3.15: Ensayo de Quimiotaxis en C. elegans

El movimiento de una célula u organismo en respuesta a un estímulo químico es un comportamiento llamado quimiotaxis. En este vídeo, aprenderemos a realizar un ensayo de quimiotaxis utilizando el nematodo C. elegans. También discutiremos cómo se aplican los ensayos de quimiotaxis en C. elegans para estudiar el aprendizaje y la memoria, la adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer.

Hablemos primero de dos tipos diferentes de quimiotaxis. El movimiento hacia un estímulo químico se denomina quimiotaxis positiva. Por el contrario, el alejamiento de un estímulo químico se denomina quimiotaxis negativa, lo que permite a los organismos alejarse de las sustancias químicas nocivas.

La quimiotaxis puede ocurrir a nivel del organismo, a medida que los organismos se mueven hacia una fuente de alimento. La quimiotaxis también tiene lugar a nivel celular, dentro de los organismos. Por ejemplo, las células inmunitarias migran hacia patógenos o sitios de inflamación. En otro ejemplo, los espermatozoides se mueven hacia el óvulo en respuesta a un quimioatrayente liberado por el óvulo. La quimiotaxis también es un proceso importante durante el desarrollo, en el que las células migran en respuesta a un estímulo químico, formando tejidos y órganos en el organismo en desarrollo.

Para los C. elegans silvestres que habitan en el suelo, la quimiotaxis es importante para la detección y el movimiento hacia las bacterias, su principal fuente de alimento. Por el contrario, los C. elegans son repelidos por metales pesados, sustancias con un pH bajo y detergentes, que son tóxicos para el organismo.

Los ensayos de quimiotaxis suelen comenzar con la preparación de placas de quimiotaxis. Con una regla y un marcador, divida un plato de 5 cm con medio de crecimiento de nematodos en cuatro cuadrantes iguales. A continuación, dibuja un círculo con un radio de 0,5 cm alrededor del centro del cuadrante. Este será el punto de partida para los gusanos. Marque y etiquete un punto en cada cuadrante, de modo que cada punto sea equidistante del centro y entre sí.

Al preparar gusanos para el ensayo, es fundamental utilizar gusanos adultos jóvenes sincronizados con la edad para que las diferencias en la quimiotaxis no sean un artefacto de la etapa de desarrollo. Una vez que los gusanos estén sincronizados, recójalos pipeteando primero 2 ml de tampón S-basal en una placa que contenga adultos jóvenes. Gira e inclina el plato para lavar los gusanos del plato.

A continuación, pipetee la solución de gusano/S-basal en un tubo de microcentrífuga. Lave las lombrices centrifugando brevemente la solución de lombrices / S-basal, eliminando el sobrenadante y agregando otro mililitro de solución S-basal a la pelletza de lombrices. Invierta el tubo y repita el lavado dos veces más. Después del lavado, retire todo menos aproximadamente 100 μl de la solución S-basal. A continuación, agregue 2 μl de la mezcla de gusano / S basal a una placa NGM. Con un microscopio, cuente el número de gusanos presentes. Idealmente, habrá entre 50-250 gusanos por cada 2 μl de S-basal.

Ahora que las placas de quimiotaxis y los gusanos están listos, podemos comenzar con el ensayo de quimiotaxis. Primero, mezcle volúmenes iguales de su solución de prueba con azida de sodio 0.5 M, un anestésico que paralizará a los gusanos una vez que lleguen a su destino. Haga lo mismo con su solución de control. A continuación, pipetee 2 μl de mezcla de gusano / S basal en el centro de su placa de quimiotaxis. A continuación, pipetee 2 μl de la solución de prueba o control y colóquela en puntos debidamente marcados en la placa de quimiotaxis. Una vez que se hayan absorbido las soluciones de prueba y control, vuelva a colocar la tapa, invierta la placa y programe un temporizador durante 1 hora.

Después de que a los gusanos se les haya dado una hora para responder a los estímulos químicos en la placa, se pueden analizar los datos. Cuente manualmente el número de gusanos dentro de cada cuadrante. Si los gusanos se sienten atraídos por el producto problema, habrá más gusanos presentes en esos cuadrantes. Si son neutrales frente a ese producto químico, los gusanos estarán presentes en cada cuadrante por igual.

Utilice estos datos para calcular el índice quimiotáctico, que es el número de gusanos en los cuadrantes de prueba menos el número de gusanos en el cuadrante de control, dividido por el número total de gusanos. Un índice quimiotáctico cercano a +1 sugiere atracción, mientras que un índice quimiotáctico cercano a -1 indica repulsión.

Ahora que hemos aprendido a configurar un ensayo de quimiotaxis, echemos un vistazo a cómo se aplican estos experimentos para responder preguntas científicas.

Una de las formas en que se han aplicado los ensayos de quimiotaxis en C. elegans es para estudiar el aprendizaje y la memoria. Por ejemplo, los gusanos pueden ser condicionados para asociar un estímulo químico con una fuente de alimento. Los gusanos bien alimentados se matan de hambre durante una hora y luego se les acondiciona con comida, así como con un producto químico como la butanona.

A continuación, los gusanos se mantienen en un plato con comida, pero sin butanona. La realización de un ensayo de quimiotaxis determinará si los gusanos han aprendido a asociar la butanona con la comida. Se pueden realizar muchas variaciones de este experimento para determinar otra información, como qué genes o neuronas son importantes para el aprendizaje y la memoria.

La adaptación olfativa es un fenómeno que ocurre cuando las neuronas sensoriales disminuyen su respuesta a un estímulo con el tiempo, lo que permite que el animal responda a otros estímulos, posiblemente más importantes. Por ejemplo, C. elegans de tipo salvaje expuesto a un olor durante un período de tiempo, ignorará ese olor durante un ensayo de quimiotaxis debido a la adaptación olfativa, en lugar de sentirse atraído por él. Por lo tanto, se pueden realizar cribados genéticos de alto rendimiento para revelar los reguladores genéticos de la adaptación olfativa, como egl-4. Además, se pueden observar gusanos transgénicos que expresan proteínas marcadas con fluorescencia para detectar cambios en la localización durante la adaptación olfativa.

Por último, los ensayos de quimiotaxis se pueden utilizar en C. elegans para estudiar la enfermedad de Alzheimer. Los científicos pueden expresar el péptido beta amiloide humano marcado con fluorescencia, un sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer, en las neuronas de C. elegans. Curiosamente, los ensayos de quimiotaxis revelaron que los gusanos que expresan beta amiloide en una población de neuronas muestran una quimiotaxaxis reducida hacia un quimioatrayente en comparación con el control. Se podrían realizar muchas variaciones de este experimento, incluida la expresión de beta amiloide en otras poblaciones de neuronas o tejidos, o determinar si algún compuesto puede aliviar los efectos de la expresión de beta amiloide, lo que en última instancia conduce a una terapia potencial.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la quimiotaxis en C. elegans. En primer lugar, definimos qué es la quimiotaxis y por qué es importante en la naturaleza para los organismos y las células. Luego demostramos cómo realizar un ensayo de quimiotaxis con C. elegans. Finalmente, discutimos cómo se puede aplicar la quimiotaxis para comprender el aprendizaje y la memoria, la adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer. ¡Gracias por mirar!