Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes Escherichia coli Y Vibrio cholerae

El objetivo general de este procedimiento es generar bacterias competentes de forma rápida y cómoda en el mismo día. Son necesarios para la transformación. Esto se logra primero colocando las bacterias en agar LB e incubándolas durante cuatro a seis horas.

A continuación, el césped bacteriano se cosecha cuidadosamente de la superficie del agar y el pellet se vuelve a suspender en agua fría estéril o tampón. A continuación, el pellet bacteriano se lava tres veces a cuatro grados centígrados y se vuelve a suspender en 40 microlitros. Finalmente, las células competentes se electroporan en presencia de ADN.

En definitiva, se pueden obtener resultados que muestran niveles de transformación bacteriana comparables a los obtenidos con el método tradicional que requiere un equipamiento considerable, grandes volúmenes de cultivos bacterianos y tampones estériles. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que las bacterias frescas y competentes se pueden preparar prácticamente a partir de cualquier cepa de laboratorio el mismo día en que se planifica la transformación sin la necesidad de grandes centrífugas, rotores o líderes de tampones y cultivos estériles. Por lo general, las personas nuevas en este método no tendrán mucho esfuerzo porque esto es solo una variación atajo de las técnicas comúnmente empleadas en los laboratorios de bacteriología. El originador de este protocolo no puede ser identificado, ya que ha sido utilizado y optimizado por numerosos investigadores a lo largo del tiempo.

El método presentado aquí se ha utilizado en nuestros laboratorios durante casi dos décadas, y nuestro objetivo es compartir este útil protocolo con nuestros colegas. La demostración visual de este método es importante para un paso. En particular, la recolección de bacterias del césped en la barrena porque se necesita un ojo experimentado para evaluar el crecimiento en el plato.

Y esto se visualiza mejor. Theresa Brooks, asistente de investigación del laboratorio del Dr. Te Koski en la Universidad de Alberta en Edmonton, Canadá, demuestra el procedimiento. Para comenzar la preparación del cultivo bacteriano a última hora de la tarde, utilice una pequeña cantidad de E. coli o v coray para inocular de uno a cinco mililitros de caldo LB de autoclave en tubos de ensayo estériles de vidrio de silicato bo.

Coloque los tubos de ensayo inoculados en un tambor de rodillo e incube durante la noche a 37 grados centígrados y a alta velocidad. Prepare un esparcidor de células en forma de palo de hockey con una varilla de vidrio calentando el centro de la varilla en la llama de un mechero bunsen hasta que el vidrio se ablande. Luego use pinzas o alicates para dirigir suavemente la curva en un ángulo de 135 grados.

Calienta la varilla una vez más en el punto medio entre el extremo y la primera curva y dóblala en un ángulo de 45 grados hacia adentro. Prepare lb aireados con y sin antibióticos y almacene a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente.

Coloque 100 microlitros de cultivo durante la noche en cada placa de agar LB. Con el esparcidor de células, incube la placa a 37 grados centígrados durante cuatro a seis horas o hasta que se haga visible un césped delgado de crecimiento bacteriano. Utilizando un asa de inoculación, coseche una masa bacteriana de unos dos milímetros de diámetro de la placa y vuelva a suspenderla en un mililitro de hielo frío.

Cloruro de calcio de dos milimolares. Si utiliza agua estéril doblemente destilada para E. coli utilizando una centrífuga refrigerada ajustada a cuatro grados centígrados, centrifugar la suspensión durante cinco minutos a 5.000 Gs. Deseche el sobrenadante y repita el lavado dos veces más. Después de eliminar el sobrenadante final, suspenda el pellet en 40 microlitros de cloruro de calcio o agua doblemente destilada y manténgalo en hielo.

Para llevar a cabo una transformación, agregue hasta un microgramo de ADN plasmático a la suspensión bacteriana de 40 microlitros y transfiera la mezcla a un espacio estéril preenfriado de 0,2 centímetros. Vete, inserte el vete en la cámara de electroporación del módulo de control de pulso y coma a 1,8 kilovoltios y 25 micro phs. La constante de tiempo debe ser de unos 5,0 milisegundos y no debe producirse ningún arco.

Vuelva a suspender rápidamente las células en un mililitro de caldo LB y transfiéralas a un tubo de ensayo de vidrio para asar previamente esterilizado en autoclave. Permita que las células se recuperen incubando en condiciones de crecimiento aireadas a 37 grados centígrados durante 30 minutos sin selección de antibióticos. Coloque las bacterias en placas de LB ager con antibiótico e incube a 37 grados centígrados durante la noche.

Como se muestra aquí, llevamos a cabo un conjunto de transformaciones con E. coli y V co array para comparar la eficiencia de transformación de nuestra metodología rápida con una adaptación del método tradicional originalmente descrito por doer et al para la preparación de bacterias electrocompetentes. El rendimiento de transformante estuvo dentro del rango de 10 de la sexta a 10 de la séptima UFC por microgramo de ADN en tres experimentos replicados para E. coli y v coray. Utilizando el método tradicional para la electrocompetencia.

En la preparación de las células, el rendimiento de transformantes apareció disminuido diez veces a 10, a la quinta, a 10 a la sexta UFC por microgramo de ADN en tres experimentos replicados para e. coli y v coray utilizando el método rápido. Por esta razón, determinamos el porcentaje de bacterias transformadas dividiendo las UFC transformadas por el número de UFC recuperadas de transformaciones simuladas de lotes idénticos de células competentes. El porcentaje de bacterias transformadas estuvo dentro de un logaritmo.

Independientemente del método de preparación y de las especies transformadas. Estos resultados sugieren que la eficiencia del método rápido es comparable a la del procedimiento tradicional más largo de preparación de células competentes, y que las cepas representativas de ieo, coray y esia coli son igualmente susceptibles al procedimiento rápido. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco o seis horas, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar recolectar las bacterias durante su fase logarítmica de crecimiento, lavarlas en una solución de agua tampón estéril, recién preparada y preenfriada y mantenerlas frías hasta que se resuspendan en LB después de la electroporación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar rápidamente células específicas de cepas bacterianas electrocompetentes en su laboratorio cultivándolas en césped inaugural, recolectándolas durante la fase logarítmica de crecimiento y luego lavándolas en tampón frío en preparación para la electroporación.