Ensayo de Quimiotaxis en C. elegans
El movimiento de una célula u organismo como respuesta a un estímulo químico es un comportamiento llamado quimiotaxis. En este video vamos a aprender cómo realizar un ensayo de quimiotaxis utilizando el nematodo, C. elegans. También discutiremos cómo se aplican los ensayos de quimiotaxis en C. elegans para estudiar el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer.
Primero hablemos de dos tipos diferentes de quimiotaxis. Movimiento hacia un estímulo químico se llama chemotaxis positivos. Por el contrario, aleja de un estímulo químico se llama quimiotactismo negativo, permitiendo que organismos alejarse de productos químicos nocivos.
Quimiotaxis pueden ocurrir a nivel del organismo, como organismos moverse hacia una fuente de alimento. Quimiotaxis también ocurre a nivel celular, dentro de los organismos. Por ejemplo, las células inmunes migrarán hacia sitios de inflamación o patógenos. En otro ejemplo, células de la esperma se mueva hacia el huevo en respuesta a un quimio-atrayente por el huevo. Chemotaxis es también un proceso importante durante el desarrollo, en el que las células migran en respuesta a un estímulo químico, formación de tejidos y órganos en el organismo en desarrollo.
Para C. elegans salvajes, habitan en el suelo, chemotaxis es importante para la detección y el movimiento hacia las bacterias, su principal fuente de alimento. En contraste, C. elegans son repelidos por los metales pesados, sustancias con un pH bajo y detergentes, que son tóxicos para el organismo.
Ensayos de quimiotaxis típicamente comienzan preparando placas de quimiotaxis. Usando una regla y un marcador, una placa de 5 cm con medio de cultivo de nematodos se dividen en cuatro cuadrantes iguales. A continuación, dibuje un círculo con un radio de 0.5 cm alrededor del centro del cuadrante. Este será el punto de partida para los gusanos. Marca y marca un punto en cada cuadrante, tal que cada punto es equidistante del centro y unos de los otros.
Preparación de gusanos para el análisis, es fundamental usar gusanos adultos jóvenes edad sincronizado para que las diferencias en la quimiotaxis no son un artefacto de la etapa de desarrollo. Una vez que los gusanos están sincronizados, Colecciónalos por primera pipetear 2 ml de tampón S-basal en un plato con adultos jóvenes. Remolino e incline el plato para limpiar los gusanos de la placa.
A continuación, pipetear la solución gusano S-basal en un tubo de microcentrífuga. Lave los gusanos por brevemente centrifugar la solución gusano S-basal, retirar el sobrenadante y agregar otro mililitro de la solución S-basal a la pelotilla de gusano. Invertir el tubo y repetir el lavado dos veces más. Después de lavar, quitar todo pero aproximadamente 100 μl de la solución S-basal. A continuación, añadir 2 μl de la mezcla de gusano S-basal a una placa NGM. Utilizando un microscopio, contar el número de gusanos presentes. Lo ideal será entre 50-250 lombrices por 2 μl de S-basal.
Ahora que las placas de quimiotaxis y los gusanos están listos, nosotros podemos empezar en el ensayo de quimiotaxis. En primer lugar, mezclar volúmenes iguales de la solución de prueba con azida de sodio de 0,5 M, un anestésico que se paraliza los gusanos una vez que lleguen a su destino. Hacer lo mismo con la solución de control. A continuación, pipetear 2 μl de mezcla de gusano S-basal en el centro de su plato de quimiotaxis. Luego, tomar con pipeta 2 μl de la solución de prueba o de control y el lugar debidamente etiquetado puntos en la placa de quimiotaxis. Una vez que han sido absorbidas las soluciones de prueba y de control, volver a colocar la tapa, invertir la placa y ajuste un temporizador de 1 hora.
Después de que los gusanos han dado una hora para responder a los estímulos químicos sobre la placa, pueden analizarse los datos. Contar manualmente el número de gusanos dentro de cada cuadrante. Si los gusanos son atraídos a la sustancia de ensayo, habrá más gusanos presentes en los cuadrantes. Si son neutrales hacia ese producto químico, gusanos estará presentes en cada cuadrante igualmente.
Utilice estos datos para calcular el índice quimiotáctico, que es el número de gusanos en los cuadrantes de prueba menos el número de gusanos en el cuadrante de control, dividido por el número total de lombrices. Un índice quimiotáctico cerca de + 1 indica atracción, mientras que un índice quimiotáctico cerca de -1 indica repulsión.
Ahora que hemos aprendido a establecer un ensayo de quimiotaxis, echemos un vistazo a cómo se aplican estos experimentos para responder preguntas científicas.
Una de las formas se han aplicado los ensayos de quimiotaxis en C. elegans es para estudiar el aprendizaje y la memoria. Por ejemplo, gusanos pueden estar condicionados a asociar un estímulo químico a una fuente de alimento. Well-FED gusanos están hambrientos de una hora, y luego están condicionados con alimentos, así como un químico como butanona.
A continuación, los gusanos se llevan a cabo en un plato con comida, pero sin butanona. Ejecutar una voluntad de ensayo de quimiotaxis y determinar si los gusanos aprendieron a asociar butanona con alimentos. Muchas variaciones de este experimento pueden realizarse para determinar otra información como que los genes o las neuronas son importantes para el aprendizaje y la memoria.
Adaptación olfativa es un fenómeno que se produce cuando las neuronas sensoriales disminuyen su respuesta a un estímulo con el tiempo, permitiendo al animal responder a otros, posiblemente más importantes, estímulos. Por ejemplo, tipo salvaje C. elegans expuestos a un olor durante un período de tiempo, se ignoran ese olor durante un ensayo de quimiotaxis debido a la adaptación olfativa, en lugar de ser atraídos a él. Por lo tanto, se pueden realizar pantallas genéticas de alto rendimiento para revelar los reguladores genéticos de adaptación olfativa, como egl-4. Además, se observan gusanos transgénicos expresando proteínas fluorescencia de etiquetado para los cambios en la localización durante la adaptación olfatoria.
Por último, ensayos de quimiotaxis pueden utilizarse en C. elegans para estudiar la enfermedad de Alzheimer. Los científicos pueden expresar péptido beta amiloide humano etiquetado fluorescente - un rasgo distintivo de la enfermedad de Alzheimer - en las neuronas de C. elegans. Interesante, ensayos de quimiotaxis revelaron que gusanos expresando beta amiloide en una población de neuronas muestran quimiotaxis reducida a un quimio-atrayente en comparación con el control. Se podrían realizar muchas variaciones de este experimento, incluyendo expresar beta amiloideo en otras poblaciones de neuronas o tejidos, o para determinar si cualquier compuestos pueden aliviar los efectos de la expresión de beta amiloide, en última instancia conduce a una terapia potencial .
Sólo ha visto la introducción de Zeus quimiotaxis en C. elegans. En primer lugar, definimos qué chemotaxis es y por qué es importante en la naturaleza de los organismos y las células. Entonces demostramos cómo realizar un ensayo de quimiotaxis con C. elegans. Finalmente, discutimos cómo quimiotaxis pueden ser aplicado para entender el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer. ¡Gracias por ver!
Chemotaxis es un proceso en el que las células u organismos se mueven en respuesta a un estímulo químico. En la naturaleza, chemotaxis es importante p…
El movimiento de una célula u organismo como respuesta a un estímulo químico es un comportamiento llamado quimiotaxis. En este video vamos a aprender cómo realizar un ensayo de quimiotaxis utilizando el nematodo, C. elegans. También discutiremos cómo se aplican los ensayos de quimiotaxis en C. elegans para estudiar el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer.
Primero hablemos de dos tipos diferentes de quimiotaxis. Movimiento hacia un estímulo químico se llama chemotaxis positivos. Por el contrario, aleja de un estímulo químico se llama quimiotactismo negativo, permitiendo que organismos alejarse de productos químicos nocivos.
Quimiotaxis pueden ocurrir a nivel del organismo, como organismos moverse hacia una fuente de alimento. Quimiotaxis también ocurre a nivel celular, dentro de los organismos. Por ejemplo, las células inmunes migrarán hacia sitios de inflamación o patógenos. En otro ejemplo, células de la esperma se mueva hacia el huevo en respuesta a un quimio-atrayente por el huevo. Chemotaxis es también un proceso importante durante el desarrollo, en el que las células migran en respuesta a un estímulo químico, formación de tejidos y órganos en el organismo en desarrollo.
Para C. elegans salvajes, habitan en el suelo, chemotaxis es importante para la detección y el movimiento hacia las bacterias, su principal fuente de alimento. En contraste, C. elegans son repelidos por los metales pesados, sustancias con un pH bajo y detergentes, que son tóxicos para el organismo.
Ensayos de quimiotaxis típicamente comienzan preparando placas de quimiotaxis. Usando una regla y un marcador, una placa de 5 cm con medio de cultivo de nematodos se dividen en cuatro cuadrantes iguales. A continuación, dibuje un círculo con un radio de 0.5 cm alrededor del centro del cuadrante. Este será el punto de partida para los gusanos. Marca y marca un punto en cada cuadrante, tal que cada punto es equidistante del centro y unos de los otros.
Preparación de gusanos para el análisis, es fundamental usar gusanos adultos jóvenes edad sincronizado para que las diferencias en la quimiotaxis no son un artefacto de la etapa de desarrollo. Una vez que los gusanos están sincronizados, Colecciónalos por primera pipetear 2 ml de tampón S-basal en un plato con adultos jóvenes. Remolino e incline el plato para limpiar los gusanos de la placa.
A continuación, pipetear la solución gusano S-basal en un tubo de microcentrífuga. Lave los gusanos por brevemente centrifugar la solución gusano S-basal, retirar el sobrenadante y agregar otro mililitro de la solución S-basal a la pelotilla de gusano. Invertir el tubo y repetir el lavado dos veces más. Después de lavar, quitar todo pero aproximadamente 100 μl de la solución S-basal. A continuación, añadir 2 μl de la mezcla de gusano S-basal a una placa NGM. Utilizando un microscopio, contar el número de gusanos presentes. Lo ideal será entre 50-250 lombrices por 2 μl de S-basal.
Ahora que las placas de quimiotaxis y los gusanos están listos, nosotros podemos empezar en el ensayo de quimiotaxis. En primer lugar, mezclar volúmenes iguales de la solución de prueba con azida de sodio de 0,5 M, un anestésico que se paraliza los gusanos una vez que lleguen a su destino. Hacer lo mismo con la solución de control. A continuación, pipetear 2 μl de mezcla de gusano S-basal en el centro de su plato de quimiotaxis. Luego, tomar con pipeta 2 μl de la solución de prueba o de control y el lugar debidamente etiquetado puntos en la placa de quimiotaxis. Una vez que han sido absorbidas las soluciones de prueba y de control, volver a colocar la tapa, invertir la placa y ajuste un temporizador de 1 hora.
Después de que los gusanos han dado una hora para responder a los estímulos químicos sobre la placa, pueden analizarse los datos. Contar manualmente el número de gusanos dentro de cada cuadrante. Si los gusanos son atraídos a la sustancia de ensayo, habrá más gusanos presentes en los cuadrantes. Si son neutrales hacia ese producto químico, gusanos estará presentes en cada cuadrante igualmente.
Utilice estos datos para calcular el índice quimiotáctico, que es el número de gusanos en los cuadrantes de prueba menos el número de gusanos en el cuadrante de control, dividido por el número total de lombrices. Un índice quimiotáctico cerca de + 1 indica atracción, mientras que un índice quimiotáctico cerca de -1 indica repulsión.
Ahora que hemos aprendido a establecer un ensayo de quimiotaxis, echemos un vistazo a cómo se aplican estos experimentos para responder preguntas científicas.
Una de las formas se han aplicado los ensayos de quimiotaxis en C. elegans es para estudiar el aprendizaje y la memoria. Por ejemplo, gusanos pueden estar condicionados a asociar un estímulo químico a una fuente de alimento. Well-FED gusanos están hambrientos de una hora, y luego están condicionados con alimentos, así como un químico como butanona.
A continuación, los gusanos se llevan a cabo en un plato con comida, pero sin butanona. Ejecutar una voluntad de ensayo de quimiotaxis y determinar si los gusanos aprendieron a asociar butanona con alimentos. Muchas variaciones de este experimento pueden realizarse para determinar otra información como que los genes o las neuronas son importantes para el aprendizaje y la memoria.
Adaptación olfativa es un fenómeno que se produce cuando las neuronas sensoriales disminuyen su respuesta a un estímulo con el tiempo, permitiendo al animal responder a otros, posiblemente más importantes, estímulos. Por ejemplo, tipo salvaje C. elegans expuestos a un olor durante un período de tiempo, se ignoran ese olor durante un ensayo de quimiotaxis debido a la adaptación olfativa, en lugar de ser atraídos a él. Por lo tanto, se pueden realizar pantallas genéticas de alto rendimiento para revelar los reguladores genéticos de adaptación olfativa, como egl-4. Además, se observan gusanos transgénicos expresando proteínas fluorescencia de etiquetado para los cambios en la localización durante la adaptación olfatoria.
Por último, ensayos de quimiotaxis pueden utilizarse en C. elegans para estudiar la enfermedad de Alzheimer. Los científicos pueden expresar péptido beta amiloide humano etiquetado fluorescente - un rasgo distintivo de la enfermedad de Alzheimer - en las neuronas de C. elegans. Interesante, ensayos de quimiotaxis revelaron que gusanos expresando beta amiloide en una población de neuronas muestran quimiotaxis reducida a un quimio-atrayente en comparación con el control. Se podrían realizar muchas variaciones de este experimento, incluyendo expresar beta amiloideo en otras poblaciones de neuronas o tejidos, o para determinar si cualquier compuestos pueden aliviar los efectos de la expresión de beta amiloide, en última instancia conduce a una terapia potencial .
Sólo ha visto la introducción de Zeus quimiotaxis en C. elegans. En primer lugar, definimos qué chemotaxis es y por qué es importante en la naturaleza de los organismos y las células. Entonces demostramos cómo realizar un ensayo de quimiotaxis con C. elegans. Finalmente, discutimos cómo quimiotaxis pueden ser aplicado para entender el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer. ¡Gracias por ver!
Iniciar sesión o para acceder al contenido completo. Obtenga más información sobre el acceso de su institución al contenido de JoVE aquí
El movimiento de una célula u organismo como respuesta a un estímulo químico es un comportamiento llamado quimiotaxis. En este video vamos a aprender cómo realizar un ensayo de quimiotaxis utilizando el nematodo, C. elegans. También discutiremos cómo se aplican los ensayos de quimiotaxis en C. elegans para estudiar el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer.
Primero hablemos de dos tipos diferentes de quimiotaxis. Movimiento hacia un estímulo químico se llama chemotaxis positivos. Por el contrario, aleja de un estímulo químico se llama quimiotactismo negativo, permitiendo que organismos alejarse de productos químicos nocivos.
Quimiotaxis pueden ocurrir a nivel del organismo, como organismos moverse hacia una fuente de alimento. Quimiotaxis también ocurre a nivel celular, dentro de los organismos. Por ejemplo, las células inmunes migrarán hacia sitios de inflamación o patógenos. En otro ejemplo, células de la esperma se mueva hacia el huevo en respuesta a un quimio-atrayente por el huevo. Chemotaxis es también un proceso importante durante el desarrollo, en el que las células migran en respuesta a un estímulo químico, formación de tejidos y órganos en el organismo en desarrollo.
Para C. elegans salvajes, habitan en el suelo, chemotaxis es importante para la detección y el movimiento hacia las bacterias, su principal fuente de alimento. En contraste, C. elegans son repelidos por los metales pesados, sustancias con un pH bajo y detergentes, que son tóxicos para el organismo.
Ensayos de quimiotaxis típicamente comienzan preparando placas de quimiotaxis. Usando una regla y un marcador, una placa de 5 cm con medio de cultivo de nematodos se dividen en cuatro cuadrantes iguales. A continuación, dibuje un círculo con un radio de 0.5 cm alrededor del centro del cuadrante. Este será el punto de partida para los gusanos. Marca y marca un punto en cada cuadrante, tal que cada punto es equidistante del centro y unos de los otros.
Preparación de gusanos para el análisis, es fundamental usar gusanos adultos jóvenes edad sincronizado para que las diferencias en la quimiotaxis no son un artefacto de la etapa de desarrollo. Una vez que los gusanos están sincronizados, Colecciónalos por primera pipetear 2 ml de tampón S-basal en un plato con adultos jóvenes. Remolino e incline el plato para limpiar los gusanos de la placa.
A continuación, pipetear la solución gusano S-basal en un tubo de microcentrífuga. Lave los gusanos por brevemente centrifugar la solución gusano S-basal, retirar el sobrenadante y agregar otro mililitro de la solución S-basal a la pelotilla de gusano. Invertir el tubo y repetir el lavado dos veces más. Después de lavar, quitar todo pero aproximadamente 100 μl de la solución S-basal. A continuación, añadir 2 μl de la mezcla de gusano S-basal a una placa NGM. Utilizando un microscopio, contar el número de gusanos presentes. Lo ideal será entre 50-250 lombrices por 2 μl de S-basal.
Ahora que las placas de quimiotaxis y los gusanos están listos, nosotros podemos empezar en el ensayo de quimiotaxis. En primer lugar, mezclar volúmenes iguales de la solución de prueba con azida de sodio de 0,5 M, un anestésico que se paraliza los gusanos una vez que lleguen a su destino. Hacer lo mismo con la solución de control. A continuación, pipetear 2 μl de mezcla de gusano S-basal en el centro de su plato de quimiotaxis. Luego, tomar con pipeta 2 μl de la solución de prueba o de control y el lugar debidamente etiquetado puntos en la placa de quimiotaxis. Una vez que han sido absorbidas las soluciones de prueba y de control, volver a colocar la tapa, invertir la placa y ajuste un temporizador de 1 hora.
Después de que los gusanos han dado una hora para responder a los estímulos químicos sobre la placa, pueden analizarse los datos. Contar manualmente el número de gusanos dentro de cada cuadrante. Si los gusanos son atraídos a la sustancia de ensayo, habrá más gusanos presentes en los cuadrantes. Si son neutrales hacia ese producto químico, gusanos estará presentes en cada cuadrante igualmente.
Utilice estos datos para calcular el índice quimiotáctico, que es el número de gusanos en los cuadrantes de prueba menos el número de gusanos en el cuadrante de control, dividido por el número total de lombrices. Un índice quimiotáctico cerca de + 1 indica atracción, mientras que un índice quimiotáctico cerca de -1 indica repulsión.
Ahora que hemos aprendido a establecer un ensayo de quimiotaxis, echemos un vistazo a cómo se aplican estos experimentos para responder preguntas científicas.
Una de las formas se han aplicado los ensayos de quimiotaxis en C. elegans es para estudiar el aprendizaje y la memoria. Por ejemplo, gusanos pueden estar condicionados a asociar un estímulo químico a una fuente de alimento. Well-FED gusanos están hambrientos de una hora, y luego están condicionados con alimentos, así como un químico como butanona.
A continuación, los gusanos se llevan a cabo en un plato con comida, pero sin butanona. Ejecutar una voluntad de ensayo de quimiotaxis y determinar si los gusanos aprendieron a asociar butanona con alimentos. Muchas variaciones de este experimento pueden realizarse para determinar otra información como que los genes o las neuronas son importantes para el aprendizaje y la memoria.
Adaptación olfativa es un fenómeno que se produce cuando las neuronas sensoriales disminuyen su respuesta a un estímulo con el tiempo, permitiendo al animal responder a otros, posiblemente más importantes, estímulos. Por ejemplo, tipo salvaje C. elegans expuestos a un olor durante un período de tiempo, se ignoran ese olor durante un ensayo de quimiotaxis debido a la adaptación olfativa, en lugar de ser atraídos a él. Por lo tanto, se pueden realizar pantallas genéticas de alto rendimiento para revelar los reguladores genéticos de adaptación olfativa, como egl-4. Además, se observan gusanos transgénicos expresando proteínas fluorescencia de etiquetado para los cambios en la localización durante la adaptación olfatoria.
Por último, ensayos de quimiotaxis pueden utilizarse en C. elegans para estudiar la enfermedad de Alzheimer. Los científicos pueden expresar péptido beta amiloide humano etiquetado fluorescente - un rasgo distintivo de la enfermedad de Alzheimer - en las neuronas de C. elegans. Interesante, ensayos de quimiotaxis revelaron que gusanos expresando beta amiloide en una población de neuronas muestran quimiotaxis reducida a un quimio-atrayente en comparación con el control. Se podrían realizar muchas variaciones de este experimento, incluyendo expresar beta amiloideo en otras poblaciones de neuronas o tejidos, o para determinar si cualquier compuestos pueden aliviar los efectos de la expresión de beta amiloide, en última instancia conduce a una terapia potencial .
Sólo ha visto la introducción de Zeus quimiotaxis en C. elegans. En primer lugar, definimos qué chemotaxis es y por qué es importante en la naturaleza de los organismos y las células. Entonces demostramos cómo realizar un ensayo de quimiotaxis con C. elegans. Finalmente, discutimos cómo quimiotaxis pueden ser aplicado para entender el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer. ¡Gracias por ver!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between positive and negative chemotaxis?
Positive chemotaxis is movement toward a chemical stimulus, while negative chemotaxis is movement away from it. Organisms use positive chemotaxis to move toward food sources or beneficial stimuli. Negative chemotaxis allows organisms to avoid harmful chemicals like heavy metals, acidic substances, or detergents that may be toxic.
Q2: Why is age synchronization important when preparing C. elegans for a chemotaxis assay?
Age synchronization ensures all worms are at the same developmental stage, preventing differences in chemotaxis behavior from being artifacts of development rather than true responses to chemical stimuli. Using young adult worms of uniform age provides consistent, reliable data for accurate experimental results and supports studies of development and reproduction caenorhabditis elegans.
Q3: How is the chemotactic index calculated and what do the values indicate?
The chemotactic index equals the number of worms in test quadrants minus worms in control quadrants, divided by total worms. A value close to +1 indicates strong attraction to the test chemical, while a value close to -1 indicates repulsion. Values near zero suggest the worms are neutral toward that chemical stimulus.
Q4: What role does sodium azide play in a C. elegans chemotaxis assay?
Sodium azide is an anesthetic mixed with test and control solutions at 0.5 M concentration. When worms reach their destination on the chemotaxis plate, sodium azide paralyzes them, allowing researchers to count their final positions accurately without worms continuing to move during data collection.
Q5: How can chemotaxis assays be used to study learning and memory in C. elegans?
Researchers condition starved worms by pairing a chemical stimulus like butanone with food. Worms are then placed on plates with food but without the chemical. A chemotaxis assay determines whether worms learned to associate the chemical with food, revealing genetic and neuronal mechanisms underlying learning and memory formation.
Q6: What is olfactory adaptation and how does it affect chemotaxis assay results?
Olfactory adaptation occurs when sensory neurons decrease their response to a stimulus over time, allowing animals to focus on other stimuli. Wild-type C. elegans exposed to an odor will ignore it during a chemotaxis assay due to olfactory adaptation rather than being attracted to it, enabling genetic screens to identify regulatory genes like egl-4.
Q7: How do chemotaxis assays help researchers study Alzheimer's disease using C. elegans?
Scientists express fluorescently tagged human amyloid beta peptide, a hallmark of Alzheimer's disease, in C. elegans neurons. Chemotaxis assays reveal that worms expressing amyloid beta show reduced chemotaxis toward chemo-attractants compared to controls, providing insights into how the disease affects neural function and potential therapeutic interventions.
Capítulos en este video
0:00
Introduction to Nematode Chemotaxis
0:38
Chemotaxis: The Concept.
2:03
Preparing for a C. elegans Chemotaxis Assay
3:56
Running the Chemotaxis Assay
4:49
Analyzing Chemotaxis Data
5:41
Applications
8:18
Summary