Mapeo de interacciones proteína-proteína disfuncionales en la enfermedad

Nuestro trabajo mapea las interacciones disfuncionales proteína-proteína directamente de las células y tejidos nativos, revelando cómo la enfermedad reconfigura las redes celulares. A diferencia de la mayoría de los métodos interatómicos, el dfPPI no requiere ingeniería genética ni habilidades para las cohortes de pacientes, utilizando una captura multiplex por muestra. Para empezar, prepara un tampón de extracción de proteínas que contiene 20 milimolares Tris, 20 milimolares cloruro de potasio, 5 milimolares cloruro de magnesio y 0,01% Nb-40.

Añade inhibidores de proteasa y fosfatasa justo antes de usarlos y mantén el tampón en hielo. Coloca la muestra de tejido congelado en un tubo microhomogeneizador de tejido equipado con un manodero. Añade entre 500 y 700 microlitros del tampón nativo de lisis, ajustando el volumen según la compacidad del tejido y la facilidad de homogeneización.

Luego, homogeneiza la muestra sobre hielo moviendo suavemente el mortero arriba y abajo y contra las paredes abrasivas hasta lograr una suspensión uniforme. Incuba los lisados a 4 grados Celsius durante 30 minutos colocando el vial sobre una unidad de rotación. Mezcla suavemente las muestras durante la incubación mediante la rotación.

Utilizando una centrífuga de mesa, centrifugar las muestras a 13.000 g durante 10 minutos a 4 grados Celsius para eliminar los restos celulares. Recoge cuidadosamente los sobrenacionantes y transfiere a tubos de microcentrífuga transparentes de 1,5 mililitros. Determina la concentración total de proteínas en el sobrenadante usando el Kit de Ensayo BCA según las instrucciones del fabricante.

A continuación, toma una cuota de perlas de poliuretano directamente del material de isopropanol. Deja que las cuentas se asienten para eliminar el disolvente de almacenamiento. Aspira cuidadosamente el isopropanol, luego añade un tampón de lisis nativo y vuelve a suspender completamente las perlas mediante un pipeteo suave o inversión.

Para lavar y equilibrar las perlas, haz un vórtice en el tubo y luego centrifugarlo. Después, aspira el sobrenadante con una línea de vacío equipada con una punta de pipeta, teniendo cuidado de no molestar el pellet. Añade buffer de unión a las cuentas lavadas en una proporción igual para crear una suspensión uniforme de cuentas de trabajo.

40 microlitros de perlas de poliuretano se escurren en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, utilizando una punta de pipeta cortada para una dispensación suave. Luego, lava las perlas tres veces con tampón de lisis nativo añadiendo 1 mililitro de tampón a cada tubo. Haz un vórtice en el tubo para volver a suspender las bolas, luego centrifuga a 10.000 G durante 1 minuto y descarta el sobrenadante por aspiración.

Tras el lavado final, retira la mayor parte del líquido restante de los tubos, asegurándote de que la perla no se altere. Añadir los extractos proteicos normalizados a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contienen 40 microlitros de suspensión de perlas de control. Ajusta el volumen final a 250 microlitros añadiendo la cantidad adecuada de búfer nativo de lisis.

Incubar las muestras a 4 grados Celsius durante 30 minutos con la rotación de un rotador extremo sobre extremo que funciona a 10-15 revoluciones por minuto. Centrifugar los tubos a 10.000 g durante 1 minuto a 4 grados Celsius para pelletar las perlas de control junto con proteínas agregadas o insolubles. Recoge cuidadosamente el sobrenadante de las perlas de control usando una pipeta de 1 mililitro y transfiere a tubos frescos de 1,5 mililitros que contienen 40 microlitros de suspensión de perlas de poliuretano lavado.

Incubar las muestras a 4 grados Celsius durante 3 horas con rotación en un rotador de extremo a extremo. Tras centrifugar cuidadosamente los tubos, aspira el sobrenadante y lava las perlas cuatro veces, como se ha demostrado antes. Elimina cualquier PBS residual del tubo.

Resuspende las perlas lavadas en 80 microlitros de urea de 2 molares recién preparada en bicarbonato de amonio de 50 milimolares a pH 8,5 mediante pipeteo o vórtice breve. Luego, se añade ditiotreitol para lograr una concentración final de 1 milimolar. Después de tapar el tubo, incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación a 1.100 revoluciones por minuto en un agitador orbital calentado.

Añade iodoacetamida para alcanzar una concentración final de 3,67 milimolar. Incuba los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 minutos agitando a 1.100 revoluciones por minuto. Ahora, añade ditiotreitol adicional para eliminar cualquier yodoacetamida no reaccionada, asegurando una concentración final de 3,67 milimolares y mezcla suavemente pipeteando.

Añadir 750 nanogramos de 0,5 miligramos por mililitro de proteasa Lys-C de grado espectrometría de masas a la muestra. Incuba la mezcla a 37 grados Celsius durante 1 hora agitando a 1.150 revoluciones por minuto. A continuación, añade 750 nanogramos de tripsin de secuenciación de 0,5 miligramos recién preparados a la muestra.

Incuba la mezcla durante la noche a 37 grados Celsius con agitación a 1.150 revoluciones por minuto. Al día siguiente, centrifugar la muestra a 1.000-5.000 G durante 1-5 minutos a temperatura ambiente. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante a un tubo microcentrífugo nuevo de 1,5 mililitros usando una pipeta, y desecha las cuentas.

Ajusta el pH del digerido por debajo de 3 añadiendo un 50% de ácido trifluoroacético gota a gota. Verifica el pH usando tiras indicadoras. Las perlas de PU capturaron fuertemente HSP90, HSC70 y proteínas calientes del lisado alto del epichaperoma, con una señal mínima del lisado bajo del epichaperoma, confirmando la especificidad biológica de la sonda.

El perfil de carga de la perla de PU mostró una señal rica y de alto peso molecular en el carril de las perlas de PU y un fondo mínimo en el carril de las perlas de control, confirmando una actividad de sonda exitosa. Los geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie mostraron una distribución consistente de bandas en cuatro muestras procesadas en gel, confirmando el enriquecimiento exitoso de complejos proteicos de lisados nativos antes de la espectrometría de masas. La reproducibilidad técnica se confirmó mediante análisis de componentes principales, donde las muestras replicadas agrupaban de forma muy compacta mientras que diferentes muestras se separaban limpiamente.

Las distribuciones de intensidad de iones precursores mostraron que la mayoría de las características tenían coeficientes de variación inferiores al 20%, con valores medianos entre el 9,7% y el 11,9% entre muestras, confirmando una detección y recuperación consistente de péptidos. El agrupamiento jerárquico de abundancias de proteínas transformadas en logarítmic reveló una fuerte separación de muestras y preservó la variación entre muestras, con intensidades proteicas que iban desde baja abundancia hasta proteínas altamente enriquecidas. El análisis de enriquecimiento de vías demostró una amplia cobertura de anotaciones en múltiples ontologías, incluyendo categorías de ontologías génicas y bases de datos seleccionadas, como Reactome, KEGG y WikiPathways.

dfPPI nos permitió descubrir conocimientos mecanicistas y terapéuticos que otros enfoques simplemente no pueden alcanzar. El dfPPI lleva la interómica al nivel de cohortes de enfermedades reales y de las condiciones nativas, permitiendo hipótesis mecanicistas y terapéuticas precisas. Ahora estamos ampliando el dfPPI para mapear los cambios a nivel de red en enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer y el Parkinson.