un vatio por centímetro cuadrado de intensidad.

Comience a adquirir estos datos a través del software de la cámara mientras mantiene una densidad de 0,1 a una molécula fotovoltable visible por micra cuadrada ajustando dinámicamente el filtro de densidad neutra frente al láser de activación. Para obtener imágenes de fluorescencia de reflexión interna total, monte el espejo cinco y la lente uno en una sola etapa de traslación que se moverá lateralmente justo detrás de la entrada al microscopio. A medida que se trasladan el espejo cinco y la lente uno, los láseres que salen del objetivo hacia arriba a través de la muestra se inclinarán gradualmente hacia un lado, continuarán trasladando la etapa hasta que el ángulo de los láseres alcance los 90 grados desde la vertical.

En este punto, el láser emergente se desvanecerá y el láser entrante volverá a reflejarse en la apertura viajando en paralelo al haz entrante y desplazado hacia un lado. Debería ver una reducción en el fondo cuando la muestra entra en fluorescencia de reflexión interna total al completar las adquisiciones de imágenes, cierre el obturador del microscopio inmediatamente y bloquee ambos haces. Desactiva la ganancia multiplicadora de electrones.

Configure la cámara para que grabe un fotograma y establezca la región de lectura de la cámara en su tamaño máximo. Finalmente, bloquee un canal colocando una tarjeta sobre Fa tres o Fa cuatro con un filtro de paso largo montado en la lámpara del microscopio. Ilumine la muestra y proyecte esta imagen en la cámara.

Grabe una instantánea de la célula para representar toda la célula en luz transmitida. Aquí se muestra un ejemplo de una adquisición de la palma F de dos colores de una célula NIH, tres T, tres que expresan tanto DENDRA dos hemaglutinina como PAM Cherry actina. El canal transmitido de la izquierda contiene longitudes de onda más largas que el canal reflejado de la derecha.

Aquí se muestran instantáneas de la misma adquisición F OM de dos colores siguiendo el fondo, la resta y la transformación para superponer los canales izquierdo y derecho. Las moléculas individuales pueden ser identificadas y localizadas. Algunas moléculas parecen más brillantes en el canal transmitido y otras tienen una distribución más uniforme de la emisión entre los dos canales.

Esto indica la diferencia en los espectros de emisión entre la cereza PAM y la DENDRA dos respectivamente y se utiliza en el análisis para identificar estas dos especies. El histograma que se muestra aquí indica una relación entre la intensidad del canal rojo transmitido dividida por la intensidad total para todas las moléculas localizadas después de que se hayan aplicado las tolerancias. Los píxeles aparecen en blanco en la imagen inferior izquierda y aparecen rojos en la imagen combinada final que se muestra en la parte inferior derecha, mientras que los de la región verde se muestran como blancos en la imagen superior derecha y aparecen verdes en la imagen combinada final que se muestra en la parte inferior derecha.

Los niveles de umbral que se eligen al renderizar afectan en gran medida al grado de ruido y a la apariencia de la colocalización. Mostrado. Aquí hay tres opciones diferentes para renderizar que dan como resultado diversos grados de sangrado a través de los niveles de umbral más conservadores que se muestran en los dos inferiores. Los histogramas alfa de la palma de la mano de color F son los mejores para interpretar cuando hay dos picos discernibles en la imagen.

Si bien el histograma de la izquierda es un buen candidato para un análisis más detallado, las imágenes resultantes de los otros dos histogramas serán mucho más difíciles de interpretar siguiendo este procedimiento. Métodos como la reflexión interna total, la microscopía y la obtención de imágenes de células vivas pueden realizarse para responder a preguntas adicionales como cómo se organizan las proteínas a nanoescala en las membranas de las células vivas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar su propio microscopio FAR y usarlo para adquirir datos.

No olvide que trabajar con láseres puede ser extremadamente peligroso, y se debe completar la capacitación en seguridad antes de intentar este procedimiento.