Name: Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes Escherichia coli Y Vibrio cholerae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a preparar células electrocompetentes de Escherichia coli y Vibrio cholerae en 5-6 horas. Este protocolo rápido optimiza la transformación bacteriana con eficiencias comparables a métodos tradicionales.

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Los autores agradecen a sus colegas y al personal de los laboratorios actuales y pasados ​​que han apoyado el desarrollo de esta técnica. El laboratorio de SP es apoyado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud de subvención de funcionamiento MOP-84473 y Alberta Soluciones Innova-Salud (financiado por la Fundación Alberta Heritage Endowment Fund para la Investigación Médica). DP fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones MD001091-01 y GM068855-02.

1. Preparación de los cultivos bacterianos, Herramientas y Reactivos (DAY 1, Tarde) <ol><li> Por la tarde, inocular 1-5 ml de caldo LB en autoclave estéril (por ejemplo, 100 x 13 mm) tubos de ensayo de vidrio de borosilicato con una pequeña alícuota de bacterias (E. coli o V. cholerae). </li><li> Ajuste los tubos de ensayo inoculados en un tambor de rodillo ubicado a 37 ° C de temperatura (ambiente caliente o incubadora), girar en el tambor de rodillos a alta velocidad, y se incuban O / N. </li><li> Preparar un esparcidor de células en la forma de un &quot;palo de hockey&quot; de una varilla de vidrio calentando el medio de la varilla en la llama de un mechero Bunsen hasta que el vidrio se ablanda y después dirigir la curva suavemente con pinzas o alicates en un ángulo de 135 ° . Calentar la varilla una vez más en el punto medio entre el extremo y la primera curva y se dobla en un ángulo de 45 ° hacia el interior (en la dirección opuesta de la primera curva). </li><li> Preparar LB-agar sin antibióticos y se vierte en placas de Petri en la preparación de laprotocolo electrocompetence y LB-agar placas que contienen el antibiótico apropiado (de acuerdo con el marcador de resistencia del vector a por electroporación) y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Preparar un filtro esterilizado 2 mM de CaCl2 solución para V. cholerae, o ddH autoclave de 2 O para E. coli, y se almacena a 4 ° C. </li></ol> 2. El crecimiento de bacterias electrocompetentes (DIA 2, por la mañana) <ol><li> Entregar 100 l de cultivo bacteriano O / N en cada placa de agar LB, stocks de glicerol congelado también se pueden utilizar y entregados directamente en el plato. </li><li> Sumerja el hockey en forma de barra de tamo celular en 100% de EtOH, escurrir brevemente y quemar el resto de EtOH para esterilizarlo antes de su uso y difusión. Difundir el cultivo bacteriano 100 l O / N en forma pareja con el esparcidor celda de vidrio estéril con cuidado de no romper (ruptura) de la superficie del agar. </li><li> Incubar la placa a 37 º C durante 4-6 horas, o hasta que un césped fino del crecimiento bacteriano seaviene distinguibles. Las células son más competentes en crecimiento activo. </li></ol> 3. Preparación de las células electrocompetentes bacterianas (DIA 2, por la tarde) <ol><li> Recoger las bacterias con un asa de inoculación estéril asegurándose de no perforar o romper la superficie del agar. Una masa bacteriana 2 mm de diámetro es suficiente para una sola transformación. Típicamente, esto requiere el raspado de la superficie del césped delgado con el asa de inoculación de dos o tres veces. Varias muestras (normalmente entre 4-6) se podrán recoger en la misma placa. </li><li> Resuspender la masa bacteriana en 1 ml de helado 2 mM CaCl 2 (por V. cholerae) o estéril ddH2O (para E. coli) y mezclar bien hasta que no queden grumos son visibles, mantener en hielo. </li><li> Centrifugar cada suspensión bacteriana durante 5 min a 5.000 xg en una microcentrífuga refrigerada ajustado a 4 ° C, o en una microcentrífuga almacenado en una habitación fría ajustado a 4 º C. </li><li> Desechar el sobrenadante, resuspterminar el sedimento bacteriano en el mismo volumen de helado 2 mM CaCl 2 o estéril ddH2O, y repetir la etapa de centrifugación como se ha hecho antes dos veces más para un total de tres lavados. </li><li> Aspirar el sobrenadante, resuspender, y luego aflojar el sedimento bacteriano a fondo en 40 l helada 2 mM CaCl 2 o estéril ddH2O y mantener en hielo. </li></ol> 4. Transformación de bacterias electrocompetentes (DIA 2, por la tarde) <ol><li> Agregue hasta 1 g de ADN plásmido (en hasta un 1 l de agua o tampón Tris-EDTA) a la suspensión bacteriana 40 ly transferir esta mezcla en un pre-enfriado, estéril cubeta brecha de 0,2 cm. La concentración de sal en la muestra de ADN debe ser bajo una, ya que contribuirá a la formación de arco del pulso en el paso siguiente. </li><li> Inserte la cubeta en la cámara de electroporación del módulo de control de impulsos, y electroporar 1,8 kV, 25 mF. La constante de tiempo debe ser ~ 5,0 mseg, y sin formación de arco debe ocurrir. </li><li> Recuperar rápidamente la suspensión celular mediante resuspensión en 1 ml de caldo LB y transferir en el tubo de ensayo de vidrio de borosilicato previamente esterilizado en autoclave. </li><li> Permitir que las células se recuperan mediante la incubación en condiciones de crecimiento gaseosas (en un tambor de rodillo) a 37 ° C durante 30 min sin selección de antibióticos. </li><li> Placa de las bacterias sobre las placas de agar LB preparados previamente en la presencia del agente selectivo apropiado (antibióticos), y se incuba a 37 ° CO / N. Si las bacterias se transforman con una alta concentración de vector purificado (0,1-1 g de plásmido superenrollado), entregar 10 l de cultivo bacteriano en el borde de la placa de agar LB y con una racha de asa de inoculación estéril para colonias aisladas utilizando el método racha de cuadrante. Si una mezcla de ligación se transformó, entregar 100 l de cultivo bacteriano en cada placa de agar y distribuida uniformemente con el esparcidor celda de vidrio esterilizado. </li></ol> a Si la constante de tiempo es corto (serbaja 3,5 ms), o pulsante conduce a la formación de arco, y luego volver a precipitar la muestra de ADN, se lava con EtOH al 70% dos veces para eliminar las sales antes del secado y resuspensión en tampón TE.

<ol><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
<li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).</li>
<li>Taketo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+Escherichia+coli+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of Escherichia coli by electroporation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).</li>
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<li>Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Vibrio+parahaemolyticus%2C+Vibrio+alginolyticus%2C+and+Vibrio+cholerae+non+O-1+with+plasmid+DNA+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation.</a> Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).</li>
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<li>Allen, S. P., Blaschek, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-induced+transformation+of+intact+cells+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).</li>
<li>Belliveau, B. H., Trevors, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Bacillus+cereus+vegetative+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).</li>
<li>Chassy, B. M., Flickinger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Lactobacillus+casei+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transformation of Lactobacillus casei by electroporation.</a> FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).</li>
<li>Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+electroporation+and+cloning+vector+system+for+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).</li>
<li>Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+coenzyme+M-auxotrophic+mutant+and+transformation+by+electroporation+in+Methanococcus+voltae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae.</a> J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).</li>
<li>Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+particle+SSV1+from+the+extremely+thermophilic+archaeon+Sulfolobus+is+a+virus%3A+demonstration+of+infectivity+and+of+transfection+with+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).</li>
<li>Aune, T. E., Aachmann, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+to+increase+the+transformation+efficiencies+and+the+range+of+bacteria+that+can+be+transformed%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> J. Mol. Biol. 166, 557(1983).</li>
<li>Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+Type+VI+Secretion+System+Expression+Gives+Vibrio+cholerae+Intra-+and+Interspecific+Competitive+Advantages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages.</a> PLoS One. 7 (10), e48320(2012).</li>
</ol>

No hay revelaciones son aplicables.

Eficacia de la transformación está sujeto a una variedad de factores, independientemente del método empleado para preparar células competentes. Las variables análogas se aplican a este método; gran se debe tener cuidado de que una vez que las células se recogen de la placa de agar de tal manera que se mantienen a temperatura fría constante (no superior a 4 ° C). El césped bacteriano debe estar creciendo activamente en el momento de la recogida; células deben estar en mitad de la fase logarítmica de crecimiento. Calidad de ADN (es decir, la contaminación de sales) influye en la eficiencia de transformación. Específicamente, cuando se emplea este método, el agar no debe ser roto como fragmentos de agar en la cubeta causarán la formación de arco del pulso. La mayoría de los problemas encontrados con esta técnica se asocian a dos cuestiones; recoger las bacterias durante la ventana de tiempo apropiado de la placa de agar cuando están creciendo activamente. Su recogida demasiado pronto dará el número de células suficientes y hará que elraspado de la placa de agar LB frustrante porque el &quot;pellicule&quot; que forman es difícil de levantar la superficie de la placa. Recogida de bacterias demasiado tarde disminuirán drásticamente su competencia. La ventana de tiempo, naturalmente, variar dependiendo de la densidad del inóculo se sembraron en las placas de agar LB. El segundo paso crítico es mantener a las bacterias en frío (4 ° C) desde el momento en que se levantan frente a la placa de agar y se resuspendieron en CaCl2 o ddH2O hasta que se sembraron en agar LB siguiente transformación. Los tubos de microcentrífuga que contiene las bacterias, las cubetas y tampón deben ser pre-enfriado y se mantuvieron en hielo en todo momento hasta que se sembraron las bacterias. Sin embargo, pueden surgir problemas adicionales cuando la estéril ddH2O o CaCl2 contienen precipitado o están contaminados. Por este motivo, se recomienda la preparación de este reactivo fresco. Solución de problemas de la transformación se facilita mediante la inclusión de los controles cuando la transformación de bacteria rindió competente por cualquier método. Un control negativo que consiste en un lote de bacterias competentes no transformadas sembradas en placas sobre una placa de agar LB que contiene el marcador selectivo ayudará rápidamente determinar si el antibiótico en la placa es eficaz. Una transformación control positivo con una preparación de plásmido de buena calidad y cantidad que alberga el mismo marcador selectivo que la muestra experimental conocida será útil para determinar si las bacterias son competentes sino también si el ADN experimental transformado era suficiente en cantidad o calidad. Las ventajas de esta técnica son múltiples; el método se puede llevar a cabo en el mismo día en que se prevé una transformación para. Hemos encontrado que los congelados en glicerol bacteriana se puede recubrir directamente sobre el agar LB sin ninguna pérdida en electrocompetence, hemos hecho esto en situaciones de &quot;emergencia&quot; (después de olvidar para iniciar el cultivo de la noche del día anterior). Aunque no hemos podido probar emuy cepa conocida, cualquier E. coli o V. cepa cholerae que se puede transformar por electroporación ha sido susceptible a este protocolo en nuestras manos. La técnica es rápida, eficaz, y produce eficacias de transformación comparables a los obtenidos a partir de la preparación de bacterias electrocompetentes que emplean métodos tradicionales. El método elimina la necesidad de centrífuga de alta velocidad y rotores asociados, un agitador incubador orbital y cubos centrífuga estériles (contenedores), y grandes volúmenes de tampón en autoclave. Aunque la tabla de reactivos y equipos específicos es bastante completo, la mayoría de los laboratorios que llevan a cabo la electroporación tendrán la mayoría, si no todos, de estos materiales ya disponibles. Tal vez lo más importante, la técnica se puede aplicar fácilmente para generar cepas electrocompetent específicos para su laboratorio con antecedentes mutantes rápidamente. No tenemos conocimiento de cualquier limitación de esta técnica, ya que ha sustituido el método tradicional de preparación de eleccionestrocompetent bacterias en nuestros laboratorios. Los resultados de nuestros experimentos que se muestran aquí se llevaron a cabo con células electrocompetentes frescos producidos con el método tradicional que se había almacenado a -80 ° C durante no más de 1 semana. Sin embargo, las existencias congeladas de células electrocompetentes pierden competencia y la viabilidad o durante períodos prolongados de almacenamiento. Nuestro protocolo abreviado válido para la preparación de las células electrocompetentes frescas el mismo día de la transformación está previsto y sin preocupaciones acerca de la edad de la población que puede resultar en un rendimiento transformante disminuido. No hemos intentado almacenar células electrocompetentes producidos mediante el método rápido para su uso en otro día, ya que no ha sido necesario. Aunque no se muestra aquí, la eficiencia de las células electrocompetentes preparó usando nuestro método rápido es suficiente para mezclas de ligación. Las transformaciones se aplicaba la no-O1 V. cholerae en un reciente artículo de Unterweger et al.17 se llevaron a cabo usando bacterias electrocompetentes preparadas por el método descrito aquí (excepto las llevadas a cabo por conjugación). Esta técnica permite a los investigadores a transformar las cepas mutantes antecedentes con rapidez y eficacia sin tener que preparar grandes cantidades de células. Este rápido método de preparación de bacterias electrocompetentes podría adaptarse a otros procariotas que han demostrado ser susceptibles de electroporación como el principio de la preparación y la configuración de electroporación van a ser las mismas que las de los protocolos tradicionales.

Desde su &#39;creación en la década de 1980 1, la electroporación se ha convertido en una técnica de biología molecular integral, probablemente el método más común única empleada para transformar células vivas / transfectar con ácidos nucleicos circulares o lineales. Originalmente desarrollado para la transfección de células eucariotas 1, electroporación se adaptó posteriormente para la transformación de E. coli 2, 3. En la bacteriología, la electroporación se ha convertido en el estándar de laboratorio y se ha modificado para transformar una amplia gama de bacterias Gram-negativas, incluyendo Pseudomonas 4, Salmonella 5, vibriones 6, Serratiae, y Shigella 7; clostridios Gram-positivas 8, 9 Bacilos, Lactobacilos 10 y Enterococos 11. Incluso algunas arqueobacterias han demostrado ser susceptibles a la transformación por electroporación, incluyendo Methanococci </em&gt; 12 y especies Sulfolobus 13. Para una revisión completa consulte Aune y Aachmann 14. Eficiencia de la transformación por electroporación se informa, 10-20 veces superior a la competencia de productos químicos o de choque térmico 2. Sin embargo, al igual que la preparación de las bacterias de la competencia química optimizada por Douglas Hanahan en el 1980 15, las células deben también estar preparado para ser electrocompetent. La electroporación es un medio rápido y eficaz de la transformación bacteriana, lo que requiere bacterias electrocompetentes, ADN purificado, un módulo de control de impulsos que proporciona el impulso eléctrico, y una cámara que se adapta a las pequeñas cubetas desechables que funcionan como un electrodo. Brevemente, las bacterias competentes frías, se mezclan con el ADN plásmido, se somete a un pulso de alto voltaje en una cubeta, se resuspendieron en medio de crecimiento, se incubaron a 30-37 ° C durante 30-45 minutos, y luego sembraron en placas de medio semisólido (agar nutritivo placas) con el aproxopriate antibiótico selectivo. En contraste con la etapa de pulsación, la preparación de electrocompetentes E. coli sigue siendo un procedimiento de varias partes que se lleva a cabo tradicionalmente en grandes volúmenes. Brevemente, un cultivo de una noche de bacterias se inoculó en un matraz Erlenmeyer con 100 ml a 1 L de caldo de Luria (LB), que se cultiva a mediados de la fase logarítmica de crecimiento (DO 600 de &lt;1,0), y se sometieron a lavados en serie con un no estéril iónico tampón o agua doblemente destilada (ddH2O) en la disminución de los volúmenes a 4 ° C. Gran se debe tener cuidado para mantener las células en frío durante todo el procedimiento y evitar la contaminación. Esto requiere el uso de cubos de centrifugación en autoclave y tampones no iónicos o ddH2O, una incubadora agitador orbital, una de alta velocidad centrífuga refrigerada de gran capacidad y un conjunto de rotores. Las bacterias se resuspendieron finalmente en un pequeño volumen de tampón suplementado con 10% de glicerol y alícuotas en ~ 40 volúmenes mu l, WHICH se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Almacenamiento a baja temperatura da lugar a menudo en las eficacias de transformación disminuido debido a la pérdida de viabilidad en el tiempo. Células bacterianas electrocompetentes también están disponibles de una variedad de fuentes comerciales, pero sólo para un número limitado de (a menudo recombinación deficiente) E. cepas de E. coli emplean comúnmente como anfitriones para propagar una amplia gama de plásmidos. Como resultado de ello los investigadores se basan en métodos internos para preparar sus propias cepas / mutantes para la transformación. Una alternativa, protocolo rápido y eficiente para la preparación de electrocompetentes E. coli ha estado en uso por algunos laboratorios de bacteriología molecular desde hace algún tiempo y se ha extendido a las bacterias Gram-negativas adicionales, en nuestro caso V. cholerae. El originador del protocolo no puede ser identificado como se ha optimizado por otros investigadores en el tiempo. El método que aquí se presenta ha sido utilizado en nuestro laboratorio ins de casi dos décadas, y nuestra meta es compartir este protocolo útil con nuestros pares.

<table><tbody><tr><td>Módulo Gene Pulsador</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2668</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de Cubeta Gene Pulsador</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2669</td><td></td></tr><tr><td>Electrocubetas (0,2 cm de espacio)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2082</td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm Pyrex Tubos de cultivo sin montura </td><td>Corning</td><td>70820-13</td><td></td></tr><tr><td>Cierres de tubo de cultivo de 13 mm </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04500-00</td><td></td></tr><tr><td>6 x Varilla de vidrio de 250 mm</td><td>Lab Source</td><td>11381D</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de motor de tambor de rodillos</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-4004</td><td></td></tr><tr><td>Tambor de rodillos para tubos de cultivo de 13 x 100 mm</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1053-0306</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma Chemicals</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Etanol anhidro/desnaturalizado</td><td>Sigma Chemicals</td><td>227649</td><td></td></tr><tr><td>Circuito de inoculación</td><td>Decon Labs</td><td>MP182-5</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada 5451 R</td><td>Eppendorf</td><td>22621425</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen</td><td>Burner Fisher Scientific</td><td>03-917Q</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo MILLER</td><td>EMD</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriológico</td><td>Fisher Científico</td><td>S25127</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; escherichia coli</em&gt; y<em&gt; vibrio cholerae</em

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

La electroporación se ha convertido en un método ampliamente utilizado para la rápida y eficiente la introducción de ADN extraño en una amplia gama de células. Electrotransformación ha convertido en el método de elección para la introducción de ADN en procariotas que no son naturalmente competente. La electroporación es un método de transformación rápida, eficiente, y optimizada que, además de ADN purificado y bacterias competentes, requiere disponibles comercialmente controlador de pulso gen y cubetas. En contraste con la etapa de pulsación, la preparación de células electrocompetentes es mucho tiempo y mano de obra intensiva que implica repetidas rondas de centrifugación y lavados en la disminución de los volúmenes de agua fría y estéril, o tampones no iónicos de grandes volúmenes de cultivos desarrollados a mediados de la fase logarítmica de crecimiento. Tiempo y esfuerzo se pueden ahorrar mediante la compra de las células electrocompetentes de fuentes comerciales, pero la selección se limita a empleados comúnmente E. cepas de laboratorio coli. Presentamos por medio de difusión de un rápido ymétodo eficiente para la preparación de electrocompetentes E. coli, que ha estado en uso por los laboratorios de bacteriología desde hace algún tiempo, se puede adaptar a V. cholerae y otros procariotas. Si bien no podemos determinar quien al crédito para el desarrollo de la técnica original, se nos presente, poniéndolo a disposición de la comunidad científica.

Hemos llevado a cabo una serie de transformaciones con E. coli y V. cholerae para comparar la eficiencia de transformación de nuestra metodología rápida con una adaptación del método (tradicional) originalmente descrito por Dower et al. 2 para la preparación de bacterias electrocompetentes. Para llevar a cabo la preparación tradicional de las células competentes, 500 ml de LB en un matraz Erlenmeyer de 2 L-se inocularon con 500 l cultivo de una noche de E. coli DH5a o V. cholerae O395, se incubaron en un agitador orbital (215 rpm a 37 ° C) y se recogieron a una DO de 600 de entre 0,5-1,0. El matraz se enfrió en hielo y los cultivos se centrifugó en un rotor enfriado previamente a 4.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Los sedimentos celulares se resuspendieron cuidadosamente en 500 ml de hielo frío-2 mM CaCl 2 para V. cholerae y ddH2O para E. coli, y se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones. Rondas posteriores de una resuspensiónd centrifugación se llevaron a cabo en la disminución de los volúmenes de 200 y 100 ml volúmenes asegurándose de que la cultura se mantuvo refrigerada a 4 ° C. Por último, una resuspensión y centrifugación en un volumen de 10 ml se llevó a cabo con 10% de glicerol. El sedimento final se resuspendió en 2 ml de 10% de glicerol y 40 ml de alícuotas se congelaron a -80 ° C y ya no se almacena de una semana antes de la electroporación. Las condiciones de electroporación incluida la configuración de impulsos y el tamaño de la cubeta fueron idénticas para ambas especies bacterianas en todas las electroporaciones independientemente del método de preparación de células competentes. La única diferencia fue que se llevó a cabo los lavados en frío ddH 2 O de E. coli y frío mM CaCl 2 para V. 2 . cholerae Tabla 1 muestra los resultados de bacterias transformadas por electroporación idénticamente pero se hacen competentes ya sea con el protocolo rápido o con el método tradicional. Empleamos O395 cepa DH5a y tan comúnutilizados Ly, cepas representativas de V. cholerae y E. coli, respectivamente; resultados similares se pueden obtener con otras cepas de la misma especie (aunque no todos de una sola cepa ha sido probado) y es probable que adaptarse a otras bacterias Gram-negativas y probablemente más allá. Para asegurar que el número de células iguales estaban presentes en cada lote pulsada, bacterias electrocompetentes generados utilizando el método rápido se agruparon en el ordeño, mezclan, mantienen suspendidas homogéneamente, y tomaron alícuotas en 40 volúmenes mu l, poco antes de la electroporación. Bacterias Electrocompetent generadas utilizan el método tradicional fueron tratados de manera similar antes de la congelación en 40 ml de alícuotas. Después de la entrega del pulso, cada lote de 40 l de bacterias por electroporación se suspendió en 400 l de LB y se diluyeron en serie 1:10. Cien microlitros de cada dilución se colocaron en placas en agar LB en presencia de 100 mg / ml de ampicilina y se extendió usando un esparcidor de vidrio estéril de célulasy se incubaron a 37 ° C durante la noche. Para cuantificar el número total de bacterias empleadas en cada transformación, 40 volúmenes mu l de bacterias electrocompetentes de cada lote preparado se diluyeron en serie, y se sembraron en agar LB sin antibióticos de forma idéntica en paralelo. Una alícuota de bacterias tratadas igualmente de cada lote se sometió a electroporación con 1 l de Tris-EDTA (TE) tampón pero sin ADN (transformación simulacro), diluido en serie y se sembraron en agar LB sin antibióticos para estimar el número de células perdidas por la entrega de la pulso eléctrico. Por último, una variación adicional para el experimento se llevó a cabo para determinar si los 30 min incubaciones a 37 ° C en 1 ml de LB después de la electroporación, pero antes de placas en LB-agar afectarían a la recuperación de las células transformadas. unidades formadoras de colonias (UFC) se enumeraron al día siguiente. Para este experimento se emplearon pUC18, un plásmido de laboratorio común, y lotes de bacterias competentes que consiste de unproximadamente 10 8 UFC de células preparan utilizando el método tradicional y 10 7 UFC de células preparadas utilizando el protocolo rápido. La electroporación solo (sin ADN) redujo las UFC viables por 10-100 veces independientemente del método utilizado para preparar las células electrocompetentes. Como se muestra en la Tabla 1, el rendimiento transformante era dentro de la 10 6 -10 7 UFC / g de gama ADN en tres experimentos duplicados (desviaciones estándar entre paréntesis) para E. coli (DH5a) y V. cholerae (O395), respectivamente, utilizando el método tradicional, más largo para la preparación de células electrocompetentes. Rendimiento transformante apareció disminuido 10 veces a 10 5 -10 6 UFC / g de ADN en tres experimentos duplicados (desviación estándar entre paréntesis) para E. coli y V. cholerae, respectivamente, utilizando el método rápido. Por esta razón se determinó el porcentaje de bacterias transformadas dividiendo UFC transformadaspor el número de CFUs se recuperó de &quot;transformaciones simulacros&quot; (sin plásmido) de lotes de otro modo idénticas de células competentes. El porcentaje de bacterias transformadas se encontraba dentro de un registro (02.05 a 09.04%), independientemente del método de preparación y las especies transformadas (Tabla 1 Los números entre corchetes). Estos resultados sugieren que la eficacia del método rápido es comparable a la del procedimiento tradicional más largo de la preparación de células competentes y que las cepas representativas de Vibrio cholerae y Escherichia coli son igualmente susceptibles al procedimiento rápido. Se encontró que la eficiencia de transformación, para los plásmidos pUC18 como portadores de casetes β-lactamasa, no se ve afectado por el tiempo de recuperación de 30 minutos en caldo LB. El mismo número de transformantes fue recuperado si las células se colocaron en placas de agar LB que en presencia de ampicilina directamente, después de la electroporación, o si se les permitió un tiempo de recuperación de 30-45 minen caldo LB a 37 ° C antes de chapado. Nuestros resultados que resistencia a la ampicilina no requiere derivación en condiciones no selectivas sugiere que la expresión de β-lactamasa se ​​produce con suficiente rapidez después de la transformación. Sin embargo, cabe señalar que hemos llevado a cabo diluciones en serie de bacterias de impulsos en caldo LB, que puede haber contribuido a la recuperación de la descarga eléctrica e iniciar la expresión génica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50684/50684fig1.jpg" /> Figura 1. Representación gráfica de la metodología para la preparación rápida de bacterias electrocompetentes. Después de 4-6 horas (dependiendo de la densidad de los inóculos) un número suficiente de bacterias se pueden recoger para llevar a cabo cinco y cincuenta y seis transformaciones de una sola placa de agar LB. Para asegurar igual número de células competentes para cada volumen final que se electroporación, las bacterias recogidas de la placa de agar LB se agruparon inicialmente juntos y se lavaron a continuación coliquoted en 40 volúmenes mu l, dependiendo del tamaño de la pastilla (gránulos más grandes se diluyeron en volúmenes más grandes divisibles por 40 l). <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Número de ADN transformantes / mg resistentes a la ampicilina (transformantes resistentes a la ampicilina se recuperaron [%]) </td></tr><tr><td> Tensión </td><td> Método tradicional </td><td> Método rápido </td></tr><tr><td> De E. coli (DH5a) </td><td> 2.3 x 10 6 (± 7,3 x 10 5) [9.4%] </td><td> 3 x 10 6 (± 7,1 x 10 5) [2.5%] </td></tr><tr><td> V. cholerae (O395) </td><td> 4 x 10 7 (± 1,7 x 10 7) [5%] </td><td> 6.7 x 10 5 (± 2,1 x 10 5) [3.3%] </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Eficacia de la transformación por microgramo de ADN (pUC18) de electrocompetentes Bacteria preparado por el método tradicional en comparación con el método rápido. Todas las transformaciones se llevaron a cabo con 500 ng de DNA de pUC18 (~ ADN superenrollado 80% como se visualiza por electroforesis en gel de 1% de agarosa) y las células sometidas a electroporación se diluyeron en serie de 10 veces en caldo LB antes de chapado de UFC en LB-agar con antibióticos. Controles de bacterias no electroporación y de bacterias por electroporación sin plásmido, se diluyeron en serie y se sembraron en agar LB sin antibióticos se llevaron a cabo para cada conjunto de transformaciones para determinar el número total de bacterias viables antes y después del pulso. Los controles electroporadas representadas la línea de base para el porcentaje de bacterias viables transformados con éxito.

La electroporación es un método comúnmente empleado para introducir el ADN en las bacterias en un proceso conocido como transformación. Los protocolos tradicionales para la preparación de células electrocompetentes son mucho tiempo y mano de obra intensiva. Este artículo describe un suplente, rápida, y eficiente método para la preparación de células electrocompetentes actualmente empleados por algunos laboratorios.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

El objetivo general de este procedimiento es generar bacterias competentes de forma rápida y conveniente el mismo día. Estas son necesarias para la transformación. Esto se logra primero sembrando las bacterias en agar LB e incubándolas durante cuatro a seis horas.A continuación, se cosecha cuidadosamente el césped bacteriano de la superficie del agar y el precipitado se resuspende en agua fría estéril o tampón. Luego, el precipitado bacteriano se lava tres veces a cuatro grados Celsius y se resuspende en 40 microlitros. Finalmente, las células competentes se electro poran en presencia de ADN.Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran niveles de transformación bacteriana comparables a los obtenidos mediante el método tradicional, que requiere equipo considerable, grandes volúmenes de cultivos bacterianos y tampones estériles. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que bacterias competentes frescas pueden prepararse prácticamente a partir de cualquier cepa de laboratorio el mismo día en que se planea la transformación, sin necesidad de centrífugas grandes, rotores ni grandes cantidades de tampones y cultivos estériles. En general, las personas nuevas en este método no tendrán muchas dificultades, ya que se trata simplemente de una variación abreviada de técnicas comúnmente empleadas en laboratorios de bacteriología. No puede identificarse al creador de este protocolo, ya que ha sido utilizado y optimizado por numerosos investigadores a lo largo del tiempo.El método presentado aquí ha sido utilizado en nuestros laboratorios durante casi dos décadas, y nuestro objetivo es compartir este protocolo útil con nuestros colegas. La demostración visual de este método es importante para un paso en particular: en concreto, la recolección de bacterias del césped en el tornillo sinfín, ya que se requiere un ojo experimentado para evaluar el crecimiento en la placa.Y esto se visualiza mejor. La Sra. Theresa Brooks, asistente de investigación del laboratorio del Dr. Te Koski en la Universidad de Alberta en Edmonton, Canadá, demuestra el procedimiento. Para comenzar la preparación del cultivo bacteriano en la tarde, use una pequeña cantidad de E. coli o V. coray para inocular de uno a cinco mililitros de caldo LB autoclavado en tubos de ensayo estériles de vidrio de borosilicato.Coloque los tubos de ensayo inoculados en un tambor rotatorio e incube durante la noche a 37 grados Celsius y alta velocidad. Prepare un aplicador celular con forma de palo de hockey a partir de una varilla de vidrio calentando la parte media de la varilla en la llama de un mechero Bunsen hasta que el vidrio se ablande. Luego, use pinzas o alicates para doblar suavemente el ángulo hasta 135 grados.Caliente la varilla una vez más en el punto medio entre el extremo y la primera curva, y dóblela en un ángulo de 45 grados hacia adentro. Prepare caldo lb con y sin antibióticos y almacénelo a cuatro grados Celsius. A la mañana siguiente.Plaque 100 microlitros de cultivo de crecimiento nocturno en cada placa de agar LB. Con la espátula de reparto, incube la placa a 37 grados Celsius durante cuatro a seis horas o hasta que sea visible un crecimiento bacteriano en forma de césped delgado. Con un asa de inoculación, recolecte una masa bacteriana de aproximadamente dos milímetros de diámetro de la placa y resuspenda en un mililitro de agua helada.Cloruro de calcio a dos milimoles. Si se utiliza agua doblemente destilada estéril para E. coli, utilizando una centrífuga refrigerada ajustada a cuatro grados Celsius, centrifugar la suspensión durante cinco minutos a 5.000 G. Desechar el sobrenadante y repetir el lavado dos veces más. Después de eliminar el sobrenadante final, suspender el precipitado en 40 microlitros de cloruro de calcio o agua doblemente destilada y mantenerlo en hielo.Para llevar a cabo una transformación, agregue hasta un microgramo de ADN plasmídico a la suspensión bacteriana de 40 microlitros y transfiera la mezcla a una celda estéril de 0,2 centímetros previamente enfriada. Coloque la celda en la cámara de electroporación del módulo de control de pulsos y aplique un choque eléctrico de 1,8 kilovoltios y 25 microsegundos. La constante de tiempo debe ser aproximadamente 5,0 milisegundos y no debe ocurrir arco eléctrico.Resuspenda rápidamente las células en un mililitro de caldo LB y transfiera a un tubo de ensayo de vidrio previamente esterilizado en autoclave. Permita que las células se recuperen incubándolas en condiciones de crecimiento aeróbicas a 37 grados Celsius durante 30 minutos sin selección con antibiótico. Siembre las bacterias en placas de agar LB con antibiótico e incube a 37 grados Celsius durante la noche.Como se muestra aquí, realizamos un conjunto de transformaciones con E. coli y V. corray para comparar la eficiencia de transformación de nuestra metodología rápida con una adaptación del método tradicional descrito originalmente por Döer et al. para la preparación de bacterias electrocompetentes. El rendimiento de transformantes estuvo dentro del rango de 10⁶ a 10⁷ UFC por microgramo de ADN en tres experimentos independientes para E. coli y V. corray, utilizando el método tradicional para la electrocompetencia.En la preparación de células, el rendimiento de transformantes disminuyó diez veces, de 10 a la quinta a 10 a la sexta UFC por microgramo de ADN en tres experimentos replicados para E. coli y V. coray utilizando el método rápido. Por esta razón, determinamos el porcentaje de bacterias transformadas dividiendo las UFC transformadas entre el número de UFC recuperadas de transformaciones simuladas a partir de lotes de células competentes de otro modo idénticos. El porcentaje de bacterias transformadas estuvo dentro de un orden de magnitud.Independientemente del método de preparación y de la especie transformada. Estos resultados sugieren que la eficiencia del método rápido es comparable a la del procedimiento tradicional más prolongado para la preparación de células competentes, y que las cepas representativas de ieo, coray y esia coli son igualmente susceptibles al procedimiento rápido. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco a seis horas, si se realiza adecuadamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar cosechar las bacterias durante su fase logarítmica de crecimiento, lavarlas en una solución estéril de agua tampón recién preparada y previamente enfriada, y mantenerlas frías hasta que se resuspendan en LB después de la electrotransformación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo generar rápidamente células bacterianas electrocompetentes específicas en su laboratorio, cultivándolas en una placa inicial, recolectándolas durante la fase logarítmica de crecimiento y luego lavándolas en tampón frío para prepararlas para la electrotransformación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Heering, J., et al., Inducción de diferenciación celular e imágenes unicelulares de células nadadoras y enjambres de Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017).Este video demuestra la preparación de células de enjambre de una colonia de Vibrio parahaemolyticus para imágenes de fluorescencia. Las bacterias están diseñadas genéticamente para expresar una proteína marcada con fluoróforo que se localiza unipolarmente en las células nadadoras y bipolarmente en las células de enjambre...

Preparación de células de enjambre de Vibrio parahaemolyticus para imágenes

Fuente: Kuo, C., et al. Detección de colonización enterohemorrágica por Escherichia coli en huésped murino mediante un sistema de bioluminiscencia in vivo no invasivo. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la preparación de una suspensión de Escherichia coli enterohemorrágica que expresa luciferasa a partir de caldo congelado para su uso como inóculo oral en modelos animales. Esto permite el seguimiento bioluminiscente en tiempo real de la colonización intestinal durante los estudios de...

Preparación de inóculo bioluminiscente enterohemorrágico de Escherichia coli

Fuente: Figueroa, D. M., et.al. Producción y visualización de esferoplastos y protoplastos bacterianos para caracterizar la localización de péptidos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la producción de esferoplastos de Escherichia coli inhibiendo primero la división celular para inducir la filamentación, seguida de la digestión enzimática de la pared celular. El proceso incluye la adición controlada de un agente quelante, DNasa y un estabilizador osmótico para garantizar la...

Preparación de esferoplastos de E. coli

Fuente: Stefan, A., et al., Los beneficios multifacéticos de la coexpresión de proteínas en Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el procedimiento para transformar Escherichia coli con un plásmido portador de un gen de resistencia a los antibióticos, incluida la preparación celular, la electroporación, la recuperación y la selección de transformadores.

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Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

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Aprende a preparar células electrocompetentes de Escherichia coli y Vibrio cholerae en 5-6 horas. Este protocolo rápido optimiza la transformación bacteriana con eficiencias comparables a métodos tradicionales.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes

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