Ensayo de Quimiotaxis en C. elegans

<em>C. elegans</em> Chemotaxis Assay

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Chemotaxis Assay

3.9: C. elegans Development and Reproduction

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08:57 min

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April 30, 2023

Overview

Chemotaxis es un proceso en el que las células u organismos se mueven en respuesta a un estímulo químico. En la naturaleza, chemotaxis es importante para organismos percibir y moverse hacia fuentes de alimento y alejarse de los estímulos que pueden ser tóxicos o perjudiciales. Quimiotaxis también es importante a nivel celular. Por ejemplo, quimiotaxis se requiere para el movimiento de los espermatozoides hacia el óvulo antes de la fertilización. En el laboratorio, quimiotaxis se examinan con frecuencia en el nematodo, C. elegans, que se conoce a migrar hacia fuentes de alimento en el suelo, pero lejos de las toxinas tales como metales pesados, sustancias con un pH bajo y detergentes. Este video muestra cómo realizar un ensayo de quimiotaxis, que incluye la preparación de las placas de quimiotaxis y los gusanos, ejecutando el análisis y análisis de los datos. A continuación, se discuten ejemplos de cómo ensayos de quimiotaxis pueden ser utilizados en C. elegans como una herramienta para entender el aprendizaje y la memoria, la adaptación olfativa y enfermedades neurológicas como el Alzheimer “enfermedad. Experimentos de quimiotaxis en C. elegans tienen cerca de ilimitadas posibilidades para aprender más sobre los mecanismos celulares y genéticos de muchos procesos biológicos y pueden conducir a una mayor comprensión de la biología humana, el desarrollo y la enfermedad.

Procedure

El movimiento de una célula u organismo como respuesta a un estímulo químico es un comportamiento llamado quimiotaxis. En este video vamos a aprender cómo realizar un ensayo de quimiotaxis utilizando el nematodo, C. elegans. También discutiremos cómo se aplican los ensayos de quimiotaxis en C. elegans para estudiar el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer.

Primero hablemos de dos tipos diferentes de quimiotaxis. Movimiento hacia un estímulo químico se llama chemotaxis positivos. Por el contrario, aleja de un estímulo químico se llama quimiotactismo negativo, permitiendo que organismos alejarse de productos químicos nocivos.

Quimiotaxis pueden ocurrir a nivel del organismo, como organismos moverse hacia una fuente de alimento. Quimiotaxis también ocurre a nivel celular, dentro de los organismos. Por ejemplo, las células inmunes migrarán hacia sitios de inflamación o patógenos. En otro ejemplo, células de la esperma se mueva hacia el huevo en respuesta a un quimio-atrayente por el huevo. Chemotaxis es también un proceso importante durante el desarrollo, en el que las células migran en respuesta a un estímulo químico, formación de tejidos y órganos en el organismo en desarrollo.

Para C. elegans salvajes, habitan en el suelo, chemotaxis es importante para la detección y el movimiento hacia las bacterias, su principal fuente de alimento. En contraste, C. elegans son repelidos por los metales pesados, sustancias con un pH bajo y detergentes, que son tóxicos para el organismo.

Ensayos de quimiotaxis típicamente comienzan preparando placas de quimiotaxis. Usando una regla y un marcador, una placa de 5 cm con medio de cultivo de nematodos se dividen en cuatro cuadrantes iguales. A continuación, dibuje un círculo con un radio de 0.5 cm alrededor del centro del cuadrante. Este será el punto de partida para los gusanos. Marca y marca un punto en cada cuadrante, tal que cada punto es equidistante del centro y unos de los otros.

Preparación de gusanos para el análisis, es fundamental usar gusanos adultos jóvenes edad sincronizado para que las diferencias en la quimiotaxis no son un artefacto de la etapa de desarrollo. Una vez que los gusanos están sincronizados, Colecciónalos por primera pipetear 2 ml de tampón S-basal en un plato con adultos jóvenes. Remolino e incline el plato para limpiar los gusanos de la placa.

A continuación, pipetear la solución gusano S-basal en un tubo de microcentrífuga. Lave los gusanos por brevemente centrifugar la solución gusano S-basal, retirar el sobrenadante y agregar otro mililitro de la solución S-basal a la pelotilla de gusano. Invertir el tubo y repetir el lavado dos veces más. Después de lavar, quitar todo pero aproximadamente 100 μl de la solución S-basal. A continuación, añadir 2 μl de la mezcla de gusano S-basal a una placa NGM. Utilizando un microscopio, contar el número de gusanos presentes. Lo ideal será entre 50-250 lombrices por 2 μl de S-basal.

Ahora que las placas de quimiotaxis y los gusanos están listos, nosotros podemos empezar en el ensayo de quimiotaxis. En primer lugar, mezclar volúmenes iguales de la solución de prueba con azida de sodio de 0,5 M, un anestésico que se paraliza los gusanos una vez que lleguen a su destino. Hacer lo mismo con la solución de control. A continuación, pipetear 2 μl de mezcla de gusano S-basal en el centro de su plato de quimiotaxis. Luego, tomar con pipeta 2 μl de la solución de prueba o de control y el lugar debidamente etiquetado puntos en la placa de quimiotaxis. Una vez que han sido absorbidas las soluciones de prueba y de control, volver a colocar la tapa, invertir la placa y ajuste un temporizador de 1 hora.

Después de que los gusanos han dado una hora para responder a los estímulos químicos sobre la placa, pueden analizarse los datos. Contar manualmente el número de gusanos dentro de cada cuadrante. Si los gusanos son atraídos a la sustancia de ensayo, habrá más gusanos presentes en los cuadrantes. Si son neutrales hacia ese producto químico, gusanos estará presentes en cada cuadrante igualmente.

Utilice estos datos para calcular el índice quimiotáctico, que es el número de gusanos en los cuadrantes de prueba menos el número de gusanos en el cuadrante de control, dividido por el número total de lombrices. Un índice quimiotáctico cerca de + 1 indica atracción, mientras que un índice quimiotáctico cerca de -1 indica repulsión.

Ahora que hemos aprendido a establecer un ensayo de quimiotaxis, echemos un vistazo a cómo se aplican estos experimentos para responder preguntas científicas.

Una de las formas se han aplicado los ensayos de quimiotaxis en C. elegans es para estudiar el aprendizaje y la memoria. Por ejemplo, gusanos pueden estar condicionados a asociar un estímulo químico a una fuente de alimento. Well-FED gusanos están hambrientos de una hora, y luego están condicionados con alimentos, así como un químico como butanona.

A continuación, los gusanos se llevan a cabo en un plato con comida, pero sin butanona. Ejecutar una voluntad de ensayo de quimiotaxis y determinar si los gusanos aprendieron a asociar butanona con alimentos. Muchas variaciones de este experimento pueden realizarse para determinar otra información como que los genes o las neuronas son importantes para el aprendizaje y la memoria.

Adaptación olfativa es un fenómeno que se produce cuando las neuronas sensoriales disminuyen su respuesta a un estímulo con el tiempo, permitiendo al animal responder a otros, posiblemente más importantes, estímulos. Por ejemplo, tipo salvaje C. elegans expuestos a un olor durante un período de tiempo, se ignoran ese olor durante un ensayo de quimiotaxis debido a la adaptación olfativa, en lugar de ser atraídos a él. Por lo tanto, se pueden realizar pantallas genéticas de alto rendimiento para revelar los reguladores genéticos de adaptación olfativa, como egl-4. Además, se observan gusanos transgénicos expresando proteínas fluorescencia de etiquetado para los cambios en la localización durante la adaptación olfatoria.

Por último, ensayos de quimiotaxis pueden utilizarse en C. elegans para estudiar la enfermedad de Alzheimer. Los científicos pueden expresar péptido beta amiloide humano etiquetado fluorescente – un rasgo distintivo de la enfermedad de Alzheimer – en las neuronas de C. elegans. Interesante, ensayos de quimiotaxis revelaron que gusanos expresando beta amiloide en una población de neuronas muestran quimiotaxis reducida a un quimio-atrayente en comparación con el control. Se podrían realizar muchas variaciones de este experimento, incluyendo expresar beta amiloideo en otras poblaciones de neuronas o tejidos, o para determinar si cualquier compuestos pueden aliviar los efectos de la expresión de beta amiloide, en última instancia conduce a una terapia potencial .

Sólo ha visto la introducción de Zeus quimiotaxis en C. elegans. En primer lugar, definimos qué chemotaxis es y por qué es importante en la naturaleza de los organismos y las células. Entonces demostramos cómo realizar un ensayo de quimiotaxis con C. elegans. Finalmente, discutimos cómo quimiotaxis pueden ser aplicado para entender el aprendizaje y memoria, adaptación olfativa y la enfermedad de Alzheimer. ¡Gracias por ver!

Transcript

The movement of a cell or organism in response to a chemical stimulus is a behavior called chemotaxis. In this video, we will learn how to perform a chemotaxis assay using the nematode, C. elegans. We will also discuss how chemotaxis assays in C. elegans are applied to study learning and memory, olfactory adaptation, and Alzheimer’s disease.

Let’s first discuss two different types of chemotaxis. Movement toward a chemical stimulus is called positive chemotaxis. In contrast, movement away from a chemical stimulus is called negative chemotaxis, allowing organisms to move away from harmful chemicals.

Chemotaxis can occur at the organismal level, as organisms move toward a food source. Chemotaxis also takes place at the cellular level, within organisms. For example, immune cells migrate toward pathogens or sites of inflammation. In another example, sperm cells move toward the egg in response to a chemo-attractant released by the egg. Chemotaxis is also an important process during development, in which cells migrate in response to a chemical stimulus, forming tissues and organs in the developing organism.

For wild, soil-dwelling C. elegans, chemotaxis is important for detection and movement toward bacteria, their main food source. In contrast, C. elegans are repelled by heavy metals, substances with a low pH, and detergents, which are toxic to the organism.

Chemotaxis assays typically begin by preparing chemotaxis plates. Using a ruler and a marker, divide a 5 cm plate with nematode growth medium into four equal quadrants. Then, draw a circle with a 0.5 cm radius around the center of the quadrant. This will be the starting point for the worms. Mark and label a point in each quadrant, such that each point is equidistant from the center, and from each other.

When preparing worms for the assay, it’s critical to use age synchronized young adult worms so that differences in chemotaxis are not an artifact of the developmental stage. Once worms are synchronized, collect them by first pipetting 2 ml of S-basal buffer onto a plate containing young adults. Swirl and tilt the dish to wash the worms from the plate.

Next, pipette the worm/S-basal solution into a microcentrifuge tube. Wash the worms by briefly centrifuging the worm/S-basal solution, removing the supernatant, and adding another milliliter of S-basal solution to the worm pellet. Invert the tube and repeat the wash two more times. After washing, remove all but approximately 100 μl of the S-basal solution. Next, add 2 μl of the worm/S-basal mixture to an NGM plate. Using a microscope, count the number of worms present. Ideally, there will be between 50-250 worms per 2 μl of S-basal.

Now that the chemotaxis plates and the worms are ready, we can get started on the chemotaxis assay. First, mix equal volumes of your test solution with 0.5 M sodium azide, an anesthetic that will paralyze worms once they reach their destination. Do the same with your control solution. Next, pipette 2 μl of worm/S-basal mixture onto the center of your chemotaxis plate. Then, pipette 2 μl of the test or control solution and place on appropriately labeled points on the chemotaxis plate. Once the test and control solutions have been absorbed, place the lid back on, invert the plate, and set a timer for 1 hour.

After the worms have been given one hour to respond to the chemical stimuli on the plate, the data can be analyzed. Manually count the number of worms within each quadrant. If the worms are attracted to the test chemical, there will be more worms present in those quadrants. If they are neutral towards that chemical, worms will be present in each quadrant equally.

Use these data to calculate the chemotactic index, which is the number of worms in the test quadrants minus the number of worms in the control quadrant, divided by the total number of worms. A chemotactic index close to +1 suggests attraction, while a chemotactic index close to -1 indicates repulsion.

Now that we’ve learned how to set up a chemotaxis assay, let’s have a look at how these experiments are applied to answer scientific questions.

One of the ways chemotaxis assays in C. elegans have been applied is for studying learning and memory. For example, worms can be conditioned to associate a chemical stimulus with a food source. Well-fed worms are starved for one hour, and then they are conditioned with food, as well as a chemical such as butanone.

Next, the worms are held on a plate with food, but without butanone. Running a chemotaxis assay will then determine whether the worms have learned to associate butanone with food. Many variations of this experiment can be performed to determine other information such as which genes or neurons are important for learning and memory.

Olfactory adaptation is a phenomenon that occurs when sensory neurons decrease their response to a stimulus over time, allowing the animal to respond to other, possibly more important, stimuli. For example, wild-type C. elegans exposed to an odor for a period of time, will ignore that odor during a chemotaxis assay due to olfactory adaptation, rather than be attracted to it. Therefore, high throughput genetic screens can be performed to reveal the genetic regulators of olfactory adaptation, such as egl-4. Additionally, transgenic worms expressing fluorescently tagged proteins can be observed for changes in localization during olfactory adaptation.

Finally, chemotaxis assays can be used in C. elegans to study Alzheimer’s disease. Scientists can express fluorescently tagged human amyloid beta peptide – a hallmark of Alzheimer’s disease – in the neurons of C. elegans. Interestingly, chemotaxis assays revealed that worms expressing amyloid beta in a population of neurons show reduced chemotaxis towards a chemo-attractant compared to the control. Many variations of this experiment could be performed, including expressing amyloid beta in other neuron populations or tissues, or determining whether any compounds can alleviate the effects of amyloid beta expression, ultimately leading to a potential therapy.

You’ve just watched JoVE’s introduction to chemotaxis in C. elegans. First, we defined what chemotaxis is and why it is important in nature for organisms and cells. Then we demonstrated how to perform a chemotaxis assay with C. elegans. Finally, we discussed how chemotaxis can be applied to understand learning and memory, olfactory adaptation, and Alzheimer’s disease. Thanks for watching!

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