La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting
April 10th, 2014
Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.
El objetivo general del siguiente experimento es extraer proteínas de tejido cerebral humano y de ratón para su análisis proteómico. Esto se logra mediante el uso de un tampón de lisis común para obtener la misma extracción de proteínas adaptada para enfoques de electroforesis bidimensional. A continuación, la electroforesis en gel de diferencia de fluorescencia bidimensional se utiliza para separar proteínas para la identificación por espectrometría de masas.
A continuación, se realiza una electroforesis en gel 2D en miniatura con inmunotransferencia para identificar las modificaciones postraduccionales. Los resultados pueden mostrar la expresión global de proteínas. El huésped cambia la traducción de todos los productos de ligamentización y catalíticos en función de las diferencias en el punto isoeléctrico y el peso molecular.
La combinación de 2D dash y 2D monolo puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la neuroproteómica al proporcionar simultáneamente información sobre los cambios en la expresión. Modificación postal y catabolismo en los productos Comienza con la recolección y homogeneización del tejido cerebral. Prepare el tejido al 10% de peso a volumen en tampón de extracción para tejido cerebral humano.
Homogeneice el tejido con una pipeta de vidrio, sin embargo, use un homogeneizador de teflón para que el tejido de roedores se desintegre ya sea homogeneizado. Sonicarlo a 60 hercios usando 30 pulsos de medio segundo. A continuación, determine la concentración de proteínas con un ensayo de Bradford utilizando BSA como estándar.
Ahora reúna las soluciones para la precipitación de metanol con cloroformo en un cubo de hielo. Planee recolectar alrededor de 125 microgramos para las tiras de IPG de 11 centímetros o alrededor de 1.25 miligramos para las tiras de IPG de 18 centímetros. Una vez que las soluciones estén a cuatro grados centígrados, realice la precipitación completamente sobre hielo.
Primero, agregue tres volúmenes de metanol, luego uno de cloroformo. Agita esta mezcla. A continuación, añade tres volúmenes de agua fría.
Vortex, esta mezcla centrifuga durante un minuto el tubo de muestra a 12.000 Gs durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Aspirar y desechar el sobrenadante. A continuación, añada tres volúmenes de vórtice de metanol y reduzca las proteínas de la misma manera.
Seque la pelletza de proteína recolectada bajo gas nitrógeno antes de DIGE 2D. Vuelva a suspender la proteína en tampón 2D a 2,5 miligramos por mililitro. A continuación, sonique las muestras como se ha hecho antes hasta que se utilicen.
Guárdelos a menos 80 grados centígrados antes de comenzar este paso y después de la precipitación de proteínas. Es necesario determinar la concentración de proteína una vez más mediante el ensayo de Bradford. Siguiendo el mismo procedimiento que se muestra anteriormente antes de etiquetar el tinte psy.
La calidad de la muestra de proteína se verifica mediante la página SDS para ese propósito. Diluir 15 microgramos de proteína en LDS y hacerlo a 37 grados centígrados en un baño de calor o en bloque. A continuación, ejecútelos en un gel de poliacrilamida y tiña el gel con una solución de azul de kumasi durante al menos una hora.
A continuación, mantenga el gel durante la noche en una solución de ácido acético al 7% y etanol al 10%. Una vez establecida la calidad de la muestra de proteína, al día siguiente se inicia el procedimiento de etiquetado SD. Primero mida el pH del lisado, que debe ser básico a neutro.
El pH óptimo es de 8,6 para reacciones posteriores. A continuación, configure las reacciones de conjugación de colorantes para cada muestra de proteína. Mezcle 50 microgramos con 400 picomoles de colorante S3 y 50 microgramos con 400 picomoles de colorante S 5.
Haga esto en cuádruple para un total de ocho reacciones de acoplamiento D por muestra. Para cada muestra analizada, haga un conjunto complementario de reacciones de acoplamiento de DI utilizando proteínas del control, como las de un cerebro enfermo. Luego, para cada par de reacciones, configure una reacción de control interno con 400 picomoles de CY dos y una representación uniforme de todas las proteínas con un total de 250 microgramos.
El marcaje SAI se logra incubando todas las mezclas de reacción a cuatro grados centígrados en la oscuridad durante una hora. Después de la incubación, combine todos los conjuntos de tres reacciones cian diferentes en volúmenes de 150 microlitros para cada conjunto de reacciones a 200 microlitros de tampón 2D. A continuación, proceda con los pasos de electroforesis 2D.
Comience con la preparación de soluciones de proteínas no marcadas para el gel preparatorio del que se extirparán las manchas de proteínas para cada muestra y para el control positivo. Alicuone de 300 a 350 microgramos de proteína sin marcar en tampón 2D y permita que se rehidraten en contacto con la tira de IPG. A continuación, cargue las tiras de IPG, transfiera la proteína marcada y la no marcada a una rehidratación.
Bueno, luego cubra cada pocillo con una tira de reacción IPG. Siga esto con una capa de aceite mineral y deje que las tiras se rehidraten pasivamente con la solución de proteínas durante la noche a no más de 25 grados centígrados. Al día siguiente, realice el enfoque isoeléctrico de las tiras de IPG.
A continuación, retire el aceite y guarde las tiras de IPG a menos 20 grados centígrados para equilibrar las tiras de IPG. Sumérjalos en un tampón de equilibrio durante 15 minutos. A continuación, transfiera las tiras a acetamida al 4,7% de IDO en tampón de equilibrio, sin DTT mientras baña las tiras.
Utilice un gran sistema de gel 2D para verter cuatro geles de página SDS del 12 % por muestra en placas de vidrio de baja fluorescencia para las proteínas marcadas. Vierta también un gel de página al 12%SDS en placas de vidrio estándar de 1,5 milímetros de grosor para cada una de las proteínas no marcadas. Estos son los geles preparativos.
Cuando los geles se enfríen, transfiera las tiras a la parte superior de los geles y superponga las tiras con 0,5%Aros una vez enfriadas, haga funcionar los geles a 2,5 vatios a cuatro grados centígrados durante la noche y analícelos al día siguiente. Muchas reacciones 2D se pueden llevar a cabo con muestras de proteínas utilizadas para los geles preparativos. Mida menos de 100 microgramos de muestra en 200 microlitros de tampón 2D.
A continuación, agita las mezclas de muestras vigorosamente y dales un giro rápido. Cargue las muestras en tiras de IPG de 11 centímetros y deje que se rehidraten pasivamente durante la noche cubiertas de aceite mineral al día siguiente. Realice el enfoque isoeléctrico.
A continuación, mueva las tiras a través de tres baños de tampón de equilibrio durante 15 minutos por baño. A continuación, las tiras se ejecutan en geles de página SDS 2D. Coloque cada tira en capas sobre un gel prefabricado del peso molecular adecuado.
Poliacrilamida para la proteína de interés. Posteriormente, transferir los geles a la membrana de PVDF de NITROCELULOSA y analizarlos con anticuerpos en el desarrollo de este protocolo. Tres lisis diferentes.
Se probaron los tampones. En primer lugar, un tampón común de bioquímica y biología molecular. Se probó Tris SDS.
Tris SDS tenía una resolución deficiente en comparación con otro UTS de búfer probado. Se descartó el tercer tampón para de ya que no se pudieron preparar muestras analizables con él. A continuación, se investigaron los proteomas cerebrales de humanos y ratones.
Se compararon muestras de corteza de control humano y muestras de corteza ad. También se observaron proteínas cerebrales de ratones con enfermedad de Alzheimer como la tau a partir de la muestra humana. La SCI dos se observó de forma independiente, al igual que S, SI tres y la SCI cinco para cada D. La alta resolución puntual facilitó la alineación.
Se utilizó un análisis cualitativo mini 2D para investigar las modificaciones postraduccionales y se encontró que una ligamentización de alfa sinucleína en el tejido AD tenía un perfil normal, pero también se encontró como un dímero marcado con un asterisco. Las flechas marcaban el lugar donde se encontró la alfa sinucleína. La proteína precursora de amiloide ubiquitinada también se observó en mini 2D.
Se comparó el anuncio esporádico con el familiar. En la varianza familiar ad beta amiloide de uno a 42 y la varianza ISO son menores en concentración porque se encontraron formas de liga a ocho kilodaltons. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar el proteoma para comparar muestras complejas midiendo las modificaciones de la expresión de proteínas.
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Visión general
Este estudio se centra en la extracción de proteínas del tejido cerebral humano y de ratón utilizando un tampón de lisis común para el análisis proteómico. El método permite la identificación y caracterización de proteínas mediante técnicas avanzadas de electroforesis.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Proteómica
- Neurociencia
- Bioquímica
Antecedentes
- La extracción de proteínas es crucial para comprender la función cerebral.
- Las técnicas de electroforesis bidimensional mejoran la separación de proteínas.
- Las modificaciones postraduccionales pueden afectar significativamente la función de las proteínas.
- Se necesitan métodos confiables para obtener resultados reproducibles en biopsias y modelos.
Propósito del estudio
- Extraer proteínas de tejidos cerebrales para su análisis.
- Utilizar electroforesis de gel de diferencia de fluorescencia bidimensional.
- Identificar modificaciones postraduccionales mediante inmunoblot.
Métodos utilizados
- Extracción de proteínas usando tampón de urea/tiourea/SDS.
- Electroforesis de gel de diferencia de fluorescencia bidimensional (2D-DIGE).
- Electroforesis de gel bidimensional miniatura para inmunoblot.
- Espectrometría de masas para la identificación de proteínas.
Resultados principales
- Extracción exitosa de proteínas de tejidos cerebrales humanos y de ratón.
- Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas.
- Caracterización de modificaciones postraduccionales.
- Mejora de la reproducibilidad de los resultados de biopsias y modelos.
Conclusiones
- El método proporciona resultados confiables para el análisis proteómico.
- Facilita el estudio de la expresión y modificaciones de proteínas.
- Este enfoque puede aplicarse a varios estudios neurológicos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
