Name: Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Aprende a implementar un sistema de expresión celular libre TX-TL basado en Escherichia coli para biología sintética. Este protocolo optimiza la síntesis de proteínas in vitro y acelera el diseño de circuitos biológicos.

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Agradecemos Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, y Enoc Yeung asistencia racionalización del protocolo, y Clare Chen y Lee Barclay para la ayuda en las primeras etapas del proyecto. Este material está basado en trabajo apoyado en parte por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA / MTO) Programa Living Fundiciones, número de contrato HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS está también apoyado por un Científico Médico UCLA / Caltech Programa de becas de formación y de un Departamento de Defensa, la Fuerza Aérea Oficina de Investigación Científica, Defensa Nacional de Ciencia e Ingeniería de Posgrado (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168. Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los autores y no debe interpretarse como la representación de oficialmente las políticas, ya sea expresa o implícita, de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa o el Gobierno de los EE.UU..

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Sistema de expresión libre de células TX-TL basado La Escherichia coli endógeno descrito aquí es una reacción simple-to-run de tres tubos que pueden tener menos de ocho horas de creado para la recopilación de datos. El proceso de creación de todos los reactivos requiere un total de cinco días de tiempo (con requisitos laborales importantes en un solo día), pero produce extracto crudo de 3.000 reacciones y el tampón de decisiones reactivos para 10.000 reacciones (Figura 1). Por otra parte, el extracto crudo y amortiguan de decisiones reactivos son estables durante al menos 1 año a -80 ° C, lo que permite múltiples usos de una preparación de 4. A $ 0,11 por 10 l de reacción (0,26 dólares incluyendo mano de obra), los costos son 98% más bajo que comparables sistemas comerciales (Figura 2). Hay algunas limitaciones sin resolver, sin embargo, para el sistema. La eficiencia final de cada preparación de extracto celular crudo puede variar en función de la aptitud del usuario y de las condiciones ambientales, aunque tla variación del rendimiento RUEBAS es entre 5-10% (Figura 4b). Como resultado, la variabilidad de lote a lote en tanto la expresión de punto final y en la dinámica de la expresión son de esperar. Estas variaciones probablemente se mantendrá hasta que el extracto está completamente caracterizado, o hasta que la creación de extracto está totalmente automatizado. Si el sistema de expresión libre de células se utiliza para llevar a cabo experimentos cuantitativos sensibles, es aconsejable ejecutar todos los experimentos con el mismo lote de extracto celular crudo. El rendimiento de un solo lote extracto celular crudo, unos 3.000 reacciones, debe ser suficiente para los cursos típicas experimentales. Aunque sospechamos variación puede ser removido por la ampliación y la automatización del procedimiento, tales intentos implicarían una inversión sustancial de recursos. Además, si bien los niveles de punto final de expresión son razonablemente fáciles de determinar, aún queda trabajo por hacer en la dinámica de la comprensión intrínsecas al sistema libre de células. Se sabe que tanto COMPETENCIA recursosn de recursos y limitación puede afectar la dinámica de expresión. Por ejemplo, limitada Sigma endógeno 70 puede dar lugar a un régimen de saturar con el aumento de la plantilla de ADN que produce un perfil de expresión análoga a la de nucleótidos o aminoácidos agotamiento. 9,27 Sin embargo, la dinámica no tienen que ser entendidos completamente para utilizar el sistema. Para los aumentos puros de rendimiento, optimización se puede hacer mediante métodos de aprendizaje automático. 28 Cuestiones de competencia por los recursos y la limitación pueden ser abordadas por los modelos matemáticos verificó utilizando datos experimentales. El protocolo que se presenta aquí está optimizado para una cepa BL21-Rosetta2, pero es generalizable a otras E. cepas de E. coli. Modificaciones en BL21-Rosetta2, tales como la eliminación del gen que codifica la proteasa lon y la adición de genes que codifican los ARNt raros, permiten para la producción máxima de proteínas. Hemos tratado el protocolo con otras dos cepas de extracto - sólo BL21 y un golpe de gracia-una BL21 trxAd encontraron 50% menos de producción de proteína. Nuestra hipótesis es que los rendimientos disminuyen de manera similar cuando se utilizan otras cepas. Otros cambios en los parámetros, tales como la conmutación de medio de crecimiento 2xYT para LB y otros caldos ricos, han dado lugar a la producción de proteína disminuido. Sistemas de expresión sin células utilizando tanto la maquinaria de transcripción-traducción endógeno y exógeno y los mecanismos de regulación tienen amplias aplicaciones en proteínas y expresión metabolito y de la biología sintética. 3,29 En vez de estar limitado a los circuitos T7-regulada, se puede imaginar la producción de biomoléculas complejas en un entorno controlable por el usuario usando una mezcla de E. nativa promotores coli y mecanismos de transcripción y regulación suministrados exógenamente. Sin limitaciones de la división celular y el metabolismo, la variabilidad en los circuitos sintéticos tales como el Represilador o en las vías metabólicas de ingeniería tales como los que producen artemisinina se puede reducir o mejor entendida. 30,31 Have utilizado estas ventajas para implementar interruptores genéticos, así como para entender sigma factor de secuestro de 9,32 Dicha tecnología también puede formar la columna vertebral de la &quot;mínima&quot; o células &quot;artificiales&quot; -. pequeño, bien caracterizado y unidades encarnados autosuficientes de extracto de 33,34. En última instancia, esperamos usos inmediatos de este sistema de expresión libre de células endógenas como un entorno de creación de prototipos para la biología sintética. Apodado el &quot;TX-TL breadboard biomolecular&quot;, el sistema de expresión libre de células proporciona un entorno controlable donde los circuitos sintéticos cuyo destino final es la expresión in vivo pueden someterse a rondas de prototipos - ciclos de pruebas en el plásmido básico, lineal, o ADN sintetizado químicamente, seguido por el análisis y la modificación rápida. Rondas prototipos pueden ser ayudados por los modelos matemáticos predictivos que se están desarrollando actualmente. Mediante la eliminación de la clonación y la manipulación en vivo para circuitos no finales, anticipamos ingenieríatiempos de ciclo niería para ser reducidos a 1-3 días en lugar de los estándar actuales semana.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Tecnología de expresión libre de células se inició en la década de 1950 como puramente traslacional, avanzando año más tarde para incluir mecanismos de transcripción-traducción acopladas utilizando el ADN del bacteriófago T7. 11,12 Desde entonces, se han realizado numerosos esfuerzos para optimizar la creación de extracto celular crudo (o E . extracto coli S30). 13,14 Estas optimizaciones incluyen la prolongación de la síntesis de proteínas libre de células a través de la regeneración de ATP o modificaciones de tensión y reduciendo el tiempo de protocolo y el costo. existen 15-17 sistemas de expresión de células libres alternativos que uso reconstituido componentes en lugar de crudo extracto de células para la expresión. 5 Tanto extracto celular crudo y métodos de reconstitución se han desarrollado para uso comercial. Con el advenimiento de la biología sintética, existe una mayor necesidad de una plataforma bien caracterizado para probar y expresar módulos y circuitos biológicos de ingeniería. 18,19 Esta plataforma debe serversátil, bien caracterizado, fácil de manipular, y se centró en los componentes suministrados por el usuario. A pesar de haber desarrollado la mitad de un siglo antes, los sistemas libres de células basadas en E. coli intrínsecamente compartir estos requisitos, ya que son una representación simplificada en vitro de procesos celulares sin la complejidad de crecimiento y el metabolismo. Además, todos los conocimientos básicos de trabajo en vivo en E. coli se aplica fácilmente a E. sistemas libres de células de E. coli. Aunque los sistemas de expresión de células libres pueden tener aplicaciones en la biología sintética, hasta la fecha el objetivo de la mayoría de los sistemas de expresión de células libres ha sido la maximización de la proteína y la producción de metabolitos. Esto se logra mediante el uso de bacteriófago T7 transcripción de secuencias conducidos por promotores T7. 20 Aunque la expresión es eficiente y robusta, estos sistemas sirven a un propósito altamente especializado. Métodos de regulación de la célula son limitados, las plantillas de ADN de destino deben serrediseñados para incluir promotores T7, y ciertas secuencias tales como complejos ribosómicos no se pueden transcribir y ensamblados. 21,22 sistemas de expresión libres de células existentes son incapaces de mantener altos rendimientos preservando al mismo tiempo los mecanismos de regulación endógenos, una versatilidad necesaria para la biología sintética. Hemos desarrollado una E. endógena sistema de expresión libre de células coli que conserva la eficiencia de la expresión de la proteína demostrado por los sistemas anteriores pero añade versatilidad adicional al permitir la expresión y la regulación sobre la base de ambos mecanismos (T7 u otros) endógeno y exógeno. El protocolo descrito aquí está basada originalmente en Kigawa et al. (2004) y Liu et al. (2005), pero tiene importantes modificaciones. Se utiliza Mg y K-glutamato sobre Mg-y K-acetato de etilo para aumentar la eficiencia, quita 2-mercaptoetanol, y la lisis de las células usando un cordón-batidor. 17,23,24 bolas-latidos se elige sobre la homogeneización,métodos basados ​​en la presión, o sonicación debido a su menor coste y rendimientos comparables a los sistemas de la competencia. 23 ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) se utiliza como la fuente de energía ya que se encontró para dar rendimientos de proteínas superiores en comparación con el fosfato de creatina y fosfoenolpiruvato. 4,25 Nuestro sistema puede producir hasta 0,75 mg / ml de proteína indicadora utilizando un promotor con sede en sigma70 con los operadores-fago lambda o un promotor T7 impulsado, de forma similar a los rendimientos procedentes de otros sistemas comerciales. 4,6 Cinco días son necesarias para producir todos los reactivos necesarios (Figura 1). Además, proporciona una reducción de costes del 98% en comparación con los sistemas comparables de células libres de comerciales - costes de material son de $ 0.11 por 10 l de reacción, que se eleva a 0,26 dólares, con mano de obra incluida (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomédicos</td><td>3012-032</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>BD Diagnostics</td><td>214010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos batidos (microviales de polipropileno)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuentas, 0,1 mm de diámetro.</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli cepa</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Bradford BSA</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cubetas, 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Columnas de cromatografía Micro Bio-Spin</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas inferiores ópticas Nunc de 384 pocillos</td><td>Thermo-Scientific</td><td>142761</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cinta de sellado Nunc</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución dibásica de fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución monobásica de fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RTS Muestreador de aminoácidos</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Casetes de diálisis Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ARNt (de E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Botella de centrífuga de 1 litro</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A98813</td><td>Esto es específico para la serie Avanti J; obtenga un tamaño equivalente para la centrífuga en uso.</td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer de 4 L</td><td>Kimble Chase</td><td>26500-4000</td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga Avanti J-26XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>o centrífuga con capacidad de 1L.</td></tr><tr><td>Forma 480 Agitador orbital</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>O equivalente a un agitador de 6x4L del tamaño de un cofre.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>O con capacidad de 1L, equivalente a rotor de 5000 x g para centrífuga.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Material complementario 1. Recetas para artículos. 
Cloranfenicol, 34 mg/ml: Prepare 0,51 g de cloranfenicol y agregue etanol a 15 ml. Filtro de esterilización (0.22 &mu; M), alícuota a tubos de 1 ml, almacenar a -20 °C; C para uso posterior. 
2xYT+P+Cm placa de agar: Prepare 1,24 g 2xYT, 1,6 ml de solución dibásica de fosfato de potasio @ 1 M, 0,88 ml de solución monobásica de fosfato de potasio @ 1 M, 0,6 g de agar y agua hasta 40 ml. Autoclave. Deje enfriar a 50 &deg; C y agregue 40 &mu; l Cm. Alícuota 25 ml en una placa de Petri de 100x15 mm, y dejar enfriar durante una hora. 
2xYT+P medios: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml de solución dibásica de fosfato de potasio @ 1 M, 88 ml de solución monobásica de fosfato de potasio @ 1 M y agua a 4 L. Aliquot en 2x1.88 L y 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Preparar 60,57 g de Tris base y regar hasta 250 ml. Esterilizar, almacenar en RT para su uso posterior. 
DTT, 1 M: Preparar 2,31 g de DTT y regar hasta 15 ml. Filtro de esterilización (0.22 &mu; M), alícuota a tubos de 1 ml, almacenar a -20 °C; C para uso posterior. 
S30A tampón: Prepare 10,88 g de Mg-glutamato y 24,39 g de K-glutamato, 50 ml de Tris a 2M, ácido acético (a pH 7,7) y agua a 2 L. Autoclave, almacenar a 4 & deg; C, añadir 4 ml 1 M DTT antes de usar. 
S30B tampón: Prepare 10,88 g de Mg-glutamato y 24,39 g de K-glutamato, Tris a 2 M (hasta pH 8,2), y agua a 2 L. Autoclave, almacenar a 4 & grados; C, añadir 2 ml 1 M DTT antes de usar. 
HEPES: Prepare 1,91 g de HEPES (MW 238,21), KOH (hasta pH 8) y agua hasta 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg de ARNt y agua a 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg de CoA (MW 767.53) y agua a 600 &mu;l. 
NAD: Añadir 34,83 mg de NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8) y agua a 300 &mu;l. (Añadir 27 &mu; l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7.5-8). 
cAMP: Añadir 42,80 mg de AMPc (MW 329,22), Tris a 2 M (a pH 8) y agua a 200 &mu;l. (Añadir 73 &mu; l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 8). 
Ácido folínico (33,9 mM): A 20 mg de sal cálcica sólida de ácido folínico (MW 511,5), añadir 1,15 ml de agua. 
Espermidina: Preparar 23.55 &mu; l de espermidina (MW 145.25) y agua a 150 &mu;l. Prepare a temperatura ambiente después de derretir brevemente a 37 &deg;C. 
3-PGA: Añadir 1,03 g de 3-PGA (MW 230.02), Tris a 2 M (a pH 7,5) y agua a 3,2 ml. (Añadir 1,73 ml de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5). 
Mezcla de nucleótidos: Añadir 145 mg de sal dipotásica ATP dihidratada (MW 619,4), 133 mg de sal disódica GTP (MW 567,14), 79,4 mg de sal disódica CTP dihidratada (MW 563,16), 82,6 mg de sal trisódica UTP dihidratada (MW 586,12), KOH con una dilución del 15% (hasta pH 7,5) y agua hasta 1,5 ml. (Añadir 353 &mu; l de KOH al 15% de dilución para llevar la solución a pH 7.5). 
<fuerte>Material complementario 2. Ensayo de Bradford.</fuerte>
<ol>
	<li>Eliminar el agente de Bradford de 4 &deg; C y se fijan a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare 50 &mu; l Estándar BSA a 1 mg/ml y a 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Prepare 40 &mu; l 20 veces la dilución del extracto del paso 1.47.</li>
	<li>Añade 800 &mu; l agua a 7 cubetas. </li>
	<li>Prepare cubetas estándar para 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu; l 0,1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu; l 0,1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu; l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu; l 1 mg/ml BSA).</li>
	<li>Prepare cubetas experimentales para 2 &mu; l de la muestra y 4 &mu; l de la muestra.</li>
	<li>Añade 200 &mu; l de agente Bradford a cada cubeta y mezclar bien por pipeteo. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 10 min.</li>
	<li>Produzca una curva estándar a DE 595 nm utilizando cubetas del paso 6.5. Rechace la curva estándar si r2 < 0,95,</li>
	<li> Determine la concentración de extracto a 595 nm utilizando cubetas de tep 6.6.</li>
</ol>
<fuerte>Material complementario 3. Hoja de cálculo de calibración de búfer. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> Véase TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>. 
<fuerte>Material complementario 4. Expresión sin celda run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Véase TXTL _JoVE.xlsx</a>.</td></tr></tbody></table>

los protocolos para la implementación de un escherichia coli basado tx-tl-cell de libre expresión de la biología sintética

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Sistemas de expresión de ideales sin células pueden emular teóricamente un entorno celular in vivo en un control en la plataforma vitro. 1 Esto es útil para expresar las proteínas y los circuitos genéticos de una manera controlada, así como para proporcionar un entorno de creación de prototipos para la biología sintética. 2,3 Para lograr este último objetivo, los sistemas de expresión de células libres que preservan mecanismos de transcripción-traducción Escherichia coli endógenas son capaces de reflejar con mayor precisión la dinámica celular in vivo que los basados ​​en T7 RNA polimerasa de transcripción. Se describe la preparación y ejecución de un desarrollo endógeno E. eficiente la transcripción-traducción basada coli (TX-TL) sistema de expresión libre de células que pueden producir cantidades equivalentes de proteína como los sistemas basados ​​en T7 en una reducción de costes del 98% a los sistemas comerciales similares. 4,5 La preparación de tampones y extracto celular en bruto se descrito, así como la ejecución de untres tubos de reacción TX-TL. El protocolo completo dura cinco días para preparar y produce material suficiente para un máximo de 3.000 reacciones individuales en una preparación. Una vez preparado, cada reacción tiene menos de 8 horas desde la configuración hasta la recolección y análisis de datos. Mecanismos de regulación de la transcripción y exógena a la E. coli, tales como represores lac / tet y ARN polimerasa de T7, se puede complementar. 6 propiedades endógenos, tales como ARNm y las tasas de degradación de ADN, también se puede ajustar. 7 El sistema de expresión libre de células TX-TL se ha demostrado para gran ensamblaje escala del circuito, la exploración de los fenómenos biológicos, y la expresión de proteínas bajo las dos promotores T7 y endógenos. 6,8 modelos matemáticos de acompañamiento están disponibles. 9,10 El sistema resultante tiene aplicaciones únicas en la biología sintética como un entorno de creación de prototipos, o &quot;TX- protoboard biomolecular TL &quot;.

Hemos presentado un protocolo de cinco días para la preparación de una Escherichia coli endógena sistema de expresión libre de células TX-TL basado. Una línea de tiempo de la muestra para la creación de los reactivos - extracto celular en bruto y de amortiguamiento - se puede encontrar en la Figura 1. Una vez creado, éstos se pueden almacenar a -80 ° C durante hasta un año. Una vez creados los reactivos, la configuración experimental y ejecución se puede hacer en menos de 8 horas. Además, hemos optimizado las condiciones de expresión del sistema de expresión libre de células TX-TL. Otras adiciones proporcionadas por el usuario, tales como tampones o soluciones de ADN, deben ser calibrados para la toxicidad de antemano. Por ejemplo, diferentes métodos de procesamiento de los resultados en plásmidos de expresión diferente debido al contenido de sal. También hemos probado el efecto de tampón de elución Tris-Cl en la eficiencia de reacción (Figura 5). Un ejemplo de calibración extracto celular crudo, refiriéndose paso 04.01 a 04.09, se muestraen la Figura 4a. En general, nuestros experimentos muestran que el extracto celular en bruto es más sensible a los niveles de Mg-glutamato, seguido de niveles K-glutamato. Para demostrar el sistema de expresión libre de células, construimos y probamos un circuito de retroalimentación negativa basada en tet represión. 26 (Figura 6). En el sistema de expresión libre de células, el mismo recorrido del circuito con y sin ATC muestra un punto final cambia la expresión de 7 veces de reportero deGFP después de ocho horas de expresión. Aunque este experimento no requiere inductores o represores globales, si es necesario se pueden añadir en "Maestro Preparación de la mezcla." <img alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg"> Figura 1. Línea de tiempo para el extracto celular en bruto, solución de aminoácidos, y preparación de la solución de energía. Un Timelin de cinco días E para una ejecución típica del protocolo se ha dado anteriormente, optimizado para incubaciones durante la noche y pasos de trabajo durante el día. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg"> Figura 2. Costos y análisis de la expresión de competir extractos celulares crudos. a) Desglose de los costos de mano de obra y materiales del sistema de expresión libre de células TX-TL. Sobre la base de los costos de reactivos a partir de diciembre de 2012, y los costos de mano de obra de $ 14 por hora. B) Comparación de la TX-TL costos del sistema de expresión libre de células frente a otros sistemas comerciales. Los costos se dividen por l, aunque los volúmenes de reacción pueden variar según el kit. C) Comparación de la TX-TL libre de células rendimiento sistema de expresión frente a otros sistemas comerciales. Rendimiento de expresión de proteínas determinada por las normas del fabricante./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg"> Figura 3. La carga y el procesamiento de un tubo de perlas de latir. a) Demostración de la viscosidad correcta de solución célula-perla. Solución Cell-grano tendrá una viscosidad depende de muchos factores, incluyendo la cantidad de tampón S30A añadido, la cantidad de cuentas de agregados, y el tiempo pasado en el hielo. B) Carga de cordón tubo-batir antes de la centrifugación de mesa rápido. La centrifugación elimina las burbujas acumuladas durante la carga. C) de burbujas a la superficie después de la centrifugación tablero de la mesa. El tamaño de las burbujas puede variar, ya que pueden hacer estallar o eliminar con una punta de pipeta d) de tubo de bolas-superando completamente lleno antes de la limitación.. Se forma un menisco en el cordón de-batiendo tube, y la tapa tiene suficiente para cubrir y causar pequeñas cantidades para llenar en exceso. e) Aparato de filtro cargado correctamente. Estos pueden ser reutilizados. F) Comparación de la correcta vs cordón tubo-superando incorrectamente procesada. El tubo de la izquierda es un tubo bien-beat - que cuenta con un pequeño y bien delineada capa superior, y un sobrenadante claro. El tubo de la derecha es subóptima, en base a la, segunda capa nebuloso más grande y el sobrenadante turbio. Tubos que son subóptimas no deben someterse a un procesamiento adicional. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg"> Figura 4. Propiedades de preparaciones de extracto crudo. a) parcelas de calibración típicas para extracto celular en bruto. Extracto crudo se calibra para el Mg-glutamato adicional, K-glutamato, y los niveles de TDT, en ese orden. Se muestra fluorescenc punto finale después de 8 horas, así como la tasa máxima de producción de proteína en base a un promedio móvil de 12 minutos. Sobre la base de estas parcelas, un rango aceptable de Mg-glutamato adicional es 4 mM, K-glutamato es 60-80 mM, y DTT es 0-3 mM. Tenga en cuenta que cada extracto en bruto necesita ser calibrado de forma independiente para estas tres variables. B) Variación de preparaciones de extractos. Se muestra de punto final de fluorescencia de dos extractos crudos preparados en fechas diferentes; barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg"> Figura 5. Efectos de la solución de ADN en la eficacia de la expresión. a) Comparación de dos purificación diferentemétodos para el procesamiento de plásmidos. 1 nM de pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 se prepara usando solamente un kit de Spin Miniprep Qiaprep (método de purificación 1) o post-procesado con un kit de purificación de PCR QIAquick (método de purificación 2). Se muestra la fluorescencia de punto final después de 8 horas, así como la tasa máxima de producción de proteína en base a un promedio móvil de 12 minutos. Las barras de error son de 1 desviación estándar de cuatro carreras independientes en diferentes días. B) Efecto del tampón de elución (Tris-Cl). Diferentes concentraciones de Tris-Cl se comparan en una reacción de expresión libre de células basado en la expresión de 1 nM de pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Las concentraciones dadas son concentraciones finales de Tris-Cl en la reacción; tampón de elución utilizado es 10 mM de Tris-Cl. Las barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . Figura 6. Muestra de ejecución TX-TL de un bucle de retroalimentación negativa. a) Ejemplo de configuración de una reacción de ejecución libre de células. Tests "en" contra "de" estado de la curva de retroalimentación negativa, con controles positivos y negativos. B) El plásmido mapa de bucle de retroalimentación negativa. C) Los resultados representativos. Los datos reflejan experimento en a) y b), con el control negativo se resta de la señal. Circuito genético muestra en la inserción. Las barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> El cloranfenicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml en etanol </td><td> 1 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) </td><td> Puede ser hecho en volúmenes más grandes almacenados a -20 ° C para su uso posterior. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + placa de agar Cm </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM de fosfato de potasio dibásico, 22 mM de fosfato de potasio monobásico, 34 mg / ml de cloranfenicol </td><td> 1 placa </td><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P multimedia </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM de fosfato de potasio dibásico, 22 mM de fosfato de potasio monobásico </td><td> 4 L </td><td> Autoclave </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos para el día 1 del protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Tris base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) o en autoclave </td><td> Se puede almacenar a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) </td><td> Puede ser hecho en volúmenes más grandes y se almacenó a -20 ° C para su uso posterior. </td></tr><tr><td> Búfer S30A </td><td> 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, mM de Tris, pH 7,7 50 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Para llegar a pH 7,7, valorar con ácido acético. Añadir TDT a 2 mM de concentración final, justo antes de su uso. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Búfer S30B </td><td> 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, ~ 5 mM de Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Para llegar a pH 8,2, se valora con 2 MTris. Añadir TDT a 1 mM concentración final justo antes de su uso. Almacenar a 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos para el día 2 del protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Halcón </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Vacío 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon con pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Masa de pellets (50 ml Falcon con pellet - vacío 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volumen de tampón S30A añadir (masa de pellets * 0.9) (ml) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Masa total de cuentas para agregar (masa de pellets * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Búfer S30A y calculadora de masa del grano, para el día 3 de protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 8, titule con KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM de ATP y GTP, CTP y UTP mM, de pH 7,5 94 </td><td> 1,5 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 7,5, titule con KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 l </td><td> Ninguno </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 l </td><td> Ninguno </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7.5-8 </td><td> 300 l </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a pH 7,5-8, titule con Tris 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 l </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 8, titule con Tris 2 M. </td></tr><tr><td> El ácido folínico </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 l </td><td> Ninguno </td><td> Aunque se necesitan sólo 300 l, receta en suplementario es de 1,15 ml. </td></tr><tr><td> La espermidina </td><td> 1 M </td><td> 150 l </td><td> Ninguno </td><td> Almacenar a 4 ° C, el calor a 37 ° C para fundir. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 7,5, se valora con Tris 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Reactivos para prepararse para el protocolo Energy Solution. Material complementario 1. Recetas para los artículos. El cloranfenicol, 34 mg / ml: Preparar 0,51 g de cloranfenicol y añadir etanol a 15 ml. Se esteriliza con filtro (0.22 M), alícuota de 1 ml tubos, almacenar a -20 ° C para su uso posterior. 2xYT + P + placa de agar Cm: Preparar 1,24 g 2xYT, 1,6 ml de fosfato de potasio dibásico @ solución 1 M, 0,88 ml de solución de fosfato monobásico de potasio @ 1 M, 0,6 g de agar, y el agua a 40 ml. Autoclave. Dejar enfriar a 50 ° C y añadir 40 l Cm. Alícuota de 25 ml en una placa de 100 x 15 mm Petri, y deje que se enfríe durante una hora. 2xYT + P los medios de comunicación: Preparar 124 g 2xYT, 160 ml de fosfato de potasio dibásico @ solución 1 M, solución de 88 ml de fosfato de potasio monobásico @ 1 M, y agua a 4 L. Aliquot hacia 2 x 1,88 L y 0,24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60,57 g Tris base y agua hasta 250 ml. Esterilizar, almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior. TDT, 1 M: Preparar 2,31 g TDT y el agua a 15 ml. Se esteriliza con filtro (0.22 M), alícuota de 1 ml tubos, almacenar a -20 ° C para su uso posterior. Búfer S30A: Prepare 10,88 g Mg-glutamato y 24,39 g K-glutamato, 50 ml de Tris a 2 M, ácido acético (pH 7,7), y el agua a 2 L. Autoclave, se almacenan a 4 ° C, añadir 4 ml 1 M DTT antes de su uso. Búfer S30B: Prepare 10,88 g Mg-glutamato y 24,39 g K-glutamato, Tris 2 M (pH 8,2), y el agua a 2 L. Autoclave, se almacenan a 4 ° C, añadir 2 ml de 1 M DTT antes de su uso. HEPES: Preparar 1,91 g de HEPES (MW 238,21), KOH (a pH 8), y agua a 4 ml. ARNt: Prepare 30 mg de ARNt y agua a 600 l. CoA: Preparar 30 mg de CoA (MW 767,53) y agua a 600 l. NAD: Añadir 34,83 ​​mg de NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8), y agua a 300 l. (Añadir 27 l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5-8). cAMP: Agregar 42,80 mg de cAMP (PM 329,22), Tris 2 M (pH 8), y el agua a 200 l. (Añadir 73 l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 8). Ácido folínico (33,9 mM): Para 20 mg de sal de calcio de ácido folínico sólido (MW 511.5), añadir 1,15 ml de agua. La espermidina: Preparar 23,55 l de espermidina (MW 145,25) y agua a 150 l. Preparar a temperatura ambiente después de la fusión brevemente a 37 ° C. 3-PGA: Añadir 1,03 g de 3-PGA (MW 230,02), Tris a 2 M (a pH 7,5), y agua a 3,2 ml. (Añadir 1,73 ml de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5). Nucleotide Mix: Añadir 145 mg de ATP dipotásico dihidrato de sal (MW 619.4), 133 mg de sal disódica GTP (MW 567,14), 79,4 mg de sal disódica dihidrato CTP (MW 563,16), 82,6 mg de dihidrato de la sal trisódica UTP (MW 586,12) , KOH a 15% de dilución (a pH 7,5), y agua a 1,5 ml. (Añadir 353 l de KOH a 15% de dilución para llevar la solución a pH 7,5). Material suplementario 2. Ensayo de Bradford. <ol><li> Eliminar los agentes Bradford de 4 ° C y se pondrá a la temperatura ambiente. </li><li> Preparar 50 l de BSA estándar a 1 mg / ml y a 0,1 mg / ml. </li><li> Preparar 40 l de 20x de dilución del extracto de la etapa 1.47. </li><li> Añadir 800 l de agua a 7 cubetas. </li><li> Preparar cubetas estándar para 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 l 0,1 mg / ml de BSA), 2 mg / ml (20 l 0,1 mg / ml de BSA), 4 mg / ml (4 l 1 mg / ml de BSA) , 6 mg / ml (6 l 1 mg / ml de BSA). </li><li> Preparar cubetas experimentales para 2 l de muestra y 4 l de muestra. </li><li> Añadir 200 l de agente de Bradford a cada cubeta y mezclar bien bY pipeteado. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 10 min. </li><li> Producir curva estándar a una DO de 595 nm usando cubetas de paso 6.5. Rechazar curva estándar si r 2 &lt;0,95. </li><li> Determinar la concentración del extracto a una DO de 595 nm utilizando cubetas desde el paso 6.6. </li></ol> Material complementario 3. Tampón de hoja de cálculo de calibración. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Ver TXTL_e (plantilla) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Material suplementario 4. Expresión libre de células ejecutar hojas de cálculo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Ver TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de expresión libre de células basado en E. coli conocido como traducción de transcripción o TX tl. Esto se logra fabricando primero tres componentes iniciales para el extracto de células crudas TX TL, la solución de aminoácidos y la solución energética. La solución de aminoácidos y la solución energética se combinarán posteriormente para formar el tampón TX TL.El segundo paso es calibrar el extracto celular crudo para determinar las concentraciones óptimas de magnesio, potasio y DTT para producir reacciones TX TL con niveles máximos de expresión. A continuación, los resultados de la calibración se utilizan para hacer un sistema TX TL de tres tubos hecho de extracto de células crudas tampón y ADN. El paso final es ejecutar una reacción TX TL utilizando los reactivos que se acaban de fabricar.En última instancia, TX TL se utiliza para demostrar circuitos de biología sintética, así como aplicaciones tradicionales de expresión libre de células. Este método puede ayudar a probar circuitos en el campo de la biología sintética al proporcionar un entorno igual in vitro, que emula el in vivo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el aumento de la velocidad del diseño biológico sintético al eliminar la necesidad de realizar todos los pasos de creación de prototipos in vivo.Claire Hayes, asistente de investigación en nuestro grupo, asistirá en un procedimiento. Tenga en cuenta que este video pasará solo por secciones seleccionadas del protocolo críticas para la filmación. El protocolo completo está disponible con el artículo de texto.Al principio de este protocolo, las células bacterianas se cultivaban y peletizaban. Ahora las células bacterianas se lisarán con un batidor de cuentas. Mantenga todos los tubos de halcón de 50 mililitros que contienen suspensión celular en hielo.A los efectos de este video, se demostrará el abalorio de cuentas para un solo tubo. Las cuentas deben agregarse intermitentemente al tubo Falcon en tres alícuotas, cada una utilizando un tercio del total de las cuentas. Agregue la primera alícuota de cuentas al vórtice del tubo durante 30 segundos y colóquela en hielo.De la misma manera, agregue la segunda alícuota de cuentas, vórtice y colóquela en hielo. Después de agregar la última alícuota y asegurarse de que las cuentas se distribuyan uniformemente, se debe formar una pasta espesa después del tercer paso de vórtice. Coloque el tubo sobre hielo.Prepare una punta de pipeta de cinco mililitros de volumen utilizando unas tijeras estériles para cortar el extremo. Para crear una abertura de tres a cuatro milímetros, marque la pipeta a dos mililitros. Coloque 20 tubos estériles de cuentas sobre hielo.Utilice la pipeta modificada para verificar la alta viscosidad de la solución de celda de perlas. Debe ser viscoso hasta el punto de salir apenas de la punta de la pipeta. Durante la expulsión, retire la solución de celda de perlas del tubo Falcon y transfiérala a un tubo de perlas de perlas.Llenándolo tres cuartos de giro completo extremadamente brevemente en una mini centrífuga. Para eliminar las burbujas de aire sin redistribuir las perlas, termine de agregar la solución de células de perlas al tubo para formar un menisco cóncavo. A continuación, agregue una gota muy pequeña de solución de celda de perlas en el interior de la tapa de un tubo de perlas de perlas.Tenga cuidado de no poner la solución en el borde exterior de la tapa. De lo contrario, el tubo de rebordeado no se cerrará lo suficiente. Golpee la tapa sobre una superficie plana y verifique que no haya burbujas de aire en la parte inferior de la tapa.Tapa el tubo para batir cuentas. Si se hace correctamente, la tapa debe estar herméticamente sellada. No debe haber burbujas de aire visibles y poca o ninguna solución de celda de cuentas debe desbordarse a partir de ahora, se requieren dos personas para realizar el rebordeado de cuentas de manera eficiente.Entregue el tubo lleno a un asistente para que lo rebordee mientras el primer demostrador continúa llenando más tubos de rebordeado con la solución de celda de perlas restante. Tome el tubo de cuentas lleno y colóquelo en hielo. Una vez que se han recogido dos tubos de cuentas llenos y han estado en hielo durante al menos un minuto.Comience a rebordear un tubo durante 30 segundos a 46 RPM. Colóquelo boca abajo sobre hielo durante 30 segundos mientras bate el otro tubo. Repita el abalorio y el glaseado de modo que cada tubo de abalorios relleno se bata durante un total de un minuto.Una vez que se hayan procesado todos los tubos de cuentas llenos, construya un aparato de filtro a partir de un tubo de halcón de 15 mililitros. Primero, agregue una nueva tapa de abalorios con la parte plana hacia arriba hasta la parte inferior del tubo. A continuación, retire la tapa de un tubo de rebordeado de perlas procesado y presione firmemente una columna de microcromatografía en el extremo del tubo de rebordeado de perlas procesado hasta que quede completamente sellado.Quite el extremo elucian de la columna de microcromatografía y colóquelo elucian. Termine en un tubo vacío para abalorios de cuentas. Coloque este complejo en el tubo de halcón de 15 mililitros.Construya los aparatos de filtro para todos los tubos de batido de cuentas llenos y manténgalos en hielo. Cuando se completa la centrífuga, los aparatos de filtro Falcon tubo se destapan a 6, 000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para separar el extracto y el pellet de las perlas. Después de la centrifugación, verifique que cada tubo de rebordeado de cuentas haya producido un extracto viable.El extracto debidamente batido no será turbio y el pellet tendrá dos capas distintas, como se ilustra en el tubo de la izquierda. Los tubos turbios como se muestra en el ejemplo de la derecha deben desecharse. Transfiera el sobrenadante de los tubos no turidos a los tubos individuales de microcentrífuga de 1,75 mililitros, tomando la menor cantidad de gránulos posible.Manténgalo en hielo hasta que se hayan procesado todos los tubos de abalorios. A continuación, gire los tubos de la microcentrífuga y recoja el sobrenadante. Después de consolidar 500 microlitros de sobrenadante sin pellets en un nuevo tubo de rebordeado de perlas.Incubar los tubos sin tapas a 220 RPM y 37 grados centígrados durante 80 minutos. Esto digerirá los ácidos nucleicos restantes utilizando la exonucleasa endógena liberada durante el proceso de rebordeado de cuentas. Cuando se complete la incubación, el extracto debe verse turbio.Consolide el extracto en tubos de microcentrífuga de 1,75 mililitros hasta 1,5 mililitros por centrífuga de tubo a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con una pipeta, consolide el sobrenadante sin pellets en un tubo de microcentrífuga de 1,75 mililitros para rendimientos más pequeños o en un tubo de halcón de 15 mililitros para rendimientos más grandes en hielo. Tape el tubo y mezcle bien invirtiendo.Guarde 10 microlitros de sobrenadante en hielo para la medición posterior de la concentración de proteínas. Determine la cantidad total de extracto producido e hidrate el número necesario de casetes de diálisis de corte de 10 pesos moleculares sumergiéndolos en tampón S 30 B durante dos minutos. Cargue casetes con hasta 2,5 mililitros de extracto.Cada vaso de precipitados puede llevar hasta dos casetes dializados agitando a cuatro grados centígrados durante tres horas. Consulte el artículo escrito para conocer los pasos de procesamiento después de la diálisis. Una reacción básica de traducción de transcripción tiene tres partes, extracto de células crudas, tampón y ADN.Aunque las reacciones pueden variar en volumen, este protocolo utiliza una plantilla preescrita para llevar a cabo una reacción de 10 microlitros. Aquí. Los elementos en púrpura indican los valores de entrada del usuario, y los elementos en azul indican reactivos adicionales para agregar al diseño de reacción el experimento en sili utilizando la sección de preparación de mezcla maestra y la sección de preparación de ADN. Por lo general, las constantes se pueden poner en la sección de preparación de la mezcla maestra, mientras que las variables se pueden poner en la sección de preparación del ADN.Minimice las muestras por experimento para evitar la evaporación de la muestra y el sesgo del tiempo de inicio experimental. En esta tabla se muestra un ejemplo de configuración. Para preparar muestras de ADN para cada muestra, identifique alícuotas el agua de ADN indicada y los elementos suministrados por el usuario en un tubo de microcentrífuga.A temperatura ambiente, prepare la mezcla maestra que consiste en extracto tampón y cualquier elemento suministrado por el usuario global que mantenga el hielo y el vórtice. Después de la adición de cada elemento, agregue la cantidad adecuada de mezcla maestra a cada muestra de ADN y manténgala a temperatura ambiente. Trate esto como la hora de inicio de la reacción.Agite cada muestra en vórtice y centrifugue a 10.000 g durante 30 segundos a temperatura ambiente para reducir cualquier muestra residual y reducir las burbujas. Ejecute la reacción en una placa de 384 pocillos a 29 grados centígrados. Los tiempos de ejecución variarán en función del experimento, pero normalmente duran menos de ocho horas.Al finalizar la tirada, los datos se pueden leer desde un lector de placas. Este artículo presenta un protocolo de cinco días para la preparación de un sistema de traducción de transcripción basado en E. coli endógeno o TXTL cell-free. Las condiciones de expresión de este sistema se optimizaron mediante la prueba de los efectos de diferentes métodos de procesamiento de plásmidos y el tampón eluciano.Ciertas variables introducidas en el sistema TXTL deben calibrarse de antemano para determinar su toxicidad, por ejemplo, en la comparación de los métodos de procesamiento de plásmidos, el método de purificación uno utiliza solo un kit de preparación Kaya Prep Spin Mini, mientras que en el método de purificación dos, el plásmido se prepara utilizando el mismo kit de preparación mini y luego se procesa posteriormente con un kayak. Kit de purificación rápida por PCR. Este gráfico muestra la fluorescencia del punto final después de ocho horas, así como la tasa máxima de producción de proteínas basada en una media móvil de 12 minutos. Las barras de error son una desviación estándar de cuatro ejecuciones independientes en días diferentes.La diferencia en la expresión observada se debe a la diferencia en el contenido de sal. Sin embargo, es posible que otros elementos no muestren ningún efecto sobre TXTL, como el búfer elucian. Se compararon diferentes concentraciones de cloruro de TS en una reacción de expresión libre de células basada en la expresión de un ano molar de plásmido.Las concentraciones indicadas son concentraciones finales de tricloruro. En la reacción, el tampón elucian utilizado es de 10 milimolares de cloruro tris, las barras de error son una desviación estándar de tres corridas independientes en días diferentes. Esta figura muestra gráficos de calibración típicos para el extracto de células crudas, calibradas para niveles adicionales de glutamato de magnesio, glutamato de potasio y DTT.Se muestra la fluorescencia del punto final después de ocho horas, así como la tasa máxima de producción de proteínas basada en una media móvil de 12 minutos. Tenga en cuenta que cada extracto de células crudas debe calibrarse de forma independiente para estas tres variables. En general, los resultados indican que el extracto celular crudo es más sensible a los niveles de glutamato de magnesio, seguido de los niveles de glutamato de potasio.Sobre la base de estos gráficos, un rango aceptable de glutamato de magnesio adicional es de cuatro milimolares, el glutamato de potasio es de 60 a 80 milimolares y el DTT es de cero a tres milimolares en el lado inferior. La eficiencia final de cada preparación de extracto de células crudas puede variar en función de la competencia del usuario y de las condiciones ambientales. Aunque la variación típica del rendimiento está entre el cinco y el 10%, aquí se muestra la fluorescencia final de dos extractos crudos preparados en diferentes fechas.Las barras de error son una desviación estándar de tres ejecuciones independientes en días diferentes. Para demostrar el sistema de expresión libre de células, se construyó y probó un bucle de retroalimentación negativa basado en la represión de Tet, el mismo circuito ejecutado con y sin un TC mostró una expresión de punto final séptuple. Cambio del reportero D-E-G-F-P después de ocho horas de expresión Las barras de error son una desviación estándar de tres ejecuciones independientes en días diferentes.El circuito genético se muestra en el recuadro. Esta figura final muestra el análisis de costo y expresión de los extractos de células crudas de la competencia. El gráfico circular desglosa los costos de mano de obra y materiales del sistema de expresión sin células TX TL en función de los costos de los reactivos a diciembre de 2012 y los costos de mano de obra de 14 por hora.En el panel B se comparan los costos del sistema de expresión libre de células TX con los de otros sistemas comerciales. Los costos se desglosan por microlitro, aunque los volúmenes de reacción pueden variar según el kit. Los costos de material para este sistema son de aproximadamente 3 centavos por reacción de microlitro, lo que representa una reducción de costos del 98% en comparación con los sistemas comerciales sin celdas comparables.El panel C muestra una comparación del rendimiento del sistema de expresión libre de células TX TL frente a otros sistemas comerciales. Este sistema puede producir hasta 0,75 miligramos por mililitro de proteína reportera utilizando un promotor basado en Sigma 70 con operadores de fagos Lambda o un promotor impulsado por T seven. Estas comparaciones indican que el sistema de expresión libre de células TX TL puede producir cantidades equivalentes de proteína, ya que los sistemas basados en T seven añaden una tremenda reducción de costos a sistemas comerciales similares.Esperamos que esta técnica allane el camino para simplificar el proceso de ingeniería en biología sintética.

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Biología

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