3.6: Mantenimiento de C. elegans

El correcto cuidado y mantenimiento de Caenorhabditis elegans es esencial para el éxito de los experimentos.

Requieren muy poco espacio, son baratos de alojar, tienen alta fecundidad y son fáciles de manipular. Pero el hecho de que sean fáciles de mantener no significa que la ciencia sea débil. De hecho, Sydney Brenner llamó a C. elegans "el regalo de la naturaleza a la ciencia", y desde su introducción en 1974, el gusano ha aparecido en varios experimentos ganadores del Premio Nobel.

En este video demostraremos métodos básicos para mantener C. elegans en el laboratorio, que incluyen: alojamiento y alimentación, manipulación, así como congelación y descongelación de lombrices.

En la naturaleza, los C. elegans se encuentran en el suelo y se alimentan de materia vegetal en descomposición. En el laboratorio, es importante mantener a los nematodos lo más contentos posible, por lo que los alojamos y alimentamos utilizando métodos muy específicos.

C. elegans se puede cultivar a los 16, 20 o 25 ? C dependiendo de los requisitos del experimento, y puede cultivarse en medios sólidos o líquidos. En ambos casos se alimentan con OP50, una cepa estandarizada de E. coli utilizada específicamente para el cultivo de nematodos en todos los laboratorios de gusanos del mundo.

Cuando se cultiva a los 25 ? C, C. elegans completa su ciclo de vida 2,1 veces más rápido que cuando crecen a 16 ΰC. Un ciclo de vida más rápido significa que los gusanos maduran más rápido, ponen más huevos y consumen más comida. Si se permite que los gusanos mueran de hambre o se llenen demasiado, entran en una etapa larvaria llamada etapa dauer. Las larvas de Dauer son resistentes al estrés y no envejecen.

Cuando se mantienen en medios sólidos, C. elegans se cultivan en placas de agar preparadas con medios de crecimiento de nematodos o medios NGM. El día antes de hacer las placas, inocule el medio LB líquido con una sola colonia de OP50 E. coli. Incubar los medios de comunicación a los 37 ? C toda la noche con agitación.

Para hacer medios sólidos, mida y combine las cantidades adecuadas de estos ingredientes con agua desionizada en un matraz Erlenmeyer.

Después de esterilizar en autoclave durante al menos 15 minutos, deje que el agar se enfríe a 55 ? C en un baño de agua. Una vez que el medio se haya enfriado a 55 ? C debe poder sostener cómodamente el recipiente de vidrio con las manos desnudas. Con la técnica aséptica adecuada, se pueden agregar aditivos como medicamentos o antibióticos en este momento. Revuelve para mezclar. Luego, pipetee NGM fundido en placas de Petri hasta que estén 2/3 llenas. Deje que los platos recién hechos se sequen en el banco durante la noche.

A la mañana siguiente, granule el OP50 a 3500 x g durante 10 minutos y luego vuelva a suspender las bacterias en medios LB a una concentración de 10X. Ahora, pipetea un césped central en cada plato. Evite tocar la superficie de la NGM con la punta de la pipeta y tenga cuidado de no permitir que el cultivo toque las paredes de la placa. Deje que los platos se sequen en el banco durante la noche. Una vez secas, exponga las placas a la luz ultravioleta para esterilizarlas. Ahora están listos para ser utilizados en el cultivo de lombrices.

Los C. elegans se manipulan individualmente utilizando una herramienta conocida como pico de gusano. La púa suele estar hecha de alambre de calibre 30 con un 90% de platino y un 10% de iridio, aunque algunos investigadores pueden preferir composiciones metálicas ligeramente diferentes. Para hacer una púa, comience rompiendo la punta de una pipeta Pasteur a la longitud preferida.

Corta unos 3 a 4 cm de alambre y coloca 0,5 cm dentro de la punta de la pipeta. Sella el alambre al vidrio sobre un mechero Bunsen. La longitud del alambre que sobresale del vidrio es de aproximadamente 3 a 3,5 cm, pero puede variar según las preferencias individuales.

Aplana el extremo del alambre con un borde duro. Luego dobla la parte aplanada hacia arriba para formar una cuchara. Por último, lija los bordes del pico para evitar dañar el gusano o el agar.

Para recoger gusanos, esterilice el alambre del pico en una llama. A continuación, cubra la punta con E. coli OP50 espesa y pegajosa de una placa NGM. Tenga cuidado de no perforar ni dejar cicatrices en la superficie del agar.

Mientras mira a través de un endoscopio de disección, coloque ligeramente el gusano en el pico aplanado y pegajoso hasta que el gusano se pegue al pico.

Una vez que el gusano esté en el pico, transfiéralo inmediatamente sosteniendo ligeramente la punta a la nueva superficie de un nuevo plato y deslizándola por el césped bacteriano. El gusano debe arrastrarse fuera del pico. El gusano no debe permanecer en la púa por mucho tiempo o podría secarse.

Una de las razones por las que C. elegans es un modelo popular para la investigación es porque los cultivos pueden almacenarse durante largos períodos de tiempo sin ningún efecto adverso.

Primero, lave las larvas recién hambrientas con 0,5 ml de tampón M9, agite suavemente para aflojar todas las larvas y animales adultos, y luego transfiéralas a una microcentrífuga o criotubo. A continuación, añade una cantidad igual de glicerol al 30% en el tampón M9. Finalmente, empaque el vial en una caja aislada y guárdelo a -80 ?C.

Para recuperar las lombrices, retire el tubo de un congelador a -80 y deje descongelar a temperatura ambiente hasta que el contenido se derrita por completo. Pipetear el líquido en una placa NGM fresca con césped OP50 e incubar a 20 ?C. Después de 2-3 días, transfiera de 10 a 15 animales a una nueva placa y permítales reproducirse durante una generación. Recoja la progenie y puntúe los fenotipos correctos.

Ahora que hemos visto cómo se mantiene C. elegans en el laboratorio, echemos un vistazo a cómo se modifican las condiciones de alimentación, alojamiento y manejo para los experimentos.

El descubrimiento ganador del Nobel de la interferencia de ARN permitió a los investigadores silenciar cualquier gen de C. elegans para determinar su función.

Podemos inducir ARNi en C. elegans preparando primero placas con E. coli que expresen el gen diana dsRNA, que se comerán los gusanos.

Luego, los gusanos de la 4ª etapa larvaria se transfieren a las placas de ARNi y se les permite poner huevos. En la etapa deseada de desarrollo, la progenie se recolecta y se califica para los fenotipos. Dado que compartimos aproximadamente la mitad de nuestro genoma con el gusano, muchos de los conocimientos obtenidos son aplicables a las enfermedades humanas.

Debido a su rápido ciclo de vida, C. elegans es particularmente adecuado como modelo de envejecimiento.

En primer lugar, se genera una población sincronizada en el tiempo de C. elegans, permitiendo que los hermafroditas adultos pongan huevos en placas NGM. Los gusanos ponen huevos durante 6-8 horas y luego se eliminan.

Cuando los gusanos se encuentran en la etapa deseada, se transfieren a nuevas placas NGM que contienen ampicilina para evitar la contaminación bacteriana y FUDR para evitar la reproducción.

A partir de este momento, se observan gusanos adultos cada 2-3 días hasta que todos los gusanos hayan muerto. Los gusanos muertos se retiran de la placa y se registra el número de gusanos vivos y muertos.

El análisis de la esperanza de vida en el contexto de las agresiones genéticas o ambientales puede arrojar información significativa sobre el proceso de envejecimiento.

Utilizando láseres es posible realizar axotomías o el corte de axones individuales, en C. elegans vivos para estudiar cómo se regeneran las células nerviosas.

Pero, debido a que los gusanos nunca se quedan quietos, se colocan en almohadillas de agarosa al 10% en solución de microperlas. Se coloca un cubreobjetos en la parte superior. Las microperlas aumentan el coeficiente de fricción de la interacción entre la almohadilla y el cubreobjetos, congelando efectivamente el gusano en su lugar.

El portaobjetos ya está preparado para la realización de axotomías. Las neuronas se ponen a la vista y se centran en el microscopio. A continuación, el láser se dispara con el pedal. La potencia óptima del láser cortará la neurona sin dañar las estructuras adyacentes. Se cortan tantos axones como sea posible por animal.

A continuación, la almohadilla de agarosa se retira cuidadosamente del portaobjetos y se permite que los gusanos se recuperen en una placa NGM sembrada a 20 μC. Entre 8 y 48 horas después de la axotomía, las neuronas pueden prepararse para la regeneración. En la parte distal del corte, la neurona forma un muñón. Sin embargo, en la porción proximal la neurona se regenera formando neuritas alargadas.

Acabas de ver la opinión de JoVE sobre el mantenimiento básico de Ceanorhabditis elegans. En este video revisamos: alojamiento y alimentación de C. elegans, manejo de los mismos, y congelación y recuperación de nematodos.

También hicimos un breve recorrido por algunas aplicaciones que hacen de C. elegans una herramienta de investigación tan poderosa. Aunque los C. elegans son diferentes a los mamíferos en muchos aspectos, su composición genética similar, su facilidad de mantenimiento y su fácil manipulación los convierten en un modelo importante en la búsqueda de la comprensión de la biología y las enfermedades de los mamíferos. ¡Gracias por mirar!