Mantenimiento de C. elegans

<em>C. elegans</em> Maintenance

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Maintenance

3.3: An Introduction to Caenorhabditis elegans

3.13: Yeast Transformation and Cloning

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10:54 min

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April 30, 2023

Overview

Ceanorhabditis elegans ha sido y sigue siendo, utilizado con gran éxito como un organismo modelo para el estudio de una variedad de fenómenos de desarrollo, genéticos, moleculares y físicas. Para uso de C. elegans a su potencial completo, cuidado y atención para el mantenimiento básico de este poderoso organismo es esencial.

En este video aprenderás la vivienda básica y alimentación requisitos de C. elegans, cómo manejar y manipular usando una selección de gusano gusanos correctamente y cómo congelar y recuperar las poblaciones de gusano importante. Hacia el final del video se visitarán algunas aplicaciones de la modificación de la vivienda, alimentación y manipulación de estos importantes animales.

Procedure

Correcto cuidado y mantenimiento de Caenorhabditis elegans es esencial para los experimentos exitosos.

Requieren muy poco espacio, son baratos a casa, tienen alta fecundidad y son fáciles de manipular. Pero sólo porque son sencillas para todo no significa ciencia wimpy. De hecho, Sydney Brenner llamó C. elegans &quo; regalo de la naturaleza a la ciencia, &quo; y desde su introducción en 1974 el gusano ha aparecido en un número de premio Nobel ganador experimentos.

En este video demostramos métodos básicos para el mantenimiento de C. elegans en el laboratorio, incluyendo: vivienda y alimentación, manejo, así como la congelación y descongelación de gusanos.

En la naturaleza, C. elegans se encontró en el suelo y alimentarse de materia vegetal en descomposición. En el laboratorio, es importante tener nematodos tan feliz como sea posible, y tan de la casa y alimentarlos con métodos muy específicos.

C. elegans puede ser crecido en 16, 20 o 25 ° C dependiendo de los requisitos del experimento, y o bien cultivarse sólido o en medios líquidos. En ambos casos se alimentan OP50, una cepa estandarizada de e. coli utilizada específicamente para la cultura Nematoda en cada laboratorio del gusano del mundo.

Cuando se cultiva a 25 ° C, C. elegans complete su ciclo de vida 2.1 veces más rápido que cuando crecido a 16 ° C. Un ciclo de vida más rápido significa que los gusanos maduran más rápidos, endecha huevos más y consuman más alimentos. Si los gusanos se les permite morir de hambre o ser demasiado lleno de gente entran en un estado larvario llamado la etapa de dauer. Las larvas de Dauer son resistentes al estrés y no envejecen.

Cuando se mantiene en medio sólido, C. elegans se cultivan en placas de agar con NGM medios o medios de cultivo de nematodos. El día antes de hacer placas, inocular medio LB líquido con una sola Colonia de OP50 E. coli. Incubar los medios a 37 ° C durante la noche con agitación.

Medios sólidos, medida y las cantidades adecuadas de estos ingredientes se combinan con agua desionizada en un matraz Erlenmeyer.

Después de la esterilización en autoclave durante al menos 15 minutos, deje enfriar el agar hasta 55 ° C en un baño de agua. Una vez que los medios de comunicación se enfríe a 55 ° C debe ser capaz de sostener cómodamente el recipiente de vidrio con las manos desnudas. Utilizando una técnica aséptica adecuada, aditivos como medicamentos o antibióticos pueden añadirse en este momento. Agite para mezclar. Entonces, pipetear NGM fundido en placas de Petri hasta que queden 2/3 completo. Deje las placas recién hechas secar en el Banco durante la noche.

A la mañana siguiente pellets OP50 a 3500 x g durante 10 minutos y luego resuspender las bacterias en medio LB a una concentración de X 10. Ahora, pipetear un césped central en cada plato. Evite tocar la punta de la pipeta a la superficie de la NGM y tenga cuidado de no permitir que la cultura que toque las paredes de la placa. Dejar las placas se sequen en el Banco durante la noche. Una vez seco, exponer las placas a la luz UV para esterilizarlas. Ahora están listos para ser usados cuando el cultivo de lombrices.

C. elegans son manipulados individualmente utilizando una herramienta conocida como el pico de gusano. La selección es por lo general se hace de 30 calibre 90% platino y 10% iridio hilo, aunque algunos investigadores prefieren ligeramente diferentes composiciones de metal. Para hacer una selección, empezar por romper la punta de una pipeta de Pasteur a la longitud preferida.

Cortar unos 3 a 4 cm de alambre y coloque 0.5 cm de la misma dentro de la punta de la pipeta. Sellar el cable con el vidrio sobre un mechero de Bunsen. La longitud del alambre que sobresale del cristal es de unos 3 a 3.5 cm pero puede variar según las preferencias individuales.

Aplanar el extremo del alambre con un borde duro. Luego doblar la parte aplanada hacia arriba para formar una bola. Por último, lije los bordes de la hoja para evitar dañar el gusano o el agar.

A recoger gusanos esterilización el alambre de la hoja de una llama. Luego cubra la punta con grueso, pegajoso OP50 Escherichia coli de una placa NGM. Tenga cuidado de no perfore o cicatriz de la superficie del agar.

Mientras mira a través de un alcance de disección, sacar ligeramente el gusano en el pico aplanado, pegajoso hasta que el gusano se adhiere a la selección.

Una vez que el gusano está en la selección, transferencia inmediatamente ligeramente manteniendo la punta a la nueva superficie de una placa nueva y deslice sobre el césped bacteriano. El gusano debe arrastrarse fuera de la selección. El gusano no debe permanecer en la selección durante demasiado tiempo o puede secar.

Una de las razones por las C. elegans es un modelo popular para la investigación es porque las culturas se pueden almacenar por largos períodos de tiempo sin efectos adversos.

En primer lugar, larvas de lavado recién muerto de hambre con 0,5 ml Buffer M9, agitar suavemente para aflojar todos los animales adultos y larva y luego transferirse a una criotubo microcentrífuga. Luego, añadir igual cantidad 30% de glicerol en Buffer M9. Finalmente, embale el frasco en una caja aislada y conservar a-80 ° C.

Para recuperar los gusanos, retire el tubo de un congelador de-80 y dejar descongelar a temperatura ambiente hasta que el contenido completo del derretimiento. Pipeta el líquido en un plato fresco de NGM con césped OP50 e incubar a 20 ° C. Después de 2-3 días, transferir 10-15 animales a una nueva placa y que puedan reproducirse de una generación. Recoger la progenie y la puntuación para corregir fenotipos.

Ahora que hemos visto cómo C. elegans se mantiene en el laboratorio, vamos a echar un vistazo a como alimentación, vivienda y el manejo de las condiciones se modifican para experimentos.

El Premio Nobel ganador descubrimiento de interferencia del ARN permitió investigadores silenciar cualquier gen C. elegans para determinar su función.

Podemos inducir RNAi en la C. elegans por primeras placas preparación con e. coli que expresan objetivo gene dsRNA, que comen los gusanos.

4 º estado larvario gusanos se transfiere a las placas de RNAi y permitió a poner huevos. En el escenario deseado de desarrollo de la progenie se recogen y se anotó para fenotipos. Puesto que compartimos alrededor de la mitad de nuestro genoma con el gusano muchas de las ideas obtenidas son aplicables a enfermedades humanas.

Debido a su rápido ciclo de vida, C. elegans es particularmente idóneo como un modelo de envejecimiento.

En primer lugar, se genera una población tiempo-sincronizado de C. elegans , al permitir que adultos hermafroditas desovar en las placas de NGM. Los gusanos ponen huevos durante 6-8 h y luego se retiran.

Cuando los gusanos se encuentran en la etapa deseada ellos son transferidos a nuevas placas, NGM con ampicilina para prevenir la contaminación bacteriana y FUDR para evitar la reproducción.

Desde este punto hacia adelante los gusanos adultos se observan cada 2-3 días hasta que los gusanos han muerto. Gusanos muertos se retiran de la placa y se registró el número de gusanos vivos y muertos.

Análisis de vida útil en el contexto de insultos genéticos o ambientales pueden producir conocimientos significativos en el proceso de envejecimiento.

Con láseres es posible realizar el corte de los axones individuales, o axotomies en C. elegans para estudiar cómo regenerar las células nerviosas.

Sin embargo, porque los gusanos nunca quedarse quieto, se colocan sobre soportes de agarosa de 10% en solución de microesferas. Se coloca un cubreobjetos encima. Las microesferas aumentan el coeficiente de fricción de la interacción de pad-cubreobjetos, efectivamente el gusano en lugar de congelación.

La diapositiva ahora se prepara para realizar axotomies. Las neuronas son traídas a la vista y centradas en el microscopio. El láser se dispara entonces usando el pedal. Óptima energía separa la neurona sin dañar las estructuras adyacentes. Se cortan tantos axones posible por animal.

Con cuidado luego se extraiga la almohadilla de la agarosa de la diapositiva, y gusanos pueden recuperar en una placa NGM sembrada a 20 ° C. Entre 8-48 horas después de la axotomía, las neuronas pueden prepararse para anotar para la regeneración. En la parte distal del corte, la neurona forma un tronco. Sin embargo, en la porción proximal la neurona regenera formando neurites alargados.

Sólo ha visto de Zeus tomar en Ceanorhabditis elegans mantenimiento básico. En este video repasamos: vivienda y alimentación de C. elegans, manipularlos y congelación y recuperación de los nematodos.

También tomamos un breve recorrido por algunas aplicaciones que C. elegans una herramienta tan potente. Aunque C. elegans son diferentes a los mamíferos en muchos aspectos, su composición genética similar, facilidad de mantenimiento y manipulación simple les hacen un modelo importante en la búsqueda de la comprensión de la enfermedad y la biología mamífero. ¡Gracias por ver!

Transcript

Correct care and maintenance of Caenorhabditis elegans is essential for successful experiments.

They require very little space, are cheap to house, have high fecundity, and are easy to manipulate. But just because they are simple to keep around does not mean wimpy science. In fact, Sydney Brenner famously called C. elegans “Nature’s gift to science,” and since its introduction in 1974 the worm has been featured in a number of Nobel prize winning experiments.

In this video we will demonstrate basic methods for maintaining C. elegans in the lab, including: housing and feeding, handling, as well as freezing and thawing of worms.

In the wild, C. elegans are found in the soil and feed upon decomposing plant matter. In the lab, it’s important to keep nematodes as happy as possible, and so we house and feed them using very specific methods.

C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending upon the requirements of the experiment, and can either be grown on solid or in liquid media. In both cases they are fed OP50, a standardized strain of E. coli used specifically for nematode culture in every worm lab around the world.

When grown at 25 °C, C. elegans complete their life cycle 2.1 times faster than when grown at 16 °C. A faster life cycle means the worms mature faster, lay more eggs and consume more food. If worms are allowed to starve or become too crowded they enter a larval stage called the dauer stage. Dauer larvae are stress resistant and do not age.

When maintained on solid media, C. elegans are grown on agar plates prepared with nematode growth media or NGM media. The day before making plates, inoculate liquid LB media with a single colony of OP50 E. coli. Incubate the media at 37 °C overnight with shaking.

To make solid media, measure and combine the appropriate amounts of these ingredients with deionized water in an Erlenmeyer flask.

After autoclaving for at least 15 minutes, let the agar cool to 55 °C in a water bath. Once the media has cooled to 55 °C you should be able to comfortably hold the glass container with bare hands. Using proper aseptic technique, additives like drugs or antibiotics can be added at this time. Swirl to mix. Then, pipette molten NGM into Petri plates until they are 2/3 full. Let the newly made plates dry on the bench overnight.

The next morning pellet the OP50 at 3500 x g for 10 minutes and then resuspend the bacteria in LB media to a 10X concentration. Now, pipette a central lawn onto each plate. Avoid touching the pipet tip to the surface of the NGM and take care not to allow the culture to touch the plate walls. Leave plates to dry on the bench overnight. Once dry, expose plates to UV light to sterilize them. They are now ready to be used when culturing worms.

C. elegans are individually manipulated using a tool known as the worm pick. The pick is typically is made from 30 gauge 90% platinum and 10% iridium wire, though some researchers may prefer slightly different metal compositions. To make a pick, start by breaking the tip of a Pasteur pipet to the preferred length.

Cut about 3 to 4 cm of wire and place 0.5 cm of it inside the tip of the pipet. Seal the wire to the glass over a Bunsen burner. The length of the wire protruding from the glass is about 3 to 3.5 cm but can vary according to individual preferences.

Flatten the end of the wire using a hard edge. Then bend the flattened portion upward to form a scoop. Finally, sand the edges of the pick to prevent damaging the worm or the agar.

To pick worms sterilize the wire of the pick on a flame. Then coat the tip with thick, sticky OP50 E. coli from an NGM plate. Use care to not puncture or scar the agar surface.

While looking through a dissection scope, lightly scoop the worm onto the flattened, sticky pick until the worm sticks to the pick.

Once the worm is on the pick, immediately transfer by lightly holding the tip to the new surface of a new plate and sliding it across the bacterial lawn. The worm should crawl off the pick. The worm should not stay on the pick for too long or it might dry out.

One of the reasons why C. elegans is a popular model for research is because cultures can be stored for long periods of time without any adverse effect.

First, wash freshly starved larvae using 0.5 ml M9 Buffer, gently swirl to loosen all larva and adult animals, and then transfer to a microcentrifuge or cryotube. Then, add equal amount 30% glycerol in M9 Buffer. Finally, pack the vial into an insulated box and store at -80 °C.

To recover worms, remove the tube from a -80 freezer and let thaw at room temperature until the contents fully melt. Pipette the liquid onto a fresh NGM plate with OP50 lawn and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer 10-15 animals to a new plate and allow them to reproduce for one generation. Collect the progeny and score for correct phenotypes.

Now that we’ve seen how C. elegans is maintained in the lab, let’s have a look at how feeding, housing, and handling conditions are modified for experiments.

The Nobel winning discovery of RNA interference allowed researchers to silence any C. elegans gene in order to determine its function.

We can induce RNAi in C. elegans by first preparing plates with E. coli that express target gene dsRNA, which the worms will eat.

Then 4th larval stage worms are transferred to the RNAi plates and allowed to lay eggs. At the desired stage of development the progeny are collected and scored for phenotypes. Since we share about half of our genome with the worm many of the insights gleaned are applicable to human disease.

Because of its quick life-cycle, C. elegans is particularly well suited as a model of aging.

First, a time-synchronized population of C. elegans is generated, by allowing adult hermaphrodites to lay eggs on NGM plates. The worms lay eggs for 6-8 hr and then are removed.

When worms are at the desired stage they are transferred to new NGM plates containing ampicillin to prevent bacterial contamination and FUDR to prevent reproduction.

From this point forward adult worms are observed every 2-3 days until all worms have died. Dead worms are removed from the plate and the number of live and dead worms are recorded.

Analyzing life span in the context of genetic or environmental insults can yield significant insights into the aging process.

Using lasers it is possible to perform axotomies or the cutting of individual axons, in live C. elegans to study how nerve cells regenerate.

But, because worms never keep still, they are placed on 10% agarose pads in solution of microbeads. A cover slip is placed on top. The microbeads increase the coefficient of friction of the pad-coverslip interaction, effectively freezing the worm in place.

The slide is now prepared for performing axotomies. The neurons are brought into view and centered on the microscope. The laser is then fired using the foot pedal. Optimum laser power will sever the neuron without harming adjacent structures. As many axons as possible are cut per animal.

The agarose pad is then carefully removed from the slide, and worms are allowed to recover on a seeded NGM plate at 20 °C. Between 8-48 hr after the axotomy, the neurons can be prepared to score for regeneration. At the distal part of the cut, the neuron forms a stump. However, at the proximal portion the neuron regenerates forming elongated neurites.

You’ve just watched JoVE’s take on basic Ceanorhabditis elegans maintenance. In this video we reviewed: housing and feedings of C. elegans, handling them, and freezing and recovery of nematodes.

We also took a brief tour through some applications that make C. elegans such a powerful research tool. Although C. elegans are dissimilar to mammals in many ways, their similar genetic makeup, ease of maintenance, and simple manipulation make them an important model in the quest for understanding mammalian biology and disease. Thanks for watching!