Séquentiel

L'objectif général de cette procédure est de suivre et de quantifier de manière séquentielle la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches et progénitrices ostéogéniques endogènes lors de la réparation osseuse après fracture. Ceci est réalisé en marquant d'abord in vivo les cellules mixovirus, résistantes au virus de la grippe, ou positives pour MX1 (ou MX un) par injection d'acide poly-cytidylique poly-inosinique, puis en éliminant les cellules hématopoïétiques résidentes positives pour MX1 par irradiation. Dans une deuxième étape, des cellules de moelle osseuse de type sauvage sont administrées de façon systématique aux souris irradiées.

Ensuite, des microfractures sont générées dans la zone Cal de la souris par forage à l'aiguille. Enfin, une imagerie intraviale séquentielle de la réparation des microfractures est réalisée. En définitive, ces images intravitales peuvent être utilisées pour évaluer la dynamique de l'afflux et de l'expansion des cellules souches et progénitrices ostéogéniques vers les sites de fracture.

Ainsi, le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une imagerie répétitive in vivo des cellules souches ostéogéniques et de leurs cellules progénitrices au cours de la cicatrisation d'une fracture. Les implications de cette technique s'étendent vers le traitement de la cicatrisation des fractures et de l'ostéoporose. En effet, cette méthode offre un nouvel outil pour surveiller les cellules souches progénitrices ostéogéniques endogènes dans la régénération et la réparation osseuses.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la création de microfractures avec un dommage tissulaire minimal et l'imagerie répétée in vivo de la lésion fracturaire sans induire une formation sévère de cicatrice sont des éléments cruciaux de la méthode et constituent un défi technique. Pour marquer les cellules MX une positives in vivo, commencez par injecter 200 microlitres d'acide polyacrylique poly cytoïlique par 20 grammes de poids de souris rapporteur MX une Cree, par voie intrapéritonéale, une fois tous les deux jours pendant 10 jours. Ensuite, pour éliminer les cellules hématopoïétiques résidentes MX une positives, irradiez les souris injectées avec une dose unique de 9,5 gras. Après 24 heures, transplantez 1 × 10⁶ cellules de moelle osseuse de type sauvage par souris par voie intraveineuse.

Quatre à six semaines plus tard, anesthésiez la souris par injection intrapéritonéale de 50 microlitres de kétamine-xylazine. Après avoir confirmé la sédation par pincement de l'orteil, incisez le cuir chevelu de la souris ayant reçu une greffe de cellules de moelle osseuse, puis stérilisez la peau exposée à l’aide d’un coton-tige imprégné d’alcool à 70 %. Appliquez un gel ophtalmique pour prévenir la déshydratation cornéenne, puis réalisez une incision transversale d’une longueur inférieure à un centimètre sur le cuir chevelu, partant d’une oreille et se terminant à l’autre. Ensuite, tournez l’animal d’environ 60 degrés et prolongez l’incision jusqu’à environ deux à trois millimètres du nez à l’aide d’une pince.

Tirer le lambeau de tissu vers les côtés de l'animal afin de séparer la peau ; les deux os frontaux ainsi que l'intersection des sutures sagittale et coronale doivent maintenant être clairement exposés. Rincer la surface ouverte avec du PBS stérile, puis essuyer délicatement les poils résiduels à l’aide de cotons-tiges. Ensuite, pour créer des microfractures sur le crâne, tenir la tête de la souris d'une main et une aiguille de calibre 30 de l'autre.

Utilisez la pointe d'aiguille de calibre 30 pour percer délicatement une micro-perforation sur un côté des os frontaux, près de l'intersection des sutures sagittale et coronale. Pour éviter de pénétrer dans le cerveau, passez à un calibre plus grand et tournez la nouvelle aiguille afin d'élargir la perforation à environ 0,5 millimètre de diamètre. Après avoir créé une deuxième perforation sur l'os frontal controlatéral, laissez tomber continuellement du PBS sur chaque site en essuyant jusqu'à l'arrêt du saignement.

Ensuite, pour éviter le dessèchement, appliquez une goutte suffisante de solution saline physiologique stérile sur le crâne afin de couvrir complètement la zone destinée à l'acquisition des images Vidal. Commencez par allumer le scanner laser à base de polygone afin de permettre l'acquisition simultanée d'images multi-canaux à une fréquence vidéo de 30 images par seconde. Ensuite, allumez le laser au titane-saphir femtoseconde pour l'imagerie multiphoton.

Réglez la puissance et la longueur d'onde à 880 nanomètres pour l'imagerie par génération de deuxième harmonique de l'os du crâne, à 440 nanomètres pour l'excitation de la GFP et du TD-tomate, puis activez les lasers à état solide de 491 nanomètres et de 561 nanomètres. Ensuite, allumez les détecteurs à photomultiplicateur pour chaque signal : un filtre passe-bande de 435 ± 20 nanomètres pour la génération de deuxième harmonique, un filtre passe-bande de 528 ± 19 nanomètres pour la GFP et un filtre passe-bande de 590 ± 20 nanomètres pour le TD-tomate. Placez maintenant l'animal sur une platine motorisée de microscope à axes XYZ, positionnée au-dessus d'un tapis chauffant électrique réglé à 37 degrés Celsius.

Utilisez du ruban adhésif pour maintenir la souris en place, puis appliquez une goutte de gel à 2 % à base de méthylcellulose chauffé sur le crâne. Pour éviter le dessèchement, placez un lamelle sur la zone d'imagerie. Utilisez ensuite un objectif à immersion dans l'eau de 30 x avec une ouverture numérique de 0,9 ainsi que le contrôleur des axes XY et Z pour détecter le signal SHG provenant des os.

Pour localiser la surface du crâne, identifiez un point de repère crucial, tel que l'intersection entre les sutures sagittales et les sutures coronales, puis acquérez une image. Notez les coordonnées X, Y et Z du point de repère, puis poursuivez la recherche de l'emplacement de la lésion en utilisant les signaux SHG et fluorescents comme guides. Lorsqu'une région d'intérêt est localisée, acquérez une image du meilleur plan focal contenant les signaux SHG et fluorescents provenant des cellules d'intérêt.

Enregistrez les coordonnées XY, Z et la distance jusqu'à l'intersection des sutures sagittale et coronale afin de définir leur emplacement précis pour le prochain cycle d'imagerie. Ensuite, procédez à la collecte des structures cellulaires et osseuses en 3D de la lésion fracturaire. Enregistrez les images avec des intervalles en Z d'environ deux à cinq microns sur une profondeur d'environ 100 microns à partir de la surface endosseuse.

Enfin, après l’imagerie des deux sites lésionnels, utilisez plusieurs gouttes de solution saline stérile pour éliminer le gel de méthylcellulose à 2 % du crâne. Appliquez ensuite un antibiotique sur la surface et recouvrez le crâne avec les lambeaux de peau, refermez le cuir chevelu à l’aide d’un fil de suture hypoallergénique et maintenez l’animal dans une chambre de récupération chauffée jusqu’à ce qu’il retrouve une conscience suffisante. Après trois à cinq jours, répétez les étapes d’imagerie intravitale afin de suivre les changements cellulaires pendant la cicatrisation de la fracture.

Dans cette expérience représentative, deux microfractures ont été générées sur les os frontaux de souris génétiquement modifiées MX1 exprimant l'ostéocalcine liée au tomate et à la GFP, après irradiation et remplacement de la moelle osseuse. Un suivi en imagerie 3D intravitale séquentielle des microfractures a révélé un reclassement des cellules souches et progénitrices ostéogéniques positives au tomate au niveau du site de la fracture au jour 2, ainsi que leur expansion au jour 5. Bien qu'aucun ostéoblaste positif pour la GFP n'ait été détecté à ce stade, au jour 12, un sous-ensemble de progéniteurs ostéogéniques proches de la surface de la fracture a entamé la différenciation en ostéoblastes positifs pour le tomate et la GFP, comme indiqué par la flèche. L'accumulation d'ostéoblastes nouveaux et la formation de nouveau tissu osseux observées au jour 21 indiquent que la migration et la prolifération des cellules progénitrices ostéogéniques constituent un mécanisme majeur d'approvisionnement en nouveaux ostéoblastes pour la cicatrisation de la fracture. Afin de tester si cette méthode permet d'obtenir un résultat reproductible et quantitatif du nombre de progéniteurs ostéogéniques durant la cicatrisation, les cellules souches et progénitrices ostéogéniques positives pour la YFP MX1 ont été suivies pendant 14 jours après la lésion.

Un petit nombre de progéniteurs a été régulièrement détecté au site de la lésion dès le troisième jour. Le nombre de cellules a augmenté continuellement au septième jour, atteignant un pic de population au dixième jour, qui s'est maintenu jusqu'au quatorzième jour. La cinétique de production des progéniteurs ostéo a été quantifiée en mesurant l'intensité du signal YFP au fil du temps, et corrélée à celle observée par microscopie intravitale.

Les progéniteurs ont d'abord été observés au troisième jour, ont atteint un pic au dixième jour et sont restés à une intensité également élevée jusqu'au quatorzième jour. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que des techniques de suture expertes et une saignée minimale peuvent réduire la formation de cicatrices et diminuer l'autofluorescence de fond. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'imagée et de suivre la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches progénitrices ostéogéniques endogènes au cours du processus de réparation de fracture.