La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

El objetivo general del siguiente experimento es extraer proteínas de tejido cerebral humano y de ratón para su análisis mediante proteómica. Esto se logra utilizando un tampón de lisis común para obtener una extracción de proteínas adaptada a enfoques de electroforesis bidimensional. A continuación, se emplea la electroforesis bidimensional con diferencia de fluorescencia para separar las proteínas y permitir su identificación mediante espectrometría de masas.

A continuación, se realiza una electroforesis en gel 2D miniatura con inmunodetección para identificar modificaciones postraduccionales. Los resultados pueden mostrar la expresión proteica global. Los cambios traduccionales del huésped agrupan toda la ligamentización y los productos catalíticos según las diferencias en el punto isoeléctrico y el peso molecular.

La combinación de 2D dash y 2D monolo puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la neuroproteómica al proporcionar simultáneamente información sobre cambios en la expresión. Modificación postnatal y catabolismo en productos. Comience con la recolección y homogenización del tejido cerebral. Prepare el tejido al 10% peso/volumen en tampón de extracción para tejido cerebral humano.

Homogenice el tejido utilizando un pipeteador de vidrio; sin embargo, use un homogenizador de teflón para tejido de roedor con el fin de desintegrar cualquiera de los homogeneizados. Sometalo a sonicación a 60 hertz utilizando 30 pulsos de medio segundo. A continuación, determine la concentración de proteína mediante un ensayo de Bradford utilizando BSA como estándar.

Ahora reúna las soluciones para la precipitación con cloroformo-metanol en un recipiente con hielo. Planifique recolectar aproximadamente 125 microgramos para tiras IPG de 11 centímetros o aproximadamente 1,25 miligramos para tiras IPG de 18 centímetros. Una vez que las soluciones estén a cuatro grados Celsius, realice la precipitación completamente sobre hielo.

Primero, agregue tres volúmenes de metanol, luego uno de cloroformo. Agite esta mezcla. A continuación, agregue tres volúmenes de agua fría.

Vortex, mezcle esta mezcla durante un minuto y centrifugue el tubo de muestra a 12.000 G durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Aspire y deseche el sobrenadante. A continuación, agregue tres volúmenes de metanol, vortexee y precipite las proteínas de la misma manera.

Seque el pellet de proteína recolectado bajo gas nitrógeno antes de la DIGE 2D. Re suspenda la proteína en tampón 2D a 2,5 miligramos por mililitro. Luego, sonique las muestras como se hizo anteriormente hasta que sean utilizadas.

Almacénelos a menos 80 grados Celsius antes de comenzar este paso y después de la precipitación de proteínas. Es necesario determinar nuevamente la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford. Siga el mismo procedimiento mostrado anteriormente antes de la etiquetación con el colorante psy.

La calidad de la muestra de proteína se verifica mediante electroforesis en gel SDS para ese fin. Diluya 15 microgramos de proteína en LDS y caliéntelos a 37 grados Celsius en un baño o bloque térmico. Luego, corra las muestras en un gel de poliacrilamida y tiña el gel con solución de azul de comassie durante al menos una hora.

Luego, detenga el gel durante toda la noche en una solución de ácido acético al 7 % y etanol al 10 %. Una vez establecida la calidad de la muestra proteica, al día siguiente se inicia el procedimiento de etiquetado SD. Primero mida el pH del lisado, que debe ser básico o neutro.

El pH óptimo es 8,6 para las reacciones subsecuentes. A continuación, prepare las reacciones de conjugación con el colorante para cada muestra proteica. Mezcle 50 microgramos con 400 picomoles del colorante S3 y 50 microgramos con 400 picomoles del colorante S cinco.

Realice esto en cuadruplicado para un total de ocho reacciones de acoplamiento D por muestra. Para cada muestra analizada, prepare un conjunto complementario de reacciones de acoplamiento DI utilizando proteína del control, como la proveniente de un cerebro enfermo. Luego, para cada par de reacciones, establezca una reacción de control interno con 400 picomoles de CY dos y una representación equitativa de todas las proteínas que sumen un total de 250 microgramos.

La marcación SAI se logra incubando todas las mezclas de reacción a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante una hora. Después de la incubación, combine todos los conjuntos de tres reacciones cian diferentes en volúmenes de 150 microlitros a cada conjunto de reacciones agregando 200 microlitros de tampón 2D. Luego, continúe con los pasos de electroforesis en 2D.

Comience preparando soluciones de proteína sin etiquetar para el gel preparativo del cual se excavarán manchas de proteína para cada muestra y para el control positivo. Aliquote de 300 a 350 microgramos de proteína sin etiquetar en tampón 2D y permita que se rehidraten en contacto con la tira IPG. A continuación, cargue las tiras IPG y transfiera la proteína etiquetada y la no etiquetada a una rehidratación.

Luego, cubra cada pocillo con una tira de reacción IPG. A continuación, agregue una capa de aceite mineral y permita que las tiras se rehidraten pasivamente con la solución de proteínas durante la noche a no más de 25 grados Celsius. Al día siguiente, realice el enfoque isoeléctrico de las tiras IPG.

Luego retire el aceite y almacene las tiras IPG a menos 20 grados Celsius para equilibrarlas. Sumerja las tiras en tampón de equilibración durante 15 minutos. A continuación, transfiera las tiras a acetamida al 4,7 %IDO en tampón de equilibración, sin DTT, mientras se sumergen las tiras.

Utilice un sistema de gel 2D grande para verter cuatro geles de página SDS al 12 % por muestra en placas de vidrio de baja fluorescencia para las proteínas marcadas. También vierta un gel de página SDS al 12 % en placas de vidrio estándar de 1,5 milímetros de espesor para cada una de las proteínas no marcadas. Estos son los geles preparativos.

Una vez enfriados los geles, transfiera las tiras a la parte superior de los geles y cúbralas con 0,5 % de Aros; tras enfriarlas, corra los geles a 2,5 vatios a cuatro grados Celsius durante la noche y analícelos al día siguiente. Muchas reacciones bidimensionales pueden realizarse con muestras de proteínas utilizadas para los geles preparativos. Mida menos de 100 microgramos de muestra en 200 microlitros de tampón bidimensional.

Luego, agite vigorosamente las mezclas de muestra y realice una centrifugación rápida. Cargue las muestras en tiras IPG de 11 centímetros y permita su rehidratación pasiva durante la noche, cubiertas con aceite mineral, al día siguiente. Realice el enfoque isoeléctrico.

Luego pase las tiras a través de tres baños de tampón de equilibración durante 15 minutos por baño. A continuación, se realizan corridas de las tiras en geles de electroforesis SDS-PAGE 2D. Coloque cada tira sobre un gel precargado del peso molecular adecuado.

Poliacrilamida para la proteína de interés. Posteriormente, transfiera los geles a una membrana de nitrocelulosa o PVDF y analícelos con anticuerpos en el desarrollo de este protocolo. Tres lisis diferentes.

Se probaron los tampones. En primer lugar, se probó un tampón común de bioquímica y biología molecular: Tris SDS.

El Tris SDS presentó una resolución deficiente en comparación con otro tampón evaluado, el UTS. El tercer tampón fue descartado, ya que no fue posible preparar muestras analizables con él. A continuación, se investigaron los proteomas cerebral humano y murino.

Se compararon muestras de cortex control humano y muestras de cortex AD. También se analizaron proteínas cerebrales de ratones con patología de tau similar a la AD a partir de la muestra humana. SCI dos se analizó de forma independiente, al igual que S SI tres y sci cinco para cada D. La alta resolución del punto facilitó el alineamiento.

Se utilizó un análisis cualitativo mini 2D para investigar las modificaciones postraduccionales y se encontró que la alfa-sinucleína en el tejido adiposo presentaba un perfil normal, pero también se detectó como un dímero marcado con un asterisco. Las flechas indican los lugares donde se encontró la alfa-sinucleína. La proteína precursora de amiloide ubiquitinada también fue observada mediante el análisis mini 2D.

Se comparó el alzhéimer esporádico con el alzhéimer familiar. En el alzhéimer familiar, la beta amiloide 1-42 y la variación ISO presentan concentraciones más bajas porque se encontraron formas ligadas a ocho kilodaltons. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar el proteoma para comparar muestras complejas mediante la medición de modificaciones en la expresión proteica.