Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar los movimientos de las moléculas de proteínas y las perlas recubiertas de proteínas con los extremos de los microtúbulos despolimerizantes. Esto se logra ensamblando una cámara de flujo reutilizable con un cubreobjetos de tamaño limpio. A continuación, se preparan semillas de microtúbulos adheridas al cubreobjetos y se utilizan para nuclear microtúbulos, que luego se estabilizan temporalmente con tapas fotodestructibles.

A continuación, se introducen proteínas marcadas con GFP o perlas recubiertas de proteínas en la cámara de flujo y se unen a los microtúbulos segmentados. A continuación, se desencadena la despolimerización de la microtina mediante la eliminación de los tapones mediante fotoablación. Las imágenes se analizan con CH para determinar si las proteínas marcadas exhiben un comportamiento de seguimiento de la punta, que es el movimiento con los extremos de los microtúbulos despolimerizantes.

La principal ventaja de esta técnica es que permite desencadenar la microtúbulación con alta resolución temporal y especial. La demostración visual de este método es fundamental. El protocolo comienza con la preparación y el montaje de la cámara de flujo mediante molienda ultrasónica.

Modifique los portaobjetos de microscopio normales para que tengan dos ranuras. Haz las ranuras a 14 milímetros de distancia. Más o menos un milímetro, lo cual es óptimo para cámaras ensambladas con cubreobjetos cuadrados de 22 milímetros.

A continuación, coloque un tubo de polietileno de 100 milímetros de largo en cada ranura del portaobjetos, dejando unos voladizos de unos cinco milímetros en los extremos interiores de las ranuras. Fije los tubos dentro de las ranuras con pegamento de cianocrilato, incrustando los tubos completamente dentro de las ranuras. Rellene con cuidado las ranuras con pegamento epoxi sin derramar.

Deja que se seque durante un día. Al día siguiente. Use una cuchilla de afeitar afilada para cortar el pegamento solidificado, de tres a cuatro milímetros del extremo distal de cada sitio de fijación.

Retirar las partes proximales al centro de la guía. Los tubos deben permanecer en sus ranuras y los cortes deben formar superficies planas con aberturas para tubos. A continuación, llene una jeringa con agua y compruebe si los tubos funcionan correctamente.

Si el líquido fluye libremente, ponga una gota de pegamento epoxi de unos cinco milímetros de diámetro en los extremos exteriores de las ranuras y deje que se seque durante aproximadamente un día. Por lo tanto, las cámaras de flujo completas son duraderas y se pueden usar repetidamente durante muchos meses. Este protocolo de tres horas prepara 12 caracteres.

Requiere una campana extractora, un soporte de cubreobjetos cerámicos, tres frascos de tinte de 15 mililitros y 1 frasco de vidrio de 250 mililitros con tapa. Los frascos de tinción deben caber en una pila cuatro cubreobjetos de 22 milímetros de número regular 1. Comience con una pila de 12 cubreobjetos prelimpios y secos en el soporte de cerámica.

Llene el frasco con una solución de sileno repelente más uno y baje lentamente los portaobjetos. Cierra el frasco e incuba durante cinco minutos a temperatura ambiente. El paso más crítico para garantizar una civilización uniforme de los cubreobjetos es evitar cualquier rastro de agua durante la incubación de los cubreobjetos en la solución Selene.

Este paso es esencial para la fijación hermética de las semillas microtubáricas. Más adelante en un protocolo, cuando los cubreobjetos estén listos, retire el soporte de cerámica del frasco. A continuación, transfiera los cubreobjetos individualmente con pinzas recubiertas de teflón del soporte cerámico a los frascos de tinción cargados de metanol.

Ahora cargue los tres frascos en el depósito de agua de un baño sónico con un pedestal de metal o vidrio. El nivel del agua debe estar a dos tercios de la altura de los frascos, sonicar los frascos a 70 vatios durante 20 minutos. Durante la sonicación, cambie la solución de metanol cada cinco minutos.

Una vez finalizada la sonicación, enjuague, la funda se desliza y se limpia 10 veces con agua desionizada. Si el silo funcionó correctamente, los cubreobjetos parecerán secos Cuando se retiren del agua, independientemente de su apariencia, elimine completamente el agua residual. Mediante la transferencia de gas nitrógeno, la cubierta seca se desliza a un recipiente hermético secado con nitrógeno.

Interlay toallitas Kim entre los cubreobjetos. Se pueden almacenar de esta manera durante varias semanas a temperatura ambiente. Este protocolo requiere de una a dos horas, una cámara de flujo y semillas microtubarias estabilizadas G-M-P-C-P preparadas.

Primero, ensamble la cámara de flujo. Coloque dos piezas de cinta adhesiva de doble cara a lo largo del área central de cinco milímetros de ancho del portaobjetos preparado y presione firmemente el cubreobjetos sobre la cinta. Con una jeringa de un mililitro, llene la cámara con 100 microlitros de solución B rrb 80 a través de un tubo.

A continuación, exprima una pequeña gota de sellador de fundición rápida de dos colores encima de una pequeña placa de Petri de plástico. Mézclalo rápida y bien con un palillo. Se volverá verde.

Aplique el sellador inmediatamente a lo largo de todos los bordes del cubreobjetos. Compruebe si el sellador penetra demasiado profundamente debajo del cubreobjetos. Si un tubo está bloqueado, desenchufe la jeringa y levante el tubo para aplicar una presión suave y evitar que el sellador se derrame. Después de 10 minutos, asegúrese de que el flujo de la solución no esté restringido.

A continuación, transfiera la cámara a una platina de microscopio calentada a 32 grados centígrados. Conecte uno de los tubos a una bomba para extraer la solución. Sumerja el extremo libre del tubo de entrada en un vial de 0,5 milímetros con tampón BRB 80 tibio.

Ajuste la bomba a 100 microlitros por minuto y, según sea necesario, utilícela para expulsar suavemente las burbujas de aire. Esto también se puede hacer manualmente. Ahora use la bomba para cargar 30 microlitros de anticuerpos de antígeno caliente.

Apague la bomba y espere cinco minutos. Apague la bomba durante todas las incubaciones. A continuación, lave las cámaras con unos 100 microlitros de b rrb 80 tibio.

A continuación, perfundir 50 microlitros de 1%onic F1 27 en BRB 80. Espere 10 minutos para que bloquee la superficie hidrofóbica del cubreobjetos aislado. Ahora lave las cámaras con 100 microlitros de tampón de motilidad.

A continuación, reduzca la velocidad de la bomba a 15 microlitros por minuto y perfunda la cámara con 30 a 40 microlitros de semillas de microtúbulos diluidas de uno a 200 a uno a 600 en tampón de motilidad. Incubar las semillas durante 15 minutos, luego lavar la cámara con 400 microlitros de tampón de motilidad a 100 microlitros por minuto para eliminar cualquier material no ligado. A continuación, reduzca la velocidad de la bomba a 30 microlitros por minuto y perfunde la cámara con una solución de tubulina precalentada sin etiquetar.

Los aspectos más críticos de este protocolo son evitar las burbujas de aire. Utilizar soluciones de tubulina recién preparadas y seguir el tiempo exacto del protocolo, especialmente durante el recubrimiento microtubular. Controle el crecimiento microtubárico utilizando la óptica DIC durante la incubación de cinco a siete minutos.

Los microtúbulos suelen crecer unas 10 micras, intercambian rápidamente la solución con la mezcla de tubulina rumina de antes de la guerra y permiten de ocho a 10 minutos más de tiempo de incubación. Lave bien la cámara con 100 microlitros de tampón de motilidad a 20 microlitros por minuto para eliminar la turbulencia y los nucleótidos, así como los fragmentos solubles de microtúbulos. A continuación, perfunda la cámara con una solución calentada de proteína marcada con GFP o perlas recubiertas de proteínas y proceda con la obtención de imágenes del componente cinético de levadura DAM, uno marcado con GFP se purificó a partir de células bacterianas y se utilizó como control positivo para los ensayos de seguimiento de puntas.

Dichas proteínas se desplazan con el extremo despolimerizante de un microtúbulo y se mueven constantemente hacia la semilla adherida al cubreobjetos. Estas proteínas aparecen como una línea oblicua en un gráfico correspondiente, que luego se puede analizar para determinar el número de moléculas de proteína en el complejo de seguimiento de la punta. Este análisis se detalla en el protocolo de texto.

Por el contrario, las proteínas que no logran inclinar la pista no muestran un enriquecimiento en la señal de fluorescencia en el microextremo de desmontaje. Esto se observa con la proteína NDC 80 GFP humana. La unión entre las perlas recubiertas de proteínas y los microtúbulos suele ser bastante fuerte, por lo que cuando las perlas se añadieron a la cámara de microscopía, se unieron fácilmente a los microtúbulos adheridos al deslizamiento de cubierta segmentado.

Cuando el seguimiento del cordón es procesivo, se pueden hacer muchas observaciones. Las perlas que se adherían a un microtúbulo mostraban un movimiento similar a un arco a medida que los microtúbulos giraban ligeramente alrededor del sitio de su crecimiento. Cuando se ilumina la tapa estabilizadora, si solo se puede ver un segmento rojo distal de la semilla y la cuenta, entonces la cuenta está unida a un microtúbulo.

A menudo se puede ver que la tapa sigue el movimiento de las cuentas por igual hasta que la tapa se blanquea El movimiento de la cuenta poco después del blanqueo parece consistente con la orientación de los microtúbulos. A medida que la microtrompa se acorta y la cuenta se mueve hacia la semilla, la amplitud de las oscilaciones en forma de arco disminuye. Si las perlas no logran formar uniones duraderas a los microtúbulos estables.

El atrapamiento láser se puede utilizar en perlas con diferentes construcciones proteicas de kinesina SE E dirigida al extremo positivo, se requirió esta técnica para lanzar las perlas en las paredes microtubarias segmentadas en presencia de un TP. Estas cuentas se movieron rápidamente hacia los extremos micro tubarios positivos tapados en un gráfico. Este movimiento dio como resultado una línea oblicua dirigida hacia la tapa después de que la tapa fue destruida. Las perlas recubiertas con proteína espía truncada se desprendieron del microtúbulo como señala la flecha verde.

Por el contrario, las perlas con proteína B de longitud completa podrían mantener el movimiento en la dirección inversa. Esto se ve como un patrón en zigzag en el gráfico chm debido al movimiento en direcciones opuestas hacia el extremo más o menos de los microtúbulos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar cámaras de flujo y cultivar microtúbulos segmentados para estudiar los movimientos impulsados por el desmontaje de microtrompas.