Los protocolos para la implementación de un Escherichia coli Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética
16 de septiembre de 2013
Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.
El objetivo general de este procedimiento es crear un sistema de expresión libre de células basado en E. coli conocido como traducción de transcripción o TX tl. Esto se logra fabricando primero tres componentes iniciales para el extracto de células crudas TX TL, la solución de aminoácidos y la solución energética. La solución de aminoácidos y la solución energética se combinarán posteriormente para formar el tampón TX TL.
El segundo paso es calibrar el extracto celular crudo para determinar las concentraciones óptimas de magnesio, potasio y DTT para producir reacciones TX TL con niveles máximos de expresión. A continuación, los resultados de la calibración se utilizan para hacer un sistema TX TL de tres tubos hecho de extracto de células crudas tampón y ADN. El paso final es ejecutar una reacción TX TL utilizando los reactivos que se acaban de fabricar.
En última instancia, TX TL se utiliza para demostrar circuitos de biología sintética, así como aplicaciones tradicionales de expresión libre de células. Este método puede ayudar a probar circuitos en el campo de la biología sintética al proporcionar un entorno igual in vitro, que emula el in vivo. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el aumento de la velocidad del diseño biológico sintético al eliminar la necesidad de realizar todos los pasos de creación de prototipos in vivo.
Claire Hayes, asistente de investigación en nuestro grupo, asistirá en un procedimiento. Tenga en cuenta que este video pasará solo por secciones seleccionadas del protocolo críticas para la filmación. El protocolo completo está disponible con el artículo de texto.
Al principio de este protocolo, las células bacterianas se cultivaban y peletizaban. Ahora las células bacterianas se lisarán con un batidor de cuentas. Mantenga todos los tubos de halcón de 50 mililitros que contienen suspensión celular en hielo.
A los efectos de este video, se demostrará el abalorio de cuentas para un solo tubo. Las cuentas deben agregarse intermitentemente al tubo Falcon en tres alícuotas, cada una utilizando un tercio del total de las cuentas. Agregue la primera alícuota de cuentas al vórtice del tubo durante 30 segundos y colóquela en hielo.
De la misma manera, agregue la segunda alícuota de cuentas, vórtice y colóquela en hielo. Después de agregar la última alícuota y asegurarse de que las cuentas se distribuyan uniformemente, se debe formar una pasta espesa después del tercer paso de vórtice. Coloque el tubo sobre hielo.
Prepare una punta de pipeta de cinco mililitros de volumen utilizando unas tijeras estériles para cortar el extremo. Para crear una abertura de tres a cuatro milímetros, marque la pipeta a dos mililitros. Coloque 20 tubos estériles de cuentas sobre hielo.
Utilice la pipeta modificada para verificar la alta viscosidad de la solución de celda de perlas. Debe ser viscoso hasta el punto de salir apenas de la punta de la pipeta. Durante la expulsión, retire la solución de celda de perlas del tubo Falcon y transfiérala a un tubo de perlas de perlas.
Llenándolo tres cuartos de giro completo extremadamente brevemente en una mini centrífuga. Para eliminar las burbujas de aire sin redistribuir las perlas, termine de agregar la solución de células de perlas al tubo para formar un menisco cóncavo. A continuación, agregue una gota muy pequeña de solución de celda de perlas en el interior de la tapa de un tubo de perlas de perlas.
Tenga cuidado de no poner la solución en el borde exterior de la tapa. De lo contrario, el tubo de rebordeado no se cerrará lo suficiente. Golpee la tapa sobre una superficie plana y verifique que no haya burbujas de aire en la parte inferior de la tapa.
Tapa el tubo para batir cuentas. Si se hace correctamente, la tapa debe estar herméticamente sellada. No debe haber burbujas de aire visibles y poca o ninguna solución de celda de cuentas debe desbordarse a partir de ahora, se requieren dos personas para realizar el rebordeado de cuentas de manera eficiente.
Entregue el tubo lleno a un asistente para que lo rebordee mientras el primer demostrador continúa llenando más tubos de rebordeado con la solución de celda de perlas restante. Tome el tubo de cuentas lleno y colóquelo en hielo. Una vez que se han recogido dos tubos de cuentas llenos y han estado en hielo durante al menos un minuto.
Comience a rebordear un tubo durante 30 segundos a 46 RPM. Colóquelo boca abajo sobre hielo durante 30 segundos mientras bate el otro tubo. Repita el abalorio y el glaseado de modo que cada tubo de abalorios relleno se bata durante un total de un minuto.
Una vez que se hayan procesado todos los tubos de cuentas llenos, construya un aparato de filtro a partir de un tubo de halcón de 15 mililitros. Primero, agregue una nueva tapa de abalorios con la parte plana hacia arriba hasta la parte inferior del tubo. A continuación, retire la tapa de un tubo de rebordeado de perlas procesado y presione firmemente una columna de microcromatografía en el extremo del tubo de rebordeado de perlas procesado hasta que quede completamente sellado.
Quite el extremo elucian de la columna de microcromatografía y colóquelo elucian. Termine en un tubo vacío para abalorios de cuentas. Coloque este complejo en el tubo de halcón de 15 mililitros.
Construya los aparatos de filtro para todos los tubos de batido de cuentas llenos y manténgalos en hielo. Cuando se completa la centrífuga, los aparatos de filtro Falcon tubo se destapan a 6, 000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para separar el extracto y el pellet de las perlas. Después de la centrifugación, verifique que cada tubo de rebordeado de cuentas haya producido un extracto viable.
El extracto debidamente batido no será turbio y el pellet tendrá dos capas distintas, como se ilustra en el tubo de la izquierda. Los tubos turbios como se muestra en el ejemplo de la derecha deben desecharse. Transfiera el sobrenadante de los tubos no turidos a los tubos individuales de microcentrífuga de 1,75 mililitros, tomando la menor cantidad de gránulos posible.
Manténgalo en hielo hasta que se hayan procesado todos los tubos de abalorios. A continuación, gire los tubos de la microcentrífuga y recoja el sobrenadante. Después de consolidar 500 microlitros de sobrenadante sin pellets en un nuevo tubo de rebordeado de perlas.
Incubar los tubos sin tapas a 220 RPM y 37 grados centígrados durante 80 minutos. Esto digerirá los ácidos nucleicos restantes utilizando la exonucleasa endógena liberada durante el proceso de rebordeado de cuentas. Cuando se complete la incubación, el extracto debe verse turbio.
Consolide el extracto en tubos de microcentrífuga de 1,75 mililitros hasta 1,5 mililitros por centrífuga de tubo a 12.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con una pipeta, consolide el sobrenadante sin pellets en un tubo de microcentrífuga de 1,75 mililitros para rendimientos más pequeños o en un tubo de halcón de 15 mililitros para rendimientos más grandes en hielo. Tape el tubo y mezcle bien invirtiendo.
Guarde 10 microlitros de sobrenadante en hielo para la medición posterior de la concentración de proteínas. Determine la cantidad total de extracto producido e hidrate el número necesario de casetes de diálisis de corte de 10 pesos moleculares sumergiéndolos en tampón S 30 B durante dos minutos. Cargue casetes con hasta 2,5 mililitros de extracto.
Cada vaso de precipitados puede llevar hasta dos casetes dializados agitando a cuatro grados centígrados durante tres horas. Consulte el artículo escrito para conocer los pasos de procesamiento después de la diálisis. Una reacción básica de traducción de transcripción tiene tres partes, extracto de células crudas, tampón y ADN.
Aunque las reacciones pueden variar en volumen, este protocolo utiliza una plantilla preescrita para llevar a cabo una reacción de 10 microlitros. Aquí. Los elementos en púrpura indican los valores de entrada del usuario, y los elementos en azul indican reactivos adicionales para agregar al diseño de reacción el experimento en sili utilizando la sección de preparación de mezcla maestra y la sección de preparación de ADN. Por lo general, las constantes se pueden poner en la sección de preparación de la mezcla maestra, mientras que las variables se pueden poner en la sección de preparación del ADN.
Minimice las muestras por experimento para evitar la evaporación de la muestra y el sesgo del tiempo de inicio experimental. En esta tabla se muestra un ejemplo de configuración. Para preparar muestras de ADN para cada muestra, identifique alícuotas el agua de ADN indicada y los elementos suministrados por el usuario en un tubo de microcentrífuga.
A temperatura ambiente, prepare la mezcla maestra que consiste en extracto tampón y cualquier elemento suministrado por el usuario global que mantenga el hielo y el vórtice. Después de la adición de cada elemento, agregue la cantidad adecuada de mezcla maestra a cada muestra de ADN y manténgala a temperatura ambiente. Trate esto como la hora de inicio de la reacción.
Agite cada muestra en vórtice y centrifugue a 10.000 g durante 30 segundos a temperatura ambiente para reducir cualquier muestra residual y reducir las burbujas. Ejecute la reacción en una placa de 384 pocillos a 29 grados centígrados. Los tiempos de ejecución variarán en función del experimento, pero normalmente duran menos de ocho horas.
Al finalizar la tirada, los datos se pueden leer desde un lector de placas. Este artículo presenta un protocolo de cinco días para la preparación de un sistema de traducción de transcripción basado en E. coli endógeno o TXTL cell-free. Las condiciones de expresión de este sistema se optimizaron mediante la prueba de los efectos de diferentes métodos de procesamiento de plásmidos y el tampón eluciano.
Ciertas variables introducidas en el sistema TXTL deben calibrarse de antemano para determinar su toxicidad, por ejemplo, en la comparación de los métodos de procesamiento de plásmidos, el método de purificación uno utiliza solo un kit de preparación Kaya Prep Spin Mini, mientras que en el método de purificación dos, el plásmido se prepara utilizando el mismo kit de preparación mini y luego se procesa posteriormente con un kayak. Kit de purificación rápida por PCR. Este gráfico muestra la fluorescencia del punto final después de ocho horas, así como la tasa máxima de producción de proteínas basada en una media móvil de 12 minutos. Las barras de error son una desviación estándar de cuatro ejecuciones independientes en días diferentes.
La diferencia en la expresión observada se debe a la diferencia en el contenido de sal. Sin embargo, es posible que otros elementos no muestren ningún efecto sobre TXTL, como el búfer elucian. Se compararon diferentes concentraciones de cloruro de TS en una reacción de expresión libre de células basada en la expresión de un ano molar de plásmido.
Las concentraciones indicadas son concentraciones finales de tricloruro. En la reacción, el tampón elucian utilizado es de 10 milimolares de cloruro tris, las barras de error son una desviación estándar de tres corridas independientes en días diferentes. Esta figura muestra gráficos de calibración típicos para el extracto de células crudas, calibradas para niveles adicionales de glutamato de magnesio, glutamato de potasio y DTT.
Se muestra la fluorescencia del punto final después de ocho horas, así como la tasa máxima de producción de proteínas basada en una media móvil de 12 minutos. Tenga en cuenta que cada extracto de células crudas debe calibrarse de forma independiente para estas tres variables. En general, los resultados indican que el extracto celular crudo es más sensible a los niveles de glutamato de magnesio, seguido de los niveles de glutamato de potasio.
Sobre la base de estos gráficos, un rango aceptable de glutamato de magnesio adicional es de cuatro milimolares, el glutamato de potasio es de 60 a 80 milimolares y el DTT es de cero a tres milimolares en el lado inferior. La eficiencia final de cada preparación de extracto de células crudas puede variar en función de la competencia del usuario y de las condiciones ambientales. Aunque la variación típica del rendimiento está entre el cinco y el 10%, aquí se muestra la fluorescencia final de dos extractos crudos preparados en diferentes fechas.
Las barras de error son una desviación estándar de tres ejecuciones independientes en días diferentes. Para demostrar el sistema de expresión libre de células, se construyó y probó un bucle de retroalimentación negativa basado en la represión de Tet, el mismo circuito ejecutado con y sin un TC mostró una expresión de punto final séptuple. Cambio del reportero D-E-G-F-P después de ocho horas de expresión Las barras de error son una desviación estándar de tres ejecuciones independientes en días diferentes.
El circuito genético se muestra en el recuadro. Esta figura final muestra el análisis de costo y expresión de los extractos de células crudas de la competencia. El gráfico circular desglosa los costos de mano de obra y materiales del sistema de expresión sin células TX TL en función de los costos de los reactivos a diciembre de 2012 y los costos de mano de obra de 14 por hora.
En el panel B se comparan los costos del sistema de expresión libre de células TX con los de otros sistemas comerciales. Los costos se desglosan por microlitro, aunque los volúmenes de reacción pueden variar según el kit. Los costos de material para este sistema son de aproximadamente 3 centavos por reacción de microlitro, lo que representa una reducción de costos del 98% en comparación con los sistemas comerciales sin celdas comparables.
El panel C muestra una comparación del rendimiento del sistema de expresión libre de células TX TL frente a otros sistemas comerciales. Este sistema puede producir hasta 0,75 miligramos por mililitro de proteína reportera utilizando un promotor basado en Sigma 70 con operadores de fagos Lambda o un promotor impulsado por T seven. Estas comparaciones indican que el sistema de expresión libre de células TX TL puede producir cantidades equivalentes de proteína, ya que los sistemas basados en T seven añaden una tremenda reducción de costos a sistemas comerciales similares.
Esperamos que esta técnica allane el camino para simplificar el proceso de ingeniería en biología sintética.
Resumen
Este protocolo describe la creación y operación de un sistema de expresión celular libre basado en Escherichia coli conocido como TX-TL. El proceso incluye la preparación de componentes esenciales, la calibración de extractos y la ejecución de reacciones TX-TL para facilitar aplicaciones en biología sintética.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Sintética
- Sistemas Libres de Células
- Transcripción y Traducción
Antecedentes
- Los sistemas TX-TL permiten la síntesis de proteínas in vitro.
- Este método simplifica la prueba de circuitos de biología sintética.
- Los sistemas libres de células eliminan la necesidad de prototipado in vivo.
- Produce eficientemente proteínas para investigación y aplicaciones.
Objetivo del estudio
- Establecer un sistema fiable de expresión acelular TX-TL.
- Optimizar las condiciones para lograr una expresión proteica máxima.
- Mostrar la utilidad del sistema TX-TL en biología sintética.
Métodos Utilizados
- Preparación de extracto celular crudo, soluciones de aminoácidos y de energía.
- Calibración del extracto para condiciones óptimas de reacción.
- Realización de reacciones TX-TL utilizando los componentes preparados.
- Uso de ruptura por bolas para la lisis celular y la preparación del extracto.
Resultados Principales
- Generación exitosa de extractos viables de TX-TL.
- Establecimiento de las condiciones óptimas para la síntesis de proteínas.
- Demostación de la eficacia del sistema en biología sintética.
- Creación de un protocolo reproducible para estudios futuros.
Conclusiones
- El sistema TX-TL es una herramienta poderosa para la investigación en biología sintética.
- Los protocolos optimizados aumentan la velocidad del diseño biológico.
- Este método proporciona una plataforma versátil para la expresión de proteínas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la prototipificación rápida de circuitos genéticos y la expresión de proteínas en un entorno in vitro controlado, reduciendo la dependencia de flujos de trabajo in vivo que consumen mucho tiempo. Al preservar los mecanismos endógenos de transcripción-traducción de E. coli, el sistema ofrece una plataforma fisiológicamente relevante para reducir los riesgos en los diseños de biología sintética. La reducción del 98 % en costos frente a alternativas comerciales favorece pruebas escalables e iterativas en las etapas iniciales del descubrimiento, mejorando la eficiencia del capital y acelerando los ciclos de diseño-construcción-prueba.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite probar hipótesis sobre circuitos genéticos y elementos reguladores en condiciones endógenas de E. coli, aclarando el comportamiento de las vías y la función del blanco.
- Valor operativo: Facilita el diseño iterativo de construcciones de biología sintética sin restricciones del crecimiento celular, reduciendo el tiempo necesario para experimentos de validación del blanco.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de expresión proteica a partir de plantillas de ADN, lo que permite el análisis de respuesta a la dosis y cinético del rendimiento del circuito.
- Valor operativo: El formato estandarizado de TX-TL en tres tubos garantiza la reproducibilidad entre experimentos, facilitando la estandarización del ensayo para campañas de cribado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Permite explorar fenómenos biológicos y el ensamblaje de circuitos a gran escala en un sistema que refleja la dinámica celular endógena, mejorando la relevancia traslacional.
- Valor operativo: Proporciona extracto suficiente para hasta 3.000 reacciones a partir de una única preparación de cinco días, lo que posibilita el prototipado preclínico de alto rendimiento.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando una plataforma libre de células para evaluar la funcionalidad de circuitos genéticos antes de recurrir a modelos celulares o in vivo.
- Biología de Descubrimiento: Evalúa la regulación transcripcional y traduccional de circuitos sintéticos, facilitando la reducción mecanicista de riesgos en las hipótesis sobre dianas.
- Selección: Proporciona salidas cuantitativas de fluorescencia o luminiscencia en condiciones estandarizadas, posibilitando la evaluación comparativa de variantes de circuitos.
- Análisis: Ofrece mediciones de fluorescencia final y de la tasa máxima de producción de proteínas, permitiendo a los equipos evaluar la eficiencia de expresión y optimizar las condiciones.
- Investigación Traducional: Mantiene continuidad con la biología endógena de E. coli, facilitando la extrapolación a sistemas celulares para la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: La preparación centralizada de extractos crea un recurso de plataforma reutilizable, reduciendo el costo por experimento y posibilitando la estandarización entre proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al conservar las tasas nativas de degradación del ARNm y del ADN, reduciendo la ambigüedad mecanicista en el comportamiento del circuito.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de los pasos de clonación y crecimiento celular, simplificando el flujo de trabajo y acelerando la generación de datos.
- Valor estratégico: Permite decisiones más rápidas de avance o interrupción en objetivos de biología sintética mediante la prototipificación rápida de diseños en un sistema rentable.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo mediante pruebas de bajo costo y alta reproducibilidad de múltiples iteraciones de diseño.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de biología molecular y expresión proteica para la preparación y calibración de extractos.
- Depende del acceso a un homogeneizador de perlas, centrífuga y lector de placas para la lisis, clarificación y monitoreo de reacciones.
- Necesita la estandarización de las concentraciones de magnesio, potasio y DTT entre lotes para garantizar un rendimiento consistente del extracto.
- Debe tenerse en cuenta la variabilidad entre lotes en el rendimiento del extracto celular crudo, que generalmente oscila entre el 5 % y el 10 %, al planificar las escalas de reacción.
- Está limitado por la ventana de reacción de ocho horas, lo que puede requerir optimización para constructos de expresión lenta o circuitos regulados por ritmo circadiano.
