Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Este método describe un enfoque robusto y reproducible para la comparación de los niveles de proteína en distintos tejidos y en diferentes puntos de tiempo del desarrollo usando un enfoque Blot western cuantitativo estandarizado.

Este protocolo se puede utilizar para abordar cuestiones importantes en la investigación fundamental y clínica mirando la expresión de proteínas a través de diferentes tejidos y puntos de tiempo. Para realizar una hinchazón occidental cuantitativa fiable, combinamos una mancha de proteína total fluorescente con un control de carga interno. Esto supera las limitaciones que surgen al comparar varios tejidos a través de condiciones experimentales.

Para extraer proteínas de muestras de células o tejidos congelados, descongele las muestras de menos 80 grados sobre hielo antes de lavar las muestras según corresponda, según la tabla. Usando un homogeneizador eléctrico de mano con un pestillo de polipropileno, homogeneizar las muestras lavadas, enjuagando el pestle en agua de doble destilación y secándose con un tejido limpio entre las muestras. Deje las muestras sobre hielo durante 10 minutos, seguidas de centrifugación.

A continuación, transfiera el sobrenadante que contiene la muestra de proteína a un nuevo tubo sobre hielo sin alterar el pellet. Para la cuantificación de la concentración de proteínas, establezca estándares de albúmina sérica bovina en concentraciones crecientes en triplicado y agregue un microlitro de cada muestra de proteína por duplicado a los pozos apropiados de una placa óptica de 96 pozos. Incubar la proteína en un bloque de calor de 60 grados Celsius durante 10 minutos o más si se espera que la concentración de proteína sea baja y mida la absorción a 560 nanómetros en un lector de placas.

Exporte las mediciones del lector de placas y calcule la concentración de proteínas comparando los valores medios de absorbancia de cada muestra con una curva estándar obtenida utilizando el estándar de proteínas. Para normalizar la cantidad de proteína, prepare diluciones de las muestras de proteínas en el tampón de la muestra y agua ultrapura e incubar las muestras en un bloque de calor de 70 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, coloque las muestras sobre hielo antes de vórtices y centrifugar brevemente.

Para la electroforesis, configure un gel prefabricado de cuatro a 12%Bis-Tris en el sistema de cámara de electroforesis de gel y cargue 3,5 microlitros de un estándar de proteína en el pozo. Cuando utilice un estándar interno para la normalización entre membranas, cargue una cantidad que sea igual a las otras muestras en los tres primeros pozos junto a la escalera de proteínas y cargue 30 microgramos de cada muestra en los pozos restantes. A continuación, ejecute las muestras a través del gel de apilamiento a 80 voltios durante 10 minutos seguido de 150 voltios durante 45 a 60 minutos adicionales.

Al final de la electroforesis, para ensamblar la pila de transferencia, coloque el gel proteico en la pila inferior que contiene la membrana de difluoruro de polivinilideno seguida del papel de filtro. Utilice el rodillo de hinchazón para eliminar cualquier burbuja de aire y coloque la pila superior en la parte superior del papel del filtro antes de enrollar la pila de nuevo para eliminar las burbujas de aire. Transfiera toda la pila al dispositivo de transferencia con el electrodo en el lado izquierdo del dispositivo y coloque la esponja de gel en la parte superior de la pila para que la esponja esté alineada con los contactos eléctricos correspondientes en el dispositivo.

Después de cerrar la tapa, seleccione e inicie el programa adecuado. Al final del programa, corte la membrana al tamaño del gel y lave la membrana cortada rápidamente con agua doble destilada antes de continuar con la mancha total de proteínas. Para la tinción total de proteínas, enrolle la membrana en un tubo de 50 mililitros con el lado de la proteína orientado hacia adentro y etiquete la membrana con cinco mililitros de solución de manchas de proteína en un rodillo durante cinco minutos a temperatura ambiente en una campana de humo.

Al final de la incubación, lavar la membrana rápidamente con cinco mililitros de solución de lavado, devolviendo el tubo brevemente al rodillo entre lavados, seguido de un breve enjuague con agua ultrapura. Añadir tres mililitros de tampón de bloqueo a la membrana y devolver la membrana al rodillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Sustituya el tampón de bloqueo por el anticuerpo primario de interés en la concentración optimizada adecuada e incubar la membrana en el rodillo durante la noche a cuatro grados centígrados.

Al día siguiente, lave la membrana seis veces durante cinco minutos con cinco mililitros de PBS fresco por lavado en el rodillo a temperatura ambiente. Después del último lavado, incubar la membrana con la solución de anticuerpos secundaria adecuada en el rodillo durante una hora a temperatura ambiente seguida de tres lavados durante 30 minutos por lavado. Después del último lavado, seque la membrana y utilice papel de aluminio para mantener la membrana protegida de la luz.

Para la adquisición de imágenes, coloque la membrana en el escáner con el lado de la proteína hacia abajo y seleccione el área de escaneo en el software. A continuación, adquiera imágenes en ambos canales y exporte las imágenes a un programa de análisis de imágenes adecuado. Muestre el canal de 700 nanómetros para mostrar el resultado total de la tinción de proteínas y Seleccione Análisis y Dibujar rectángulo para definir el área de interés para la normalización.

A continuación, copie y pegue el primer área del rectángulo en cada muestra individual para asegurarse de que la región definida tiene el mismo tamaño para todos los carriles analizados. Para cuantificar la concentración de proteínas en cada carril, copie los resultados tanto de la mancha total de proteínas como de la proteína de interés en un programa de hoja de cálculo y determine la señal de tinción de proteína total más alta. A continuación, divida cada valor total de la señal de tinción de proteína por este valor para obtener el valor de carga de proteínas normalizada y divida el valor de señal de 800 nanómetros de cada muestra individual por su valor de proteína normalizado correspondiente para calcular la relación de expresión de proteína relativa en diferentes muestras.

En estas manchas occidentales representativas, las proteínas extraídas de los tejidos obtenidos del día postnatal cinco ratones se comparan con las proteínas extraídas de ratones adultos de 10 semanas de edad. La cuantificación de la intensidad de fluorescencia de la mancha de proteína total se logró midiendo la intensidad de fluorescencia dentro de la caja rectangular en cada carril. Cuando se analizan carriles enteros, la intensidad de fluorescencia permanece relativamente similar en todas las muestras, lo que indica que el uso de la mancha de proteína total para la normalización es adecuado para este propósito.

La mancha de proteína total fluorescente también se puede utilizar para comparar los niveles de proteína en diferentes puntos de tiempo de desarrollo. Por ejemplo, aunque los niveles de proteína de neurona motora de supervivencia disminuyen claramente con la edad en ratones, la cuantificación total de la mancha de proteína permanece constante. El uso de normas internas, normalización basada en fluorescencia y estadísticas adecuadas aumenta la robustez del análisis complejo de la expresión de proteínas en diferentes condiciones.

Este protocolo se suma a las técnicas tradicionales de Western blot, superando los problemas de los controles de carga y comparaciones adecuados entre lotes experimentales, y proporcionando flexibilidades para el análisis de la expresión de proteínas. Este enfoque se puede ampliar a la comparación de la expresión de proteínas en otras condiciones experimentales.