Name: Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-15T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Aprende a preparar microtúbulos segmentados con tapas fotoablables para estudiar el movimiento de proteínas y perlas en los extremos despolimerizantes. Este método permite controlar la dinámica microtubular con alta resolución temporal y espacial.

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Los autores desean agradecer a FI Ataullakhanov para ayudar a diseñar y fabricar cámaras de flujo reutilizables, N. Dashkevich, N. y A. Gudimchuk Korbalev para proporcionar imágenes de figuras, N. y P. Gudimchuk Zakharov para el desarrollo de un protocolo y proporcionar reactivos para preparar semillas microtúbulos marcadas con digoxigenina, A. Potapenko para obtener ayuda con la edición de texto y otros miembros del laboratorio Grishchuk para consejos y discusiones. Esta obra fue financiada en parte por subvención NIH R01 GM-098389 y una subvención piloto de Pennsylvania Muscle Instituto de ELG, que es un Kimmel Scholar, por RFBR ofrece 12-04-00111-A, 13-04-40190-H y 13 -04-40188-H, Academia Rusa de Ciencias del Presidium de Subvenciones (Mecanismos de Sistemas Molecular Integración y programas de Biología Celular Molecular y Moleculares) a FI Ataullakhanov, NIH subvención GM R01 GM033787 a JR McIntosh, y una beca postdoctoral de la Fundación Dinastía Zimin Dmitry al VAV

Los autores no tienen nada que revelar.

Muchos ensayos de una sola molécula hoy en día utilizan habitualmente cubreobjetos especialmente tratadas para reducir drásticamente la adherencia no específica de proteínas. El procedimiento se describe aquí es una modificación del protocolo original desarrollado en Howard laboratorio 32, y nos encontramos con que silanizar los cubreobjetos es bien vale la pena el esfuerzo, incluso con ensayos de cuentas basados ​​en la DIC, que no utilizan la fluorescencia. Cámaras ensambladas con tales cubreobjetos muestra...

Los microtúbulos son altamente conservadas estructuras citoesqueléticas que son importantes para la arquitectura celular, la motilidad celular, la división celular, y el transporte intracelular 1. Estos polímeros dinámicos se ensamblan a partir de tubulina en presencia de GTP, y cambian de forma espontánea entre el crecimiento y acortamiento 2. Los microtúbulos son muy delgado (sólo 25 nm de diámetro), por lo tanto las técnicas ópticas especiales para incrementar el contraste debe ser utilizado para observar los microtúbulos con un microscopio óptico. El trabajo previo con estos polímeros examinó su comportamiento dinámico mediante contraste de interferencia diferencial (DIC) 3. Este y otros estudios in vitro revelaron que en condiciones típicas experimentales, los microtúbulos se someten a la catástrofe y cambie a la despolimerización sólo en raras ocasiones, una vez cada 5-15 minutos (esta frecuencia es de 7-15 concentración de tubulina soluble mM examinada en 28-32 ° C ) 4. Así, se han propuesto diferentes técnicas para la induccióne microtúbulos despolimerización de una manera controlada. Acortamiento de microtúbulos puede ser activado mediante el lavado de distancia tubulina soluble en 5,6, corte microtúbulos con un haz de láser 7, o el uso de los microtúbulos segmentados 8, tal como se describe aquí. El trabajo previo utilizando los microtúbulos segmentados, así como polímeros de conmutación estocásticamente, se ha encontrado que pequeñas cargas intracelulares, tales como cromosomas, vesículas, y perlas de proteína recubiertos, se pueden mover en los extremos de los microtúbulos acortamiento 9-13. Este fenómeno se cree que tiene una implicación directa de los movimientos de los cromosomas en las células mitóticas, y los mecanismos subyacentes están actualmente bajo investigación activa 14-16. Recientemente, las técnicas a base de fluorescentes, incluyendo la reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía, se han empleado para estudiar la motilidad con microtúbulos dinámicos extremos 17-24. La ventaja de este enfoque es que permite el examen de la interaccións entre los microtúbulos y proteínas de unión a microtúbulos en tiempo real utilizando proteínas marcadas con diferentes fluoróforos. Se encontraron varios complejos de proteínas para mover processively con el alargamiento y / o acortamiento de los extremos de los microtúbulos. Ellos incluyen las proteínas asociadas a los microtúbulos Dam1 10,12,18, Ska1 19, y XMAP215 20, así como motores de quinesina Kif18A 21,22, MCAK 23 y CENP-E 24. Estas proteínas exhiben processive punta-de seguimiento, que es fundamentalmente diferente de la de las proteínas de punta de seguimiento de clásicos como EB1 25. Aunque las moléculas EB1 y los socios parecen permanecer de manera estable asociada a los microtúbulos dinámica termina, las moléculas individuales permanecen atados a la punta de los microtúbulos por sólo ~ 0,8 seg, intercambiar rápidamente con la piscina soluble 26. Por el contrario, procesivas punta-trackers, como Dam1, viajan con los microtúbulos termina para muchos micras, y su asociación con las puntas de los microtúbulos pueden durar mningún segundo. La punta tiempo asociación, así como el que resulte de seguimiento, depende en gran medida del número de moléculas que forman la punta de rastreo complejo 27. Grandes conjuntos de proteínas suelen ser mucho mejores de punta-trackers. Por ejemplo, dichos ensamblajes complejos como los cinetocoros de levadura aisladas pueden permanecer acoplado a microtúbulos termina por hora 28. Algunas proteínas de unión a microtúbulos, por ejemplo Ndc80 complejo de proteínas cinetocoro, se han encontrado para ser incapaces de realizar un seguimiento con microtúbulos termina en un solo nivel de molécula, sin embargo Ndc80 es muy eficiente en el acoplamiento del movimiento del talón de carga 19,29-31. Por lo tanto, para entender el mecanismo de la punta de seguimiento por diferentes complejos de proteínas, así como sus funciones biológicas, es importante examinar la punta de seguimiento como una función del número de moléculas en el complejo punta de seguimiento, así como para determinar la capacidad de estos complejos para exhibir la motilidad colectiva en la superficie de la carga de talón. (Figura 1A). En primer lugar, los portaobjetos de vidrio disponibles comercialmente son modificados para unir tubos de polietileno corto (Protocolo 1). La cámara de flujo microscopía reutilizable se ensambla a partir de una diapositiva tal y el plasma-limpiado y cubreobjetos silanizada (protocolo 2) 32-34 químicamente o. El volumen de la cámara resultante es sólo 20-25 l (o tan pequeño como 15 l, véase la nota 3 en el Protocolo 1), incluyendo el volumen de la tubería de entrada. Cámaras de flujo disponibles comercialmente también se pueden usar, pero su volumen es generalmente más grande, que conduce a la pérdida innecesaria de proteínas. Si se emplea una cámara más grande, el volumen de todas las soluciones en los protocolos a continuación debe ser escalado proporcionalmente. Semillas de microtúbulos continuación, se preparan, por ejemplo, usando GTP analógico lentamente hidrolizable, GMPCPP (guanosina-5&#39;-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (Protocolo 3, ver también Hyman &lt;em&gt; et al. 35). Las semillas se inmovilizan sobre un cubreobjetos de limpiado y la superficie es posteriormente bloqueando los comandos para prevenir la absorción no específica de otras proteínas 32 ​​(protocolo de 4 describe semillas inmovilización utilizando digoxigenina). Los microtúbulos segmentados pueden ser preparados usando el Protocolo 5. La razón principal de este enfoque es que los polímeros de microtúbulos dinámicos, que se forman en presencia de GTP, se pueden estabilizar temporalmente mediante la adición de los cortos &quot;topes&quot; de segmentos de tubulina estables, que contienen GMPCPP. Estas tapas también contienen tubulina marcada con rodamina, para que puedan ser retirados simplemente iluminando el campo de visión con un láser de 530-550 nm o lámpara de arco de mercurio (Protocolo 6) 36. La intensidad de fluorescencia de la señal de la punta de seguimiento se puede usar entonces para estimar el número de moléculas que se desplazan con los extremos de los microtúbulos desmontaje, teniendo en cuenta la falta de uniformidad de la iluminación de campo del microscopio (Protocolo 7). Un enfoque similar se puede utilizarpara estudiar las interacciones entre los microtúbulos depolymerizing y perlas de proteína-revestido, preparado como se describe en el 27 (Protocolo de 8). Algunas proteínas se unen fácilmente a las paredes de los microtúbulos segmentados, pero pinzas láser también pueden utilizarse para sostener el cordón cerca de la pared de microtúbulos, promoviendo así su unión.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabla 1. Microscopía y otros equipos.Microscopio </td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss Nikon</td><td>Axio Imager 2 Eclipse Ti</td> Se <td>pueden utilizar otros modelos de microscopio capaces de obtener imágenes DIC y de epifluorescencia</td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Zeiss Nikon</td><td>420490-9900-000 CFI Apo 100x Aceite 1.49</td><td>100X, DIC, 1.3-1.49 NA</td></tr><tr><td>Calentador de objetivo</td><td>Bioptechs 150803</td><td>, 150819-19</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro fluorescente</td><td>Chroma</td><td>49004 o 49008 41017 o 49020</td><td>optimizado para fluorescencia de rodamina&nbsp; optimizado para la fluorescencia GFP</td></tr><tr><td>Software de adquisición</td><td>gratuito MicroManager Molecular Devices</td><td>no aplicable MetaMorph 7.5</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/ otro software se puede utilizar para la adquisición de imágenes y para el seguimiento de partículas</td></tr><tr><td>Cámara EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon3, DU-897E-cs0-#BV</td><td>Cámara EMCCD de alta sensibilidad</td></tr><tr><td>Láser de trampa</td><td>IPG Fotónica</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td>Láser de 1.064 nm,</td>láseres de</tr><tr><td>excitación por fluorescencia de</td> 10 W <td>Coherent, Inc. Coherent, Inc.</td><td>Zafiro 488 LP Zafiro 552 LP</td><td>Excitación de fluoróforos verdes Excitación de fluoróforos rojos</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de flujo comerciales</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-20 o RC-30</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de perfusión</td><td>Cole Palmer Harvard Apparatus</td><td>Masterflex 77120-52 Pico Plus</td><td>Ambas bombas proporcionan la tasa requerida de flujo de líquido, pero una bomba peristáltica puede pulsar a una velocidad muy lenta. El flujo con una bomba de jeringa es más consistente para una amplia gama de tasas, pero esta bomba tiene inercia.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 2. Preparación de la cámara de microscopía.</fuerte></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio modificados para cámaras reutilizables</td><td>Soplado de vidrio de precisión de Colorado</td><td>Pedido personalizado www.precisionglassblowing.com</td><td>Ranuras sónicas en portaobjetos utilizando esquemas en Figura 1</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Intramedic</td><td>427410</td><td>D.I. 0,58 mm, D.E. 0,965 mm; Utilice estos tubos para conectar la cámara ensamblada a la bomba y al contenedor de residuos</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td>Intramedic</td><td>427400</td><td>D.I. 0,28 mm, D.E. 0,61 mm; Utilice estos tubos para hacer la cámara reutilizable</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio normales</td><td>VWR</td><td>48312-003</td> Se <td>pueden utilizar otros portaobjetos similares</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>48393-150, 48366-067</td> Se <td>pueden utilizar otros cubreobjetos similares</td></tr><tr><td>Sellador de silicona</td><td>World Precision Instruments</td><td>KIT, SELLADOR DE SILICONA CURADO DE 5 MINUTOS</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento epoxi</td><td>Loctite</td><td>83082</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo de cianoacrilato</td><td>Scotch 3M</td><td>AD114</td><td>O adhesivo de cianoacrilato de otros fabricantes</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 3. Limpieza y recubrimiento de cubreobjetos.</td></tr><tr><td>Tamices moleculares, grado 564</td><td>Macron</td><td>4490-04</td><td></td></tr><tr><td>Tarro de tinción de cubreobjetos</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>21036</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos Soporte cerámico</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542e40</td><td></td></tr><tr><td>PlusOne Repel Silane</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoxigenina AB</td><td>Roche Applied Science</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 4. Preparación de semillas y microtúbulos segmentados.</Tubulina fuerte></td></tr><tr><td></td><td>purificada a partir de cerebros de vaca Cytoskeleton, Inc</td><td> T238P</td><td>Para los protocolos de purificación, consulte 49&ndash; 51 Tubulina porcina sin etiquetar</td></tr><tr><td>Tubulina marcada</td><td>Cytoskeleton, Inc Invitrogen Invitrogen</td><td>TL590M C1171 (Rhodamine) A-2952 (Digoxigenina)</td><td>La tubulina porcina marcada con rodamina puede marcarse con cualquier colorante reactivo a aminas como en referencia52.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-405</td><td>Alícuota y almacenamiento a -70 &deg; C</td></tr><tr><td>VALAP</td><td>Vaselina, lanolina y parafina a 1:1:2 en masa</td><td></td><td>ver referencia9</td></tr></tbody></table>

preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos ends

Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends

Despolimerización de microtúbulos puede proporcionar la fuerza para el transporte de diferentes complejos de proteínas y los granos proteicos recubierto in vitro. Los mecanismos subyacentes se cree que desempeñan un papel vital en los movimientos de los cromosomas microtúbulos dependientes durante la división celular, pero las proteínas correspondientes y sus funciones exactas están mal definidos. Por lo tanto, hay una necesidad creciente de desarrollar ensayos con el que estudiar tales motilidad in vitro utilizando componentes purificados y medio bioquímica definida. Los microtúbulos, sin embargo, son inherentemente inestables polímeros; su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Los protocolos que describimos aquí se aprovechan de los microtúbulos segmentados que se hacen con el fotoescindible estabilizar tapas. La despolimerización de microtúbulos tales segmentados se puede activar con alta resolución temporal y espacial, ayudando así a los estudios de la motilidad en los extremos de los microtúbulos desmontaje. Esta técnica se puede utilizar para CArry a cabo un análisis cuantitativo del número de moléculas en los complejos de proteínas marcadas con fluorescencia, que se mueven processively con los extremos de los microtúbulos dinámica. Para optimizar una relación señal-ruido en este y otros ensayos fluorescentes cuantitativos, cubreobjetos deben ser tratados para reducir la absorción no específica de proteínas marcadas fluorescentemente-solubles. Protocolos detallados se proporcionan a tener en cuenta la falta de uniformidad de la iluminación fluorescente, y determinar la intensidad de un solo fluoróforo utilizando ajuste gaussiano equidistantes. Por último, se describe el uso de los microtúbulos segmentados para estudiar los movimientos de los microtúbulos dependientes de las microperlas de proteína-revestido, proporcionando conocimientos sobre la capacidad de las diferentes proteínas motoras y no motoras para acoplar la despolimerización de microtúbulos al movimiento de carga processive.

Proteína seguimiento con depolymerizing microtúbulos termina. Cinetocoro levadura componente Dam1 es, con mucho, el mejor consejo-tracker de los microtúbulos depolymerizing termina 14. Este complejo de 10 subunidad marcada con GFP se puede expresar fácilmente y se purifica a partir de células bacterianas 18,38, por lo que recomendamos su uso como un control positivo para el ensayo de la punta de seguimiento. Una proteína fluorescente que rastrea con el extremo despolimerización de ...

Los microtúbulos son polímeros inherentemente inestables, y su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Aquí se describen los protocolos que utilizan microtúbulos segmentados con tapones estabilizadores fotoescindible. La despolimerización de los microtúbulos segmentados puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos con los extremos de los microtúbulos desmontaje.

Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends

Microtubule depolymerization can provide force to transport different protein complexes and protein-coated beads in vitro. The underlying mechanisms are ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar los movimientos de las moléculas de proteínas y las perlas recubiertas de proteínas con los extremos de los microtúbulos despolimerizantes. Esto se logra ensamblando una cámara de flujo reutilizable con un cubreobjetos de tamaño limpio. A continuación, se preparan semillas de microtúbulos adheridas al cubreobjetos y se utilizan para nuclear microtúbulos, que luego se estabilizan temporalmente con tapas fotodestructibles.A continuación, se introducen proteínas marcadas con GFP o perlas recubiertas de proteínas en la cámara de flujo y se unen a los microtúbulos segmentados. A continuación, se desencadena la despolimerización de la microtina mediante la eliminación de los tapones mediante fotoablación. Las imágenes se analizan con CH para determinar si las proteínas marcadas exhiben un comportamiento de seguimiento de la punta, que es el movimiento con los extremos de los microtúbulos despolimerizantes.La principal ventaja de esta técnica es que permite desencadenar la microtúbulación con alta resolución temporal y especial. La demostración visual de este método es fundamental. El protocolo comienza con la preparación y el mont

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Investigación

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Biología

Este video describe TIRF, una técnica basada en microscopía de reflexión interna total para visualizar la dinámica de polimerización de actina y microtúbulos. El método permite obtener imágenes de alta resolución de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos en tiempo real, lo cual es esencial para comprender las diafonías celulares.

Microscopía TIRF para visualizar la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos

Levadura en ciernes es un modelo ventajoso para el estudio de la dinámica de microtúbulos in vivo debido a sus potentes genética y la simplicidad de su citoesqueleto de microtúbulos. El siguiente protocolo describe cómo transformar células de levadura y la cultura, adquirir imágenes de microscopía confocal, y analizar cuantitativamente la dinámica de microtúbulos en las células vivas de levadura.

Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

Los microtúbulos, que son polímeros de tubulina, desempeñan un papel crucial como componente del citoesqueleto en las células eucariotas y son conocidos por su inestabilidad dinámica. Este estudio desarrolló un método para fraccionar microtúbulos para separarlos en microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre para evaluar la estabilidad de los microtúbulos en varios tejidos de ratón.

Técnica de fraccionamiento cuantitativo de microtúbulos para separar microtúbulos estables, microtúbulos lábiles y tubulina libre en tejidos de ratón

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Este estudio detalla la purificación de KIF1A (1-393LZ), un miembro de la familia de la quinesina-3, utilizando el sistema de expresión de baculovirus Sf9. El análisis de deslizamiento in vitro de una sola molécula y multimotor de estos motores purificados mostró propiedades de motilidad robustas comparables a los motores de lisado de células de mamíferos. Por lo tanto, el sistema Sf9-baculovirus es susceptible de expresar y purificar la proteína motora de interés.

Análisis de una sola molécula de motores de la familia Kinesin-3 superprocesiva purificada Sf9

Este artículo presenta un protocolo para la formación de conjuntos de microtúbulos en forma de tactoides utilizando MAP65, un reticulante de microtúbulos a base de plantas, y PEG como agente de apiñamiento.

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Este artículo presenta protocolos para la ingeniería y caracterización de redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos. Los compuestos experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsado por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos.

Reconstitución y caracterización de compuestos de actina-microtúbulos con dinámica y mecánica accionada por motor sintonizable

Aquí se presentan métodos para preparar nemática activa a partir de microtúbulos y motores de quinesina, incluida la preparación y construcción de proteínas y el uso de pozos para el confinamiento nemático activo.

Formación, confinamiento y observación de nemática activa basada en microtúbulos

Aquí, describimos un protocolo para extraer tubulina endógena de células de mamíferos, que pueden carecer o contener enzimas modificadoras de microtúbulos específicas, para obtener microtúbulos enriquecidos para una modificación específica. Luego describimos cómo los microtúbulos extraídos se pueden decorar con proteínas purificadas de unión a microtúbulos para preparar rejillas para la microscopía crioelectrónica.

Extracción de microtúbulos modificados de células de mamíferos para estudiar complejos microtúbulos-proteínas mediante microscopía crioelectrónica

Este protocolo detalla el diseño y la fabricación de un dispositivo microfluídico adecuado para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos. La síntesis de técnicas de microfabricación, control de flujo automatizado y modelado computacional permite un sistema flexible ideal para sondear el citoesqueleto celular in vitro.

Desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos

Aprende a preparar microtúbulos segmentados con tapas fotoablables para estudiar el movimiento de proteínas y perlas en los extremos despolimerizantes. Este método permite controlar la dinámica microtubular con alta resolución temporal y espacial.

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